实验六实验六 免疫荧光技术免疫荧光技术荧光色素荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有： 1 1、异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）：为黄色或橙黄色结晶粉 末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2 2、四乙基罗丹明四乙基罗丹明 3 3、四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明等等实验原理实验原理 利用荧光标记第二抗体检测未知Ag或未知Ab的方法。以检测人血清中抗核抗体（ANA）为例。 小鼠肝细胞作为抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分发生特异性结合，再加入荧光素标记的抗人IgG又可与ANA结合，在荧光显微镜下细胞核部位呈现荧光。实验原理实验原理以检测血清中ANA(抗核抗体)为例。 + ANA（1：5血清）+抗人IgG-FITC 鼠肝细胞 一抗 二抗 有荧光 ：+ 荧光显微镜下观察 无荧光：- 实验方法实验方法1、抗原片的制备（肝印片）：、抗原片的制备（肝印片）： 小鼠断颈处死 剖腹取肝 NS洗涤 滤纸吸水 肝脏剖面后，轻压于载玻片上（压2 处 ） 留下薄层肝细胞 冷风吹干 95%乙醇固定5min 再吹干。2、标记：、标记：设待测孔、对照空白，分别用白蜡笔画圈。3、加样：、加样： 待测孔（+）： 加入100ul待测或对照血清 空白对照： 加入100ulPBS 4、用流水冲洗血清，置、用流水冲洗血清，置PBS液中液中(1,2,3缸缸)浸洗浸洗，每次5min，吹干。（整个清洗过程，动作一定要轻柔）5、滴加稀释的二抗：、滴加稀释的二抗：即抗人IgG-FITC，每圈100ul，置37度湿盒中30min。6、再置、再置PBS液中液中(1,2,3缸缸)浸洗浸洗，每次5min，吹干。7、荧光显微镜下观察，、荧光显微镜下观察，低倍镜找视野，高倍镜看结果。置37度湿盒中30min实验结果细胞核发黄绿色荧光为“+”，阳性待检血清作进一步稀释后可测定效价。不发荧光为“-”。根据细胞核着染荧光的图像，可区分为： 均质性：细胞核呈均匀一致的荧光。 周边性：核周呈现荧光。 斑点型（颗粒型）：核内呈现斑点状荧光。 核仁型：核仁部分呈现荧光。 混合型：两种以上核染色。 注意事项注意事项抗原片要新鲜，厚薄一致，要尽量薄、待检血清要新鲜。冲洗时要干净，动作要轻柔。观察结果要及时，以免荧光湮灭。