乳品微生物检验实验技能培训乳品微生物检验实验技能培训无菌室的使用与管理无菌室的使用与管理n保持清洁整齐n每2-3周用消毒液擦拭工作台等n定期检查室内空气无菌状况n无菌室杀菌前，应将所有物品置于操作部位，然后打开紫外灯杀菌30分钟。n进入无菌室前，必须咋缓冲间更换消毒过的工作服、工作帽和工鞋。n操作应严格按着无菌操作规定进行。灭菌方法灭菌方法n高压蒸汽灭菌n火焰灭菌n高温干燥灭菌n一般消毒n空气的消毒无菌操作要领无菌操作要领n进行无菌室空间的消毒n检验用的有关器材，搬入无菌室之间必须分别进行灭菌消毒n操作人员必须将手清洗消毒，穿戴好无菌工作衣、帽和鞋才能进入n进入无菌室后再消毒手部，然后才能进行检验操作。无菌操作注意事项无菌操作注意事项n动作要轻、不能太快n操作应在近火焰区进行n接种环、针等金属器材使用前后均需灼烧，灼烧时先通过内焰n使用吸管时，切勿用嘴直接吸吹n打开平板时，务必靠近火焰区操作n进行可疑菌涂片是，应使用夹子n工作结束，收拾好工作台，最后用消毒液擦拭细菌和真菌的比较：细菌和真菌的比较：项目 形态特点体积大小结构特点生殖方式营养方式细菌 球形杆形螺旋形十分微小单细胞个体，原核生物分裂生殖异养自养真菌 丝状多细胞有机体个体差异大，有大型细胞由菌丝构成的多细胞个体，真核细胞孢子生殖，出芽生殖异养（寄生和腐生）细菌细胞的结构与功能细菌细胞的结构与功能n细菌细胞结构包括基本结构和特殊结构n基本结构式各种细菌共有的，如细胞壁n特殊结构只有某些细菌具有，如芽孢细菌的结构特点细菌的结构特点 细菌细胞结构示意图细菌细胞结构示意图细菌的繁殖与生长细菌的繁殖与生长细菌生长曲线： 1,2.延迟期；3.对数期；4,5.稳定期；6.衰亡期球菌球菌杆菌杆菌螺旋菌螺旋菌细菌的分类细菌的分类双球菌双球菌链球菌链球菌双球菌双球菌四联球菌四联球菌常见球菌葡萄球菌葡萄球菌球菌球菌常见杆菌常见杆菌普通杆菌芽孢杆菌双歧杆菌杆菌杆菌芽孢芽孢某些细菌在其生长发某些细菌在其生长发育后期育后期,可在细胞内形可在细胞内形成壁厚、质浓、折光成壁厚、质浓、折光性强并抗不良环境条性强并抗不良环境条件的休眠体件的休眠体,称为芽孢。称为芽孢。每一细胞仅形成每一细胞仅形成1个个芽孢，无繁殖功能，芽孢，无繁殖功能，称做休眠体而不能称称做休眠体而不能称做繁殖体。做繁殖体。是细菌种是细菌种的特性，决定于该菌的特性，决定于该菌遗传性，受形成芽孢遗传性，受形成芽孢基因的控制基因的控制 .芽孢是某些细菌的休眠体芽孢是某些细菌的休眠体n圆形或椭圆形，壁厚抗逆性强，含水少n在休眠期间不能检测出任何代谢活力n产芽孢细菌的种类n芽孢的构造n芽孢的形成于芽孢的萌发n芽孢的耐热机制n研究芽孢的意义芽孢的特性n芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物、抗静水压、惊人的休眠能力等。n肉毒梭菌芽孢，1005.09.5h；12110min；n热解糖梭菌营养细胞，50短时间；芽孢1324.4min杀死90%。n芽孢的抗紫外线能力，要比其营养的细胞强约1倍。巨大芽孢杆菌芽孢的抗辐射能力要比E.coli的营养细胞强36倍。芽孢的休眠能力十分惊人n休眠期间，无任何代谢活力。普通条件下可保存几年至几十年的活力。从德国的一个植物标本上分离到保存了200300年的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；凝结芽孢杆菌和环状芽孢杆菌的芽孢保存了50100年之久。有些湖底沉积土中的芽孢杆菌经5001000年后仍有活力，更有经2000年甚至更长时间仍保持芽孢生命力的记载。最极端的一个例子是在美国的一块有2500万4000万年历史的琥珀，至今从其中蜜蜂肠道中还可以分离到有生命力的芽孢。产生芽孢的细菌种类n主要是芽孢杆菌科（G+菌）两个属，即好氧性的芽孢杆菌属和厌氧性的梭菌属。n球菌只有芽孢尿八叠球菌属形成芽孢。n典型的螺旋菌中，至今未发现产芽孢菌。芽孢形成n当环境中营养缺乏及有害代谢产物累积时，开始形成芽孢。n有些种在正常生长过程中，形成芽孢。n从形态上来看，芽孢形成可分7个阶段：束状染色质形成；细胞膜内陷，细胞发生不对称分裂，其中小体积部分即为前芽孢 ；前芽孢的双层隔壁形成，这时抗辐射性提高；在上述两层隔壁间充填芽孢肽聚糖，合成DPA，累积钙离子，开始形成皮层，折光率增高；芽孢衣合成结束；皮层合成完成，芽孢成熟，抗热性出现；芽孢囊裂解，芽孢游离。芽孢萌发n由休眠状态的芽孢变成营养状态的细菌的过程，称为芽孢萌发。主要分为活化、出芽、生长。n活化（萌动）：可由短期加热、低PH值、还原剂、萌发剂等处理而引起，例如，有的芽孢休眠七天后605分钟即可变为营养体。 L-丙氨酸、MN2、表面活性剂（N-十二烷胺）和葡萄糖等可促进发芽，D-丙氨酸和重碳酸钠等可抑制某些芽孢发芽。注意：活化作用是可逆的。故活化处理以后必须立即将它接种到合适的培养基上。 芽孢萌发n发芽：芽孢衣中富含半胱氨酸的蛋白质的三维空间结构发生可逆变化，芽孢透性增加，促进与发芽有关的蛋白酶活动。接着，芽孢衣上的蛋白质逐步水解，外界阳离子不断进入皮层，随之皮层发生膨胀、溶解和消失。外界水分不断进入核心部分，使核心膨胀、各种酶类活化，并开始合成细胞壁。核心部分开始迅速合成DNA、RNA和蛋白质。从极向或侧向伸出芽管。芽孢发芽，变成营养细胞。n芽孢发芽时，它的细胞壁还是很薄和不完整的，增加了接受外来DNA，发生遗传转化的可能性很大；同时，抗性明显下降，是灭菌的好时机。芽孢抗热机制：渗透调节皮层膨胀学说n芽孢衣对多价阳离子和水分的透性差；n皮层含有大量的交联度低（-6%）、负电荷强的芽孢肽聚糖，与低价阳离子一起引起皮层的高渗透压，夺取核心水分，造成皮层含水量增加（70%左右），体积增大，充分膨胀；核心部分的生命物质形成高度失水状态，各层次尤其是皮层与核心间，含水量的差别很大，产生极强的耐热性。n有人认为，芽孢含大量DPA-Ca，Ca2+ 与DPA的螯合作用会使芽孢中的生物大分子形成一种耐热性的凝胶。研究芽孢的意义研究芽孢的意义n细菌鉴定的一项重要形态学指标。n有利于对这类菌种的筛选和保藏。n衡量各种消毒灭菌措施的主要指标。n外科器材灭菌，以破伤风梭菌和产气荚膜梭菌的芽孢为指标，121 10min或11530mim。实验室、发酵工业，以自然界存在的耐热性最强的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢为标准，12115min。肉类罐头（非酸性）12120min以上（2070）杀死肉毒梭菌芽孢为标准。革兰氏染色法革兰氏染色法n革兰氏染色法事1884年丹麦病理学家Christain Gram发明的一种细菌鉴别方法，也是细菌学中最常用最重要的一种鉴别染色法，过程如下：n细菌涂片 草酸铵结晶紫初染 碘液媒染 乙醇或丙酮脱色 番红复染 褪色菌成红色G-不褪色菌成紫色G+革兰氏染色法n-初染、媒染、脱色、复染。n细菌经结晶紫溶液初染后，染上紫色；经碘液媒染，结晶紫与碘分子形成一个分子量较大的染色较牢固的复合物；用95乙醇脱色，如紫色被洗脱，成为无色菌体，反之，仍为紫色；用红色染料番红复染，脱掉紫色的被复染而显红色，未脱掉紫色的仍显紫色。关键是脱色时间。n紫色菌称革兰氏阳性菌，简称G+菌；红色菌称革兰氏阴性菌，简称G-菌。革兰氏染色的物理机制革兰氏染色的物理机制 n通过初染和媒染，在膜或原生质体上染上不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。nG+菌细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，再加上G+菌的壁基本不含类脂，乙醇不能在壁上溶出缝隙。所以，结晶紫与碘复合物被阻留在细胞壁内，呈现紫色。复染为紫中带红。nG-性细菌壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，遇到乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，而且类脂含量高，当乙醇把类脂溶解后，壁上出现较大缝隙，复合物极易溶出细胞壁。细胞无色。复染，呈现出新的颜色红色。 细胞壁细胞壁 含有特殊的肽聚糖含有特殊的肽聚糖革兰氏阳性细胞：革兰氏阳性细胞： 革兰氏阴性细胞：革兰氏阴性细胞： 细胞壁厚、单层细胞壁厚、单层 、含、含 特有的磷壁酸特有的磷壁酸 细胞壁薄、多层细胞壁薄、多层 ，含脂多糖、脂蛋白等，含脂多糖、脂蛋白等美蓝染色法与美兰还原实验美蓝染色法与美兰还原实验n美蓝染色是氯化亚甲蓝盐（MBC）被电离成正、负离子，带正电荷的染料离子可以使细菌细胞呈蓝色。细菌体积小，较透明，如未经染色，常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。n美兰还原实验，是牛奶中的微生物分泌出还原酶使美兰还原褪色，还原反应速度和所存在的细菌数量有关，根据美兰褪色的时间估计牛乳中的细菌总数来评定牛乳的品质。菌落总数菌落总数n菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同菌集合而成。n菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、PH、培养温度和时间等）每克（每ml）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37 48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。菌落总数的测定方法菌落总数的测定方法n菌落总数的测定基本操作方法包括：n样品的稀释n倾倒平皿n培养48小时n计数报告稀释倒平皿分离法稀释倒平皿分离法菌落总数的意义菌落总数的意义n菌落总数测定时用来判定食品被细菌污染的程度的卫生质量指标，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。n菌落总数并不表示所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，有时被称为需氧菌数、杂菌数等。菌落形态菌落形态n菌落形态是指某种微生物在一定培养基上由单个菌体形成的群体形态。每一种微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速。细菌的群体形态细菌的群体形态n由单个或少数同种的细菌细胞在固体培养基表面繁殖出来的肉眼可见的子细胞群体后形成的群体，称菌落。多个菌落融合在一起，称菌苔。在培养液中可能形成混浊、凝絮和液面上的菌膜。 肉眼可观察到细菌聚集的群体菌落、菌苔肉眼可观察到细菌聚集的群体菌落、菌苔平皿划线分离法：A.扇形划线;B.连续划线;C.方格划线细菌菌落形态特征细菌菌落形态特征细菌菌落细菌菌落霉菌菌落形态霉菌菌落形态酵母菌菌落形态酵母菌菌落形态大肠杆菌大肠杆菌n大肠杆菌是人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。n大小0.4-0.7*1-3um，无芽孢n大多数菌株有动力，有普通菌毛与性菌毛n有些菌株有多糖类包膜，G-大肠杆菌电子显微镜扫描图大肠杆菌菌落与革兰氏染色图预防大肠杆菌污染的方法 1、大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，、大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。作基因工程中的运载体。 2、大肠杆菌的代谢类型是异养厌氧型。、大肠杆菌的代谢类型是异养厌氧型。3、人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认、人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。认为是寄生。 4、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。可鉴别大肠杆菌是否存在。 5、大肠杆菌在生物技术中的应用：、大肠杆菌在生物技术中的应用： 大肠杆菌作为外源基因表达的宿大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济,倍倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。系，常做高效表达的首选体系。 6、大肠杆菌在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，、大肠杆菌在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者假如生活在体外则属于分解者