应用应用酶酶联免疫吸附联免疫吸附技术检测技术检测食食品农药残留品农药残留成员：霍利婷 黄桥 姜帅 李文 刘朋 孔祥斌 民以食为天，随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食品的质量安全要求也逐渐提高。随着全球经济一体化发展和贸易国际化，食品安全问题已延伸为全球性公共问题。尤其是近年来，食品安全事件大量发生，严重影响了大众对社会的看法。所以，综合考虑食品对经济效益和社会效应的影响，如何确保食品的安全性成为食品行业面临的重要课题。药物残留分析从20世纪50年代就开始应用,至今经历了气相色谱法、高效液相色谱法、高效薄层色谱法、超临界流体色谱法、毛细管区域电泳法和免疫分析法。药物残留分析是复杂的混合物中痕量组分的分析技术,既需要精细的微量操作手段,又需要高灵敏度的痕量检测技术,难度大、仪器化程度和分析成本高,为药物残留分析带来一定难度。随着科技的发展,更多的新技术和方法也将应用于生产实践,如生物传感器方法和荧光免疫法,纳米科技、远红外和中红外也将应用于药物残留的检测中。但所有的这些方法都需要有精密的大型仪器,只能适合于中心实验室或作为确证。因此,在生产中灵敏、准确、简便、快速的ELISA检测方法倍受青睐。1ELISA测定原理测定原理抗原抗体的特异免疫反应固载体吸附抗体(抗原)加待测抗原(抗体)与相应的酶标记抗体(抗原)生成抗体(抗原)待测抗原(抗体)酶标记抗体(抗原)的复合物与酶的底物发生反应有色产物待测抗原(抗体)的定量与有色产物量成正比可借助吸光度值计算抗原(抗体)的量在上述反应中,酶促反应只进行一次,而抗原-抗体的免疫反应可进行一次或多次。材料与方法材料与方法仪器与材料器与材料37C恒温箱、酶标板、酶联免疫试剂盒8、100l加样器、塑料吸头；酶标抗原、待测抗原、特异抗体、稀释液、阳性对照液、底物。方法方法 间接法测定抗原和双抗体夹心法测抗原这两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原,通常用于临床诊断,而竞争法测抗原是测定小分子抗原的方法,适用于食品安全的检测。由于食品安全检测需测定的物质大都是低分子量的,但免疫动物产生抗体的抗原分子量要大(至少50000Da)。因此,本文采用竞争法测农药残留所制备的抗原。抗原制备抗原制备农药属于小分子物质，是一种半抗原，无免疫原性。检测时首先要根据农药的结构选择合成路线，人工合成抗原。通过DNA重组技术和蛋白质工程技术可以快速有效筛选具有高度免疫性的重组抗原，从而扩大ELISA检测范围。直接方法合成人工抗原 农药分子半抗原如果有反应功能团,则可根据具体情况用适当的双功能交联试剂与交联方法使半抗原与载体偶联。对于羧基半抗原,可利用羧基通过混合酸酐法、活泼酯法或碳二亚胺法等方法;对于氨基半抗原,则多采用重氮化法或戊二醛法;对于羟基半抗原则可直接与丁二酸酐衍生后再与蛋白质交联;对于巯基半抗原则可通过同源或异源双功能试剂交联;而酮基半抗原则常用氨基氧乙酸化。如徐勤惠等用碳二亚胺法合成了苯甲托品的免疫抗原,Maria等用混合酸酐法合成的免疫抗原,Antonio等利用活泼性酯法合成了三氮苯类除草剂的免疫抗原。脂肪胺类农药分子可在水溶性碳二亚胺的作用下与载体蛋白分子上的羧基结合成免疫抗原。衍生方法合成人工抗原如果农药分子中不含有反应功能团,则需先通过衍生过程在农药分子内产生活性功能团再用双功能交联试剂使之与蛋白质交联。抗体制备抗体制备目前,制备的抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和重组单链抗体。多克隆抗体偶尔会不识别农药分子,从而影响了标准曲线的准确性。单克隆抗体不仅特异性高,而且产生抗体的单克隆细胞可在体外传代繁殖,不受动物免疫时间限制。近些年来,随着人们对免疫球蛋白结构的认识和DNA重组技术的发展,抗体进入了第一个发展阶段抗体库。将多种抗原一起免疫小鼠,免疫后无菌条件下取出小鼠脾,提取脾细胞总RNA。以RNA逆转录合成的cDNA为模板,PCR扩增抗体,将抗体中的轻重链连接成单链抗体ScFv(Singlechain variable fragment)。这些重组抗体比常规单、多克隆抗体的生产速度快,可通过诱变改变抗体特性,使抗体的特异性更强,而且最明显的优势是利用这项技术生产的噬菌体抗体库可同时检测多个农药残留,可制备成试剂盒用于农药残留检测。 ELISA检测（竞争法测抗原）检测（竞争法测抗原）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体；取3孔酶标板分别标为空白、阳性、待测于空白、待测孔各滴入2滴标本稀释液；加10l待测样品(含相应抗原)于待测孔，加阳性对照液1滴于阳性孔；充分混匀后，于37C恒温箱培养20分钟洗板5次，加相应的一定量的酶标抗原于各孔；充分混匀后，于37C恒温箱培养20分钟；洗板5次，加底物各一滴，充分混匀后，于37C恒温箱培养5-10分钟；观察结果 结果预测结果预测空白空白阳性阳性待测待测显色显色+注：“+”无色或极浅；“”深色。 讨论讨论样品中的抗原和酶标抗原可竞争与固相抗体结合,待测样品中抗原含量越高,则与固相抗体结合的越多,使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少,甚至没有机会结合,这样加入底物后就不显色或显色很浅为阳性,显色深者为阴性8。ELISA与其他技术相比,具有灵敏度高,特异性强,仪器设备要求不高,测定成本低,方法快速、简便,试剂保存时间较长,自动化程度高,无放射性同位素污染等优势;但同时也存在局限性,比如不能同时分析多种成分,对试剂的选择性高,对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。所以未来的发展趋势就在于开发高度免疫原性的重组抗原,研究多项标记快速测定方法,将酶体外定向进化应用到检测中以及研发种类更多的全自动酶联免疫测定仪这样将扩大检测的范围,提高检测的稳定性,加强标准化,同时也促进了商品化的应用。同时，提高食品农药残留的检测技术也有助于维持社会的稳定和提升我国在世界个国家中的信誉。【引用文献】梅平，惠小敏，王雄.农药残留检测中酶联免疫吸附技术的研究进展.长江大学学报.2007,4(1):37-41.朱正美,刘辉.简明免疫学技术M.北京,科学出版社.2002.【3】李玉珍，林亲录，肖怀秋.酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用研究进展.中国食品添加剂.2006,3:108-112.【4】徐勤惠,荣泰康.苯甲托品人工抗原的制备及结合比的测定.中国免疫学杂志.1991,7(5)：309-311.【5】MARIAPILARMARCO,SHIRLEY J GEE,HONGMCHENG,et al.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for carbarylJ.J Agric Food Chem,1993,41:423-430.【6】 ANTONIOABAD,ANGELMONTOYA.Production of monoclonal antibodies forcarbaryl fromahaptenpreservingthe carbamategroupJ.JAgricFoodChem,1994,42:1818-1823.【7】董国伟,王沫,刘贤进,等.兔抗甲胺磷多克隆抗体的制备J.华中农业大学学报,2001,20(4):340-343.【8】刘冰,魏松红,尹晓东. 农药残留酶联免疫吸附分析技术研究进展.安徽农业大学.2007,35(21):6484,6515.【9】梁国栋.最新分子生物学实验技术M.北京科学出版社.2001.【10】马颀,任珊,许美玉. 酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用.食品安全与检测.2008,1:200-202.8金征宇.食品安全导论M.北京化学工业出版社.2005:16-28