真菌检验真菌检验SOP研讨会研讨会时间：20xx年xx月xx日侵袭性真菌病临床实验室诊断操作规范本标准依据GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出本标准起草单位：中国医学科学院北京协和医院、北京大学第一医院、复旦大学附属华山医院。本标准起草人：徐英春、李若瑜、章强强、王瑶、王贺、余进、郭莉娜、张丽、范欣。2优选内容侵袭性真菌病临床实验室诊断操作规范概述本标准规定了侵袭性真菌病临床实验室诊断操作规范、包括标本采集处理、形态检查、培养检查、真菌培养鉴定、非培养诊断方法和药物敏感试验。本标准适用于具有级生物安全防护能力的临床实验室。3优选内容术语和定义4优选内容1. 侵袭性真菌病 IFD指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖所致组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。根据患者宿主因素、临床特征和微生物学检查、将IFD诊断分为确诊(proven)、拟诊(probable)和疑似(possible)。5优选内容2. 最小抑菌浓度 MIC按照标准操作规程进行体外真菌稀释法或连续浓度梯度稀释法药物敏感性试验时，在特定培养时间及温度的条件下，能导致特定程度肉眼可见真菌生长抑制的最低药物浓度。6优选内容3. 剂量依赖敏感 S-DD给予高于常规给药剂量，且达到最大血药浓度时，临床有效。4. 最低有效浓度 MEC指曲霉在含系列浓度的棘白菌素类药物的培养基中培养时，与生长对照孔中的菌丝形态相比，菌丝变短、变圆、变粗的最低药物浓度。7优选内容5. 折点 breakpoint临床上能抗菌药物对真菌分为敏感、耐药、中介或剂量依赖敏感的特定MIC值。折点系综合体外的MIC值、耐药机制、 抗菌药物PK/PD参数及临床疗效而得出，还可能随环境改变而改变（如感染部位、常规给药剂量的改变、给药途径及频次的改变） 。8优选内容6. 消化液 lysis solution粘液溶解作用，用于呼吸道标本等的前处理，常用N-乙酰-L-半胱氨酸、 5%草酸或二巯基苏糖醇等。9优选内容标本采集及处理10优选内容采集部位消毒一步法：葡萄糖酸氯己啶作用 30s，或 70%异丙醇消毒后自然干燥。三步法：(1) 70%乙醇擦拭静脉穿刺部位，作用 30s 以上、待干；(2) 1%-2%碘酊从穿刺点向外画圈消毒至消毒区域直径3cm，作用 30 s 或 10 %碘伏作用 60 s； (3) 70 %乙醇脱碘：对碘过敏者， 用70%乙醇消毒 60s，待乙醇挥发干燥、采集标本。11优选内容血液标本采集推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒颤期、采静脉血或骨髓液。立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集 2 套。标本与培养基比例为 1/10-1/5（成人每瓶 8-10ml）、必须包括需氧瓶或真菌瓶。12优选内容血液标本处理2h 内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。2h 内常温送检不能送检时，常温保存13优选内容评估导管相关性血流感染（ CRBSI）如患者已拔管，应采集 2 套外周血进行培养，同时做导管尖 Maki 法半定量培养（导管尖长 5cm），如 1 套及以上外周血培养阳性，导管尖培养阳性（ 15 CFU），且血培养与导管尖培养菌种相同，即为 CRBSI。如患者尚未拔管，应至少采集 1 套外周血培养，同时尽快采集等量的导管血进行培养，如导管血与外周血培养均阳性，导管血阳性时间比外周血早 2h，或导管血中菌量为外周血中菌量 5 倍以上，且没有其它明确感染源，即为 CRBSI；如导管血培养阴性，外周血培养阳性且为念珠菌属，且没有其它明确感染源，也可能为 CRBSI。14优选内容骨髓标本采集使用肝素化的注射器或溶解离心管采集骨髓液 0.5ml（儿童）至 3ml（成人）后送检。一次性骨穿包骨穿操作采集足量骨髓液送检15优选内容骨髓标本处理15 分钟内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。不建议常规做骨髓液培养，如需培养可将骨髓液接种于培养瓶，但易出现假阳性。骨髓液需同时做吉姆萨染色镜检。15分钟内常温送检骨髓涂片 （吉姆萨染色镜检）16优选内容静脉导管标本采集剪取导管尖段 5cm 置于无菌容器中送检。导管尖段 5cm无菌容器17优选内容静脉导管标本处理一15分钟内常温送检。若不能及时送检，则4C保存。15分钟内常温送检4C保存18优选内容静脉导管标本处理二将导管置于血平板上，使用无菌镊子将其从平板一端滚动至另一端，滚动4次，做导管尖Maki法半定量培养。不要使用含放线菌酮的培养基。19优选内容无菌体液（脑脊液、心包液、腹水和关节液）标本采集除脑脊液外，将其余的无菌体液置于含肝素的无菌真空采血管。脑脊液使用脊髓穿刺针采取后送检。20优选内容无菌体液（脑脊液、心包液、腹水和关节液）标本处理一15分钟内常温送检。若不能及时送检，则常温保存（不能冷藏）。15min 内常温送检不能送检时，常温保存21优选内容标本大于 2ml，则 2000g 离心10 分钟，取沉渣接种。若标本量少于 2ml，则将标本直接接种于培养基。推荐使用细胞离心机对无菌体液进行涂片镜检。脑脊液可直接接种于血培养瓶。无菌体液（脑脊液、心包液、腹水和关节液）标本处理二离心10min接种培养涂片镜检22优选内容脓液、引流液、创面分泌物及窦道标本采集开放性创口：用无菌生理盐水冲洗创面后，应采集病灶活动性边缘组织标本。封闭性脓肿：局部皮肤消毒后用注射器抽取脓血性液体送检。23优选内容脓液、引流液、创面分泌物及窦道标本处理2h 内常温送检。将标本直接接种于培养基。较浓稠的标本需使用消化液处理。2h 内常温送检直接接种于培养皿24优选内容下呼吸道标本（深部痰液、支气管吸取物、肺泡灌洗液）标本采集清洁口腔后采集清晨第一口痰液。采用外科方法进行支气管毛刷取样和采集肺泡灌洗液。唾液或24h 痰液都不能用来进行真菌培养。25优选内容下呼吸道标本（深部痰液、支气管吸取物、肺泡灌洗液）标本处理2h 内室温送检；若不能及时送检，则 4C 保存。将标本接种至含抗生素的选择培养基中。较黏稠的下呼吸道标本需要使用消化液处理，并 2000g 离心 10 分钟后取沉渣接种。2h 内常温送检4C保存26优选内容眼（角膜刮片、玻璃体液等）标本采集及处理角膜刮片或针吸玻璃体液。15 分钟内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。角膜刮片直接接种至不含抑制剂的培养皿中，采用 X 或 C 型涂菌方式，玻璃体液离心后取沉淀物接种。15min 内常温送检不含抑制剂的培养皿接种培养27优选内容组织标本采集、处理采集标本后用无菌容器转运，如标本量较少，需滴加几滴无菌盐水保湿。及时送检，否则室温保存。采用灭菌眼科剪将组织标本剪成米粒大小后接种培养；若可疑组织胞浆菌感染、研磨组织并培养，或采用裂解离心技术处理。若可疑接合菌感染、直接接种不研磨组织。直接镜检需研磨组织，但会影响丝状真菌培养阳性率。建议病理科与检验科联合检查组织标本。组织标本最好接种到包含抗生素和血培养基中。28优选内容尿液标本采集、处理采集早晨第一次清洁尿液、耻骨上联合穿刺尿液或导管尿液 10-50ml， 不要采用 24h 尿液。2h 内常温送检；若不能及时送检， 则 4C 保存。尿液接种前需要 2000g 离心 10 分钟，取沉渣进行镜检和接种。尿液真菌培养不推荐定量检测。29优选内容判定不合格标本a) 标本标识与申请单不符，标识错误或没有标识；b) 未采用无菌容器或容器选择不恰当；c) 标本采集未按规定消毒或清洁创口；d) 标本采集量过少；e) 标本保存方式不恰当或保存时间超过规定；f) 血培养瓶中有凝块；g) 血培养瓶破碎、渗漏或过有效期；h) 血培养瓶数不够；i) 稀薄唾液或低倍镜下上皮细胞数大于 10 个；j) 尿液采集未清洗会阴部及尿道口。30优选内容参 考 文 献：1 秦启贤主编：临床真菌学. 复旦大学出版社， 2001.2 王端礼主编：医学真菌学实验室检验规范. 人民卫生出版社， 2005.3 吴绍熙主编：现代医学真菌检验手册（第二版） . 中国协和医科大学出版社， 2005.4 周庭银，倪语星。临床微生物检验标准化操作. 上海科学技术出版社， 2009.5 周庭银. 临床微生物学诊断与图解（第三版） . 上海科学技术出版社， 2012.6 James V. Manual of Clinical Microbiology M, 10th ed. Washington, DC: ASM Press, 2011.7 Sybren de Hoog, Guarro J, Gene J, et al. Atlas of clinical fungi M. CBS,Electronic Version 3.1, 2011.8 CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, 2009, M27-A3, vol.28, No14.9 CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, 2012, M27-S4, vol.28, No15.10 CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi, 2009, M38-A2, vol.28, No16.11 CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute, principles and procedures for blood cultures; approved guideline, 2009, M47-A2, vol.28, No16.12 EUCAST.The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.Breakpoint tables for interpretation of MICs. Version 6.1,2013.http:/www.eucast.org13 抗酵样真菌药物敏感性试验肉汤稀释法，中华人民共和国行业标准， WS/T,421 -2013,2013-07-16 发布， 1-1414 抗丝状真菌药物敏感性试验肉汤稀释法，中华人民共和国行业标准， WS/T,411-2013,2013-06-03 发布， 1-1431优选内容谢 谢！32优选内容