In-Fusion HD Cloning Kit 操作手册操作手册 PT5162-1 (072012) Cat. Nos. Many United States/Canada 800.662.2566 Asia Pacific +1.650.919.7300 Europe +33.(0)1.3904.6880 Japan +81.(0)77.543.6116 Clontech Laboratories, Inc. A Takara Bio Company 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA 94043 Technical Support (US) E-mail: techclontech.com www.clontech.com Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 2 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual 目录目录 I. 简介简介. 3 II. 组分列表组分列表 . 5 III. 需要的其他材料需要的其他材料 . 5 IV. PCR 和实验准备和实验准备 . 6 V. 您应该遵循哪一个操作流程您应该遵循哪一个操作流程? . 9 VI. 操作流程操作流程 I：In-Fusion 克隆流程克隆流程 w/离心柱化离心柱化 . 9 VII. 操作流程操作流程 II：In-Fusion 克隆流程克隆流程 w/Cloning Enhancer 处理处理 . 10 VIII. 转化流程转化流程 . 11 IX. 预期结果预期结果 . 11 X. 疑惑解答指南疑惑解答指南 . 12 XI. 附录附录 A：In-Fusion 克隆克隆快速快速操作流程操作流程 . 14 XII. 附录附录 B：pUC19 Linearized Vector Information . 15 宝日医生物技术（北京）有限公司宝日医生物技术（北京）有限公司 技术支持热线：800 810 6261 电话：010-80720985 微博：http:/weibo.com/clontechchina 邮箱：servicetakarabiomed.com.cn 传真：010-80720989 网址：www.takarabiomed.com.cn Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 3 3 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual I. 简介简介 In-Fusion HD Cloning Kits是一款简便高效的克隆试剂盒，能够将单个或者多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中。In-Fusion克隆技术的基础是Clontech的In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端15 bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。15 bp同源序列是通过扩增目的片段所设计的引物来获得的。升级后的In-Fusion HD Kits的克隆效率高于之前的In-Fusion Kits，尤其表现在长片段、短核苷酸片段和多重片段克隆上。 克隆任意片段到您选择的任意载体中的任意位臵克隆任意片段到您选择的任意载体中的任意位臵 可可有效克隆有效克隆的的片段大小范围片段大小范围非常宽泛非常宽泛 通过通过单次单次反应将反应将多重多重DNA片段片段克隆克隆到任意载体到任意载体中中 无需无需进行进行限制性酶切处理、磷酸化处理或者连接限制性酶切处理、磷酸化处理或者连接反应反应 最最终的重组载体不附加终的重组载体不附加任何冗余或者不需要的碱基序列任何冗余或者不需要的碱基序列 以下列表是 In-Fusion HD Cloning Kits 操作流程总体概述。操作流程会在 Figure 1 做进一步的说明。每一步操作细节请参考详细说明页面。 Table I. In-Fusion HD操作流程概要操作流程概要 步骤步骤 操作操作 页页码码 1 选择载体并识别插入位点。 通过限制性酶切或者反向PCR获得线性化载体并纯化。 6 2 在目的基因PCR引物5端设计一段与线性化载体末端相互补的 15 bp扩展序列。 7-8 3 采用高保真DNA扩增酶扩增目的基因。 琼脂糖凝胶电泳验证扩增后的靶DNA，确定PCR产物的正确性。 9 4 采用离心柱纯化PCR产物或者采用Cloning Enhancer进行处理。 Spin-Column Protocol I (p.9) OR Cloning Enhancer Protocol II (p.10) 5 建立In-Fusion反应体系: 2 l of 5X In-Fusion HD Enzyme Premix X l of Linearized Vector X l of Insert X l of dH2O 至总体积 10 l。混合均匀。 Spin-Column Protocol I (p.9) OR Cloning Enhancer Protocol II (p.10) 6 将反应体系臵于50C孵育15 min，然后臵于冰上。 Spin-Column Protocol I (p.9) OR Cloning Enhancer Protocol II (p.10) 7 从步骤 6 取 2.5 l 反应液转化感受态细胞。 11 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 4 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual I. 简介，简介，续 *如果获得的PCR产物具有非特异性背景，首先通过凝胶抽提分离靶基因片段，然后利用spin-column进行纯化。 Figure 1. In-Fusion HD 操作流程概要操作流程概要 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 5 5 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual II. 组分列表组分列表 In-Fusion HD Cloning Kits有10次，50次和100次规格可供使用。也可以购买附有Stellar Competent Cells、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up、和/或者Cloning Enhancer的试剂盒。 所有组分储存于20C。 In-Fusion HD Cloning Kits 组分组分 Cat.Nos. 639648 639649 639650 Rxns. 10 rxns 50 rxns 100 rxns 5X In-Fusion HD Enzyme Premix 20 l 100 l 200 l pUC19 Control Vector,linearized (50 ng/l) 5 l 15 l 30 l 2 kb Control Insert (40 ng/l) 10 l 30 l 60 l III. 需要的其他材料需要的其他材料 本试剂盒不提供克隆实验所需要的以下材料： Ampicillin (100 mg/ml储存液)或者或者In-Fusion反应液铺板所需要的所需要的其它抗生素其它抗生素 LB (Luria-Bertani)培养基培养基 (pH 7.0) LB/antibiotic平板平板 SOC培养基培养基 感受态细胞感受态细胞 我们建议采用Stellar感受态细胞。如果您决定采用其他的商品化感受态细胞(比如DH10B、DH5)，请确保其转化效率 1.0 x 108 cfu/g。很多In-Fusion HD Cloning Kits附有Stellar感受态细胞，您也可以单独购买不同规格的感受态细胞。 Cloning Enhancer (Cat. Nos. 639613, 639614 & 639615) 可选 Cloning Enhancer在部分In-Fusion HD Cloning Kits中附带，也可以单独购买。Cloning Enhancer用于移除模板DNA背景和PCR残留物， 当PCR产物单一时 （比如没有背景） 无需在克隆前进行插入片段纯化操作。 离心柱离心柱NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Cat. Nos. 740609.10, 740609.50 & 740609.250) 可选 NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up在部分In-Fusion HD Cloning Kits中附带。 如果琼脂糖凝胶电泳结果显示非特异性背景或者多重条带， 可以采用离心柱纯化PCR产物。 我们推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up离心柱。 CloneAmp HiFi PCR Premix (Cat. No. 639298) CloneAmp HiFi PCR Premix是便捷的2X预混合酶试剂，由于CloneAmp HiFi Polymerase的高敏感度、高特异性、高引发效率和高延伸效率，CloneAmp HiFi PCR Premix具备极其精确和高效的DNA扩增性能。另外，此酶含有热启动抗体，能够抑制非特异性扩增。CloneAmp HiFi PCR Premix包含高保真PCR所需要的全部试剂，包括CloneAmp HiFi Polymerase、dNTPs和优化后的缓冲液。这便于快速建立PCR反应并且适用于高通量应用。 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 6 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual IV. PCR和实验准备和实验准备 A. 通过限制性酶切制备线性化载体通过限制性酶切制备线性化载体 想要成功实现In-Fusion反应，您必须首先获得线性化载体。线性化载体可以通过限制性内切酶酶切处理（单酶切或者双酶切）或者PCR扩增获得。 由于酶切效率不同，不同的限制性内切酶会引起不同程度的背景。一般来讲，双酶切比单酶切更有利。酶切位点之间离得越远酶切效率就越好。另外，延长酶切时间和扩大酶切反应体系可以降低背景。 建议采用限制性内切酶酶切处理来获得线性化载体： 1. 按照限制性内切酶供应商的指导来孵育限制性酶切反应。对于大多数酶，孵育3小时至过夜会提高线性化效率并降低背景。 2. 酶切之后，采用任意可用的PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。我们推荐采用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit 进行胶纯化。 3. 对照 取510 ng纯化后的线性化载体转化感受态细胞确定载体背景。 如果背景较高，添加适量限制性内切酶后继续进行更长时间的酶切反应。孵育2小时至过夜。胶纯化酶切产物并再一次进行转化。 B. PCR扩增目的片段扩增目的片段 对于大多数DNA扩增酶，100 pg1 ng质粒DNA通常足够作为PCR模板的用量。然而，如果您以cDNA库作为扩增模板，所需要的模板DNA的数量取决于mRNA群中靶片段的相对丰度。 In-Fusion 方法不会受 A-悬挂的有无所影响，因此您可以采用任意热稳定 DNA 聚合酶进行扩增，包括校正读码酶。想要获得最好的实验结果，我们推荐采用我们的 CloneAmp HiFi PCR Premix (Cat. No. 639298)。由于 CloneAmp HiFi Polymerase 的高敏感度、 高特异性、高引发效率和高延伸效率，CloneAmp HiFi PCR Premix可以提供极其精确和高效的 DNA 扩增。另外，此酶含有热启动抗体以抑制非特异性扩增。CloneAmp HiFi PCR Premix 也包含 dNTPs 和优化后的缓冲液，便于快速建立 PCR 反应。延伸步骤需要的时间已经标准化，可以实现对难扩增的模板 DNA 进行大量扩增。 1. CloneAmp HiFi PCR Premix 所需要的模板量所需要的模板量 (以 25 l 反应体系为例, 基因组 DNA、 DNA、质粒 DNA 模板的延伸时间为 5 sec/kb，cDNA 模板的延伸时间为 510 sec/kb)。 Human genomic DNA 5 ng100 ng E.coli genomic DNA 100 pg100 ng DNA 10 pg100 ng Plasmid DNA 10 pg1 ng cDNA 相当于 25125 ng total RNA 2. CloneAmp HiFi PCR Premix 可获得的产物大小可获得的产物大小(基因组 DNA、 DNA 模板的延伸时间为 5 sec/kb，cDNA 模板的延伸时间为 510 sec/kb) Human genomic DNA up to 6 kb E. coli genomic DNA up to 10 kb cDNA up to 6 kb DNA up to 15 kb Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 7 7 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual 3. PCR 产物分析：产物分析：当 PCR 循环结束时，采用琼脂糖凝胶电泳确认是否获得了单一的 DNA 片段并评估 PCR产物浓度。将已知浓度的或者梯度浓度的 DNA 与 PCR 产物同时进行凝胶电泳，通过比较对 PCR 产物进行定量。 VI. PCR 和实验准备和实验准备, 续 C. PCR引物设计引物设计 引物设计和引物质量对于In-Fusion反应的成功是至关重要的。In-Fusion可以同时连接2个或者多个片段，例如载体和插入片段（或者多重片段），只要其末端具备15个同源碱基就可实现。因此，In-Fusion PCR引物必须以获得的PCR产物包含与载体同源的末端的原则进行设计。Figure 2是引物设计概要，Figure 3是In-Fusion PCR引物设计实例演示。 设计In-Fusion PCR引物时，遵循以下原则： 1. 每个In-Fusion引物必须包含两个部分：引物5端必须包含与将要连接的DNA片段（比如载体或者另外一个片段）末端完全同源的15个碱基。引物3端必须包含靶基因特异引物序列。 2. 每个引物3端应该： 具有基因特异性 长度为1825之间，GC含量为4060% 退火温度(Tm)为5865C。正向和反向引物的Tm值差别应 4C，否则扩增效果不理想。注意：评估Tm值应该基于引物3（基因特异性）端，而不是基于整个引物。如果Tm过低，可以适当延长引物基因特异性部分直到Tm达到5865C。 不包含连续相同核苷酸。 每条引物3端最后5个核苷酸不应该包含多于2个鸟嘌呤(G)或者胞嘧啶(C)。 3. 避免引物内部及引物间互补序列，以防止引物自身产生发夹结构或者引物与引物之间产生引物二聚体。 4. 您可以进行BLAST搜索以确定每一条引物的3端是高度特异的(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 5. Clontech提供在线支持工具(http:/bioinfo.clontech.com/infusion/)简化了In-Fusion PCR引物设计操作。您只需要提供您的载体序列，线性化载体所采用的限制性酶切位点（如果线性化载体方式为酶切处理），及扩增目的基因区域所需要的引物序列，就可以利用In-Fusion在线支持工具轻松设计引物了。 6. 我们通常采用脱盐处理的寡核苷酸引物进行PCR反应。然而，不同供应商和不同批次间的引物质量是不尽相同的。如果您的引物质量特别差（例如，引物纯度较低），或者您的引物长度超过45个核苷酸，那么引物需要采用PAGE纯化；通常情况下这是不必要的。 D. 对照反应对照反应 当首次使用 In-Fusion 试剂盒时，我们强烈建议进行 In-Fusion 克隆反应的同时平行进行阳性和阴性对照反应。阳性对照反应应该为已知浓度的环状质粒（感受态细胞效率应2 x 108 cfu/g），阴性对照应为已知量的线性化载体(预期结果见 Section IX)。 对照反应是为了验证体系是可正常运行的。 In-Fusion HD Cloning Kits 中的 2 kb 对照插入片段已经经过纯化，因此在进行克隆反应之前无需做进一步处理。 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 8 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual VI. PCR 和实验准备和实验准备, 续 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 9 9 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual V. 您应该遵循哪一个操作流程您应该遵循哪一个操作流程? PCR 反应之后， 采用琼脂糖凝胶电泳对扩增获得的目的片段进行确认。 如果在预期位臵获得了单一条带，您可以进行离心柱纯化 （遵循遵循 Protocol I） ， 或者采用 Cloning Enhancer 处理 PCR 产物(遵循遵循 Protocol II)。 然而，如果琼脂糖胶电泳结果显示具有非特异性背景或者多重条带， 您需要通过凝胶提取分离目的片段然后进行离心柱纯化(遵循遵循 Protocol I)。如果您采用 PCR 扩增载体和插入片段，并且 PCR 扩增获得的载体和片段均没有非特异性背景，您可以采用 Appendix A 提供的快速 In-Fusion 克隆操作流程。 VI. 操作流程操作流程 I：In-Fusion 克隆流程克隆流程 w/离心柱纯化离心柱纯化 A. PCR片段离心柱纯化流程片段离心柱纯化流程 1. 如果琼脂糖胶电泳可见非特异性背景， 通过凝胶提取分离目的片段然后进行离心柱纯化； 如果在相应大小位臵获得单一条带，直接进行离心柱纯化。 2. 采用基于硅胶基质的纯化系统进行PCR产物离心柱纯化，例如NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit。在纯化过程中应避免核酸污染并且避免DNA在UV灯下长时间暴露。 3. 纯化后，继续进行 PCR 片段离心柱纯化 In-Fusion 克隆流程(Section VI.B)。 B. PCR片段离心柱纯化片段离心柱纯化In-Fusion克隆流程克隆流程 通常情况下，无论片段大小，载体和插入片段分别添加 50-200 ng 就可达到较高的克隆效率。如果 PCR片段小于 0.5 kb， 片段添加量少于 50 ng 有助于达到最高的克隆效率。 建议插入片段和载体的摩尔比例为建议插入片段和载体的摩尔比例为 2，也可采用 In-Fusion 在线支持工具(http:/bioinfo.clontech.com/infusion/)进行计算。 TableII. Recommended in-fusion reactions for purified fragments Rxn Component Cloning Rxn Negative Control Rxn Positive Control Rxn Purified PCR fragment 10200 ng* 2 l of 2 kb control insert Linearized vector 50200 ng* 1 l 1 l of pUC19 control vector 5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2 l 2 l 2 l Deionized water to 10 l to 10 l to 10 l *10 kb: 50-200 ng *10 kb: 50-200 ng 1. 建立建立 In-Fusion 克隆反应克隆反应体系体系： *对于载体和PCR插入片段反应体系较大时(载体+插入片段 7 l)， 预混合酶用量加倍， 并补加dH20至总体积为20 l。 5X In-Fusion HD Enzyme Premix Linearized Vector Purified PCR Fragment dH2O(as needed) 2 l x l* x l* x l Total Volume 10 l Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 10 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual 2. 补加去离子水至总体积10 l 并混合均匀。 3. 将反应体系臵于50C孵育15 min，然后臵于冰上。 4. 接下来进行转化流程(Section VIII)。您也可以将克隆反应液储存于20C 直至完成准备工作。 VII. 操作流程操作流程 II：In-Fusion 克隆流程克隆流程 w/Cloning Enhancer 处理处理 欢迎登陆宝日医生物技术（北京）有限公司网站欢迎登陆宝日医生物技术（北京）有限公司网站www.takarabiomed.com.cn观看实验操作视频。观看实验操作视频。 A. Cloning Enhancer处理处理未未被纯化的被纯化的PCR片段操作流程片段操作流程 建立In-Fusion克隆反应体系前按照如下操作处理未被纯化的PCR产物（例如片段）: 1. 添加2 l Cloning Enhancer至5 l PCR反应液中。 2. 臵于37C孵育15 min，然后将其臵于PCR仪中80C孵育15 min。如果您以100 ng DNA作为PCR反应模板，将37C孵育时间延长至20 min。如果采用水浴或者加热块而不是PCR仪，将每一步的孵育时间延长至2025 min。 3. 继续进行 Cloning Enhancer 处理 PCR 片段 In-Fusion 克隆流程(Section VII.B)。如果您不能立即进行下一步实验，将 PCR 反应液储存于20C 直至完成准备工作。 B. Cloning Enhancer 处理处理 PCR 片段片段 In-Fusion 克隆流程克隆流程 1. 建立建立 In-Fusion 克隆反应克隆反应： * 50200 ng线性化载体 * 12 l Cloning Enhancer 处理过的 PCR 片段。每 10 l 反应液中最多只能包含 4 l Cloning Enhancer 处理过的 PCR 片段。如果您PCR 反应获得产物量较低，我们建议进行 PCR 片段纯化而不采用 Cloning Enhancer 处理。 2. 补加去离子水至总体积10 l 并混合均匀。 3. 将反应体系臵于50C孵育15 min，然后臵于冰上。 4. 接下来进行转化流程(Section VIII)。您也可以将克隆反应液储存于20C 直至完成准备工作。 5X In-Fusion HD Enzyme Premix Linearized Vector Purified PCR Fragment dH2O(as needed) 2 l x l* x l* x l Total Volume 10 l 重要提示重要提示: 不要采用不要采用 Cloning Enhancer 处理已经纯化后的处理已经纯化后的 PCR 产物。产物。 注意注意: 如果您采用如果您采用 PCR 扩增载体和插入片段， 并且扩增载体和插入片段， 并且 PCR 扩增获得的载体和片段均没有非特异性背景， 您可以采用扩增获得的载体和片段均没有非特异性背景， 您可以采用 Appendix A 提供的快速提供的快速In-Fusion 克隆操作流程。克隆操作流程。 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 1111 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual VIII. 转化流程转化流程 A. 采用采用Stellar感受态细胞感受态细胞转化转化操作流程操作流程 以下转化操作流程已经采用Stellar感受态细胞进行过优化。如果您使用的In-Fusion试剂盒不包含Stellar感受态细胞，Clontech可单独销售不同规格的Stellar感受态细胞。如果您使用的感受态细胞不是Stellar感受态细胞，您可能需要在转化前稀释In-Fusion反应液以提高克隆效率(详见Table III，疑惑解答指南)。我们强烈建议采用转化效率1 x 108 cfu/g的Stellar感受态细胞。 1. 遵循此操作流程转化 2.5 l In-Fusion 反应液至 Stellar 感受态细胞。如果您使用的是其他感受态细胞，请遵循所使用细胞的转化操作流程。 2. 将1/100th1/5th转化液添加到一管感受态细胞中并添加SOC培养基补齐至100 l。 将稀释后的转化液涂布在一个包含与克隆载体相对应的抗生素的LB平板上（例如，试剂盒中包含的对照载体所需氨苄抗生素浓度为100 g/ml）。 3. 剩余转化液以6000 rpm离心5 min。弃去上清，以100 l新鲜的SOC培养基重悬。将每一个样品涂布在单独的含有相应抗生素的LB平板上。37C过夜孵育。 4. 次日，从每个实验平板上挑取单克隆。采用您选择的方法分离质粒 DNA（例如小量提取）。通过酶切处理或者 PCR 筛选确定插入片段成功与否。 IX. 预期结果预期结果 感受态细胞最小转化效率为1 x 108 cfu/g时，阳性对照平板通常生长几百个白斑。阴性对照平板应该只有很少的几个克隆。 实验平板克隆数取决于应用In-Fusion克隆反应的PCR产物和线性化载体的数量和纯度。 两个平板上数量的克隆都很少时尤其是只有几十个时表明转化液使用量过多或者DNA/引物质量较差。 阴性对照平板上出现很多（上百个）克隆说明载体线性化不充分。 重要提示重要提示: 50 l 感受态细胞不要添加多于感受态细胞不要添加多于5 l的的In-Fusion反应液。加量过多未必转化效率更好。反应液。加量过多未必转化效率更好。添加过多的反应液会抑制转化。 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 12 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual X. 疑惑解答指南疑惑解答指南 如果您没有获得预期的实验结果，请根据以下指南修订实验。为了验证本试剂盒体系可正常运行，请平行进行对照反应。 TableIII. In-Fusion实验疑惑解答指南实验疑惑解答指南 A. 转化后无克隆或者克隆转化后无克隆或者克隆数很少数很少 问题描述问题描述 原因原因 解决方法解决方法 转化效率低 In-Fusion 反应液转化量过多 50 l 感受态细胞不要添加多于 5 l 的 In-Fusion 反应液（详见 Section VIII ） 。 感受态细胞对In-Fusion 酶较为敏感 如果克隆效率较低，稀释反应液可能会获得较好的结果。对于一些细胞株，将反应液在转化前采用 TE 缓冲液稀释 5-10 倍可能会获得较好的结果（添加 40-90 l TE 缓冲液到 10 l In-Fusion 反应液） 。 细菌效率不足 确定转化效率。感受态效率应该1 x 108 cfu/g，否则采用新鲜的感受态细胞。 DNA片段质量欠佳 反应液中DNA浓度低 对于In-Fusion反应来说， 获得尽可能高的DNA浓度是必要的。 克隆效率低的原因可能是载体或者PCR片段的用量过低。我们建议载体用量为50 ng- 200 ng，根据片段大小决定具体用量 (详见Table II)。 胶纯化引入的污染 如果您的片段是胶纯化获得的，获得尽可能高的DNA浓度对In-Fusion 反应是必要的。纯化后的载体和插入片段的总体积不应超过5 l 。 可能的话， 优化您的 PCR 扩增反应以获得更纯的 PCR 产物并采 Cloning Enhancer 进行处理 (详见 Section VII.A)。 PCR产物欠佳 重新进行PCR扩增并采用不同的方式进行产物纯化。 另外， 也可以进行苯酚：酚氯仿提取PCR初产物，然后进行乙醇沉淀。 引物序列不正确 确定引物序列以确保引物拥有与插入位点相同源的15个碱基 (详见 Section IV.C). Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 1313 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual X. 疑惑解答指南疑惑解答指南，续 TableIII. In-Fusion实验疑惑解答指南实验疑惑解答指南 B. 大量不含插入片段的克隆大量不含插入片段的克隆 问题描述问题描述 原因原因 解决方法解决方法 大量不含插入片段的克隆 载体线性化不充分 In-Fusion反应前移除未被酶切的载体是非常重要的。必要的话，重新重新酶切载体酶切载体并进行凝胶纯化。 In-Fusion 反 应 被具有相同抗性的质粒所污染 如果插入片段是以质粒为模板扩增得到的，接近于环状的DNA可能不会被纯化去除并污染克隆反应： a) 确保移除任何质粒污染，我们建议进行PCR之前将模板DNA线性化。 b) 如果插入片段采用离心柱纯化方式，纯化前采用 DpnI 酶处理 PCR产物会有助于移除模板 DNA 的污染。 平板保存时间过长导致抗性不足 确保抗生素平板是新鲜制备的（一个月之内）。确保所使用的目的片段抗生素抗性正确。 C. 大量包含不正确大量包含不正确插入片段插入片段的的克隆克隆 大量包含不正确插入片段的克隆 您的PCR产物包含非特异性序列 如果您的PCR产物不是单一的一条带， 那么它可螚需要进行胶纯化以确保正确片段的克隆。详见Section VI。 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 14 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual XI. Appendix A： In-Fusion克隆克隆快速快速操作流程操作流程 A. PCR扩增获得的载体扩增获得的载体&片段片段In-Fusion克隆流程克隆流程 B. 1. 建立建立In-Fusion克隆反应克隆反应: * 10 l 反应体系中PCR载体&片段总体积应不超过4 l。 2. 补加去离子水至总体积10 l并混合均匀。 3. 将反应体系臵于37C孵育孵育15 min，然后，然后50C孵育孵育15 min，然后臵于冰上。 4. 接下来进行转化流程(详见 Section VIII)。如果您不能马上进行转化实验，您也可以将克隆反应液储存于20C 直至完成准备工作。 5X In-Fusion HD Enzyme Premix PCR Linearized Vector PCR Fragment Cloning Enhancer 2 l 12 l* 12 l* 1 l dH2O x l Total Volume 10 l 注意注意: 如果您获得的如果您获得的PCR载体和载体和PCR片段没有非特异性背景，您可以采用以下快速片段没有非特异性背景，您可以采用以下快速In-Fusion克隆操作流程，将克隆操作流程，将Cloning Enhancer处理和处理和In-Fusion反应在同一管中进行。反应在同一管中进行。 Protocol No. PT5162-1 www.takarabiomed.com.cn Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. Version No. 072012 A Takara Bio Company 1515 In-Fusion HD Cloning Kit User Manual XII. Appendix B：pUC19 Linearized Vector Information