13.113.1引言引言性细胞：狭义、广义性细胞：狭义、广义 性细胞：直接参加受精作用的雌、雄配子（卵性细胞：直接参加受精作用的雌、雄配子（卵细胞与精细胞）、花粉原生质体、脱外壁花粉、细胞与精细胞）、花粉原生质体、脱外壁花粉、胚囊。（合子、初生胚乳核）胚囊。（合子、初生胚乳核）-花粉原生质体与脱外壁花粉的分离花粉原生质体与脱外壁花粉的分离-生殖细胞与精细胞的分离生殖细胞与精细胞的分离-胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离离13.213.2花粉原生质体与脱外壁花粉的分离花粉原生质体与脱外壁花粉的分离花粉粒花粉粒脱外壁花粉脱外壁花粉花粉原生质体花粉原生质体13.2.113.2.1花粉原生质体花粉原生质体80年代中期年代中期三三条分离路线条分离路线：1、化学脱壁、化学脱壁：Southworth（1974） Loewus等（等（1985）多糖试剂）多糖试剂MMNO2、酶法脱壁、酶法脱壁：Tanaka等（等（1987）麝香百合成熟花粉的原生质体）麝香百合成熟花粉的原生质体 周嫦（周嫦（1988）鸢尾、萱草、风雨花成熟花粉原）鸢尾、萱草、风雨花成熟花粉原 生质体和萱草幼嫩花粉原生质体生质体和萱草幼嫩花粉原生质体3、非酶法脱壁、非酶法脱壁：Weaver等（等（1990）NaCl溶液滴加于菜豆成熟溶液滴加于菜豆成熟 花粉花粉成功成功四四种分离方法：种分离方法：1、一步酶解法、一步酶解法麝香百合、鸢尾、风雨花的成熟花粉以及萱草不同发育时期的花麝香百合、鸢尾、风雨花的成熟花粉以及萱草不同发育时期的花粉原生质体；粉原生质体； 单子叶植物百合科、鸢尾科、石蒜科等，双子叶植物芸薹属。单子叶植物百合科、鸢尾科、石蒜科等，双子叶植物芸薹属。适用于具宽大萌发沟花粉的植物适用于具宽大萌发沟花粉的植物过程：花粉过程：花粉 酶液酶液 水合膨胀水合膨胀 外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地暴露暴露 酶的作用下分解酶的作用下分解 释放出原生质体释放出原生质体2、水解、水解-酶解二步法酶解二步法分两步：花粉在溶液中充分水合，是外壁裂开，分两步：花粉在溶液中充分水合，是外壁裂开， 转入酶液，降解内壁，获得原生质体转入酶液，降解内壁，获得原生质体甘蓝型油菜与紫菜薹成熟花粉、凌霄花甘蓝型油菜与紫菜薹成熟花粉、凌霄花四四种分离方法：种分离方法：3、萌发、萌发-酶解二步法酶解二步法分离烟草等植物的花粉原生质体分离烟草等植物的花粉原生质体汪泳与周嫦（汪泳与周嫦（1995）建立）建立步骤：步骤： 成熟的花粉置于花粉萌发培养基中，待花粉大量萌发，长出短花成熟的花粉置于花粉萌发培养基中，待花粉大量萌发，长出短花 粉管时及时转入酶液中酶解。粉管时及时转入酶液中酶解。 酶液降解花粉管壁，再扩展至花粉内壁，释放出原生质体酶液降解花粉管壁，再扩展至花粉内壁，释放出原生质体注意：花粉管过长时，形成亚原生质体。注意：花粉管过长时，形成亚原生质体。4、花药预培养法、花药预培养法分离烟草幼嫩花粉原生质体，夏慧君等（分离烟草幼嫩花粉原生质体，夏慧君等（1996）建立）建立三步：花蕾低温预处理三步：花蕾低温预处理 收集花药，将其漂浮在液体培养基上，培养中花药裂开，收集花药，将其漂浮在液体培养基上，培养中花药裂开， 花粉释放到培养基中，继续培养，大量的花粉外壁裂开花粉释放到培养基中，继续培养，大量的花粉外壁裂开 。 将裂外壁花粉转入酶液。内壁被酶降解，外壁脱落，游离将裂外壁花粉转入酶液。内壁被酶降解，外壁脱落，游离 出花粉原生质体。出花粉原生质体。小结：小结：根据不同植物花粉及其花粉壁的特点采取根据不同植物花粉及其花粉壁的特点采取不同的分离方法。不同的分离方法。根据不同花粉发育时期，其形态结构与生根据不同花粉发育时期，其形态结构与生理状态的不同而用不同方法。理状态的不同而用不同方法。分离方法与其细节可影响分离效果。如酶分离方法与其细节可影响分离效果。如酶的种类、酶解时间、温度、浓度等。的种类、酶解时间、温度、浓度等。13.2.213.2.2脱外壁花粉脱外壁花粉三三种分离方法种分离方法1、低渗水合法：、低渗水合法：将花粉置于低渗溶液中水合，使外壁脱落。芸薹属、风雨花、荷花。将花粉置于低渗溶液中水合，使外壁脱落。芸薹属、风雨花、荷花。2、花药预培养法：、花药预培养法：烟草幼嫩花粉原生质体法衍生烟草幼嫩花粉原生质体法衍生三步：花蕾低温预处理三步：花蕾低温预处理-花药漂浮培养花药漂浮培养-酶解酶解酶解时间短酶解时间短3、低温水合、低温水合-热激热激-渗激法渗激法芸薹属脱外壁花粉分离的方法，分离出青菜与紫菜薹脱外壁花粉芸薹属脱外壁花粉分离的方法，分离出青菜与紫菜薹脱外壁花粉三步：将花粉置于水合液中，低温下较长时间水合三步：将花粉置于水合液中，低温下较长时间水合消除内外消除内外 壁的联系，较好地保持花粉的生活力壁的联系，较好地保持花粉的生活力 将花粉转入较高温度下作短时热激处理将花粉转入较高温度下作短时热激处理 再转入低渗溶液，作短时震荡渗激处理。再转入低渗溶液，作短时震荡渗激处理。13.313.3生殖细胞与精细胞的分离生殖细胞与精细胞的分离两类分离方法：两类分离方法：机械分离法机械分离法渗透压冲击法渗透压冲击法13.3.113.3.1生殖细胞生殖细胞四四种分离方法：种分离方法：1、一步渗透压冲击法、一步渗透压冲击法花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流出。细胞随营养细胞质流出。棉花生殖细胞棉花生殖细胞适用于花粉容易在蔗糖溶液中破裂的植物适用于花粉容易在蔗糖溶液中破裂的植物2、二步渗透压冲击法、二步渗透压冲击法适用于花粉容易萌发的植物适用于花粉容易萌发的植物将花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花粉开始萌发时，加将花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花粉开始萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉管尖端破裂，释放出生殖细胞。入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉管尖端破裂，释放出生殖细胞。蚕豆、石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花等蚕豆、石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花等四四种分离方法：种分离方法：3、低酶法、低酶法将花粉置于低浓度的酶溶液与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破将花粉置于低浓度的酶溶液与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放出生殖细胞。裂释放出生殖细胞。黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾等黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾等4、花粉原生质体释放法、花粉原生质体释放法分离出花粉原生质体，用渗透压冲击法或机械法使花粉原生质体分离出花粉原生质体，用渗透压冲击法或机械法使花粉原生质体破裂，获得生殖细胞。破裂，获得生殖细胞。麝香百合分离出生殖细胞麝香百合分离出生殖细胞黄花菜、韭菜、鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等分离出花粉原黄花菜、韭菜、鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等分离出花粉原生质体生质体局限性在于许多植物花粉原生质体尚未分离成功局限性在于许多植物花粉原生质体尚未分离成功。13.3.213.3.2精细胞精细胞三细胞花粉的精细胞分离：三细胞花粉的精细胞分离：1、渗透压冲击法、渗透压冲击法将花粉置于含一定浓度渗透压调节剂的介质中，任其吸水后自行将花粉置于含一定浓度渗透压调节剂的介质中，任其吸水后自行破裂而释放精细胞。破裂而释放精细胞。白花丹、玉米、小麦、甜菜等白花丹、玉米、小麦、甜菜等优点优点：花粉壁不太破碎，碎片易于过滤清除。：花粉壁不太破碎，碎片易于过滤清除。花粉发育时期与生理状态对渗透压冲击效果有很大影响花粉发育时期与生理状态对渗透压冲击效果有很大影响。2、研磨法、研磨法将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器或其他装置轻轻研磨，将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器或其他装置轻轻研磨，使花粉破裂而又不损伤精细胞。使花粉破裂而又不损伤精细胞。油菜、甘蓝、紫菜薹、非洲菊、菠菜等油菜、甘蓝、紫菜薹、非洲菊、菠菜等优点优点：手续简便，不过分依赖花粉的成熟度与生理状态。：手续简便，不过分依赖花粉的成熟度与生理状态。但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片较难清除。但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片较难清除。二细胞花粉的精细胞分离二细胞花粉的精细胞分离1、花粉离体培养法、花粉离体培养法花粉在培养基中人工萌发，待形成精细胞后，应用渗透压冲击法花粉在培养基中人工萌发，待形成精细胞后，应用渗透压冲击法或研磨使花粉管破裂。或研磨使花粉管破裂。百合、蓝猪耳百合、蓝猪耳人工萌发的花粉管在精细胞形成上常不同步，由此分离的精细胞人工萌发的花粉管在精细胞形成上常不同步，由此分离的精细胞群体中不免混杂一些尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。群体中不免混杂一些尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。2、活体、活体-离体法离体法Shivanna等（等（1988）首创，分离杜鹃与唐菖蒲精细胞）首创，分离杜鹃与唐菖蒲精细胞将花粉授于柱头上，切下花柱插入培养基，待众多花粉管中已形将花粉授于柱头上，切下花柱插入培养基，待众多花粉管中已形成精细胞，花粉管自花柱切口长出，然后用渗透压冲击或酶法促成精细胞，花粉管自花柱切口长出，然后用渗透压冲击或酶法促使花粉管尖端破裂。使花粉管尖端破裂。莫永胜与杨弘远（莫永胜与杨弘远（1992）5科科8种（鸢尾、棉花、朱顶红、烟草、种（鸢尾、棉花、朱顶红、烟草、 黄花菜、萱草、玉帘等）分离出精细胞黄花菜、萱草、玉帘等）分离出精细胞 Tian与与Russell（1997）分离烟草精细胞分离烟草精细胞分离的精细胞纯度高，且接近受精前的发育状态分离的精细胞纯度高，且接近受精前的发育状态13.413.4胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离分离程序：分离程序：人工解剖，除去子房壁，分离出胚珠。人工解剖，除去子房壁，分离出胚珠。从胚珠中设法分离出胚囊。从胚珠中设法分离出胚囊。卵细胞、合子和中央细胞要从胚囊中进一步分卵细胞、合子和中央细胞要从胚囊中进一步分离或由胚珠直接分离。离或由胚珠直接分离。13.4.113.4.1胚囊胚囊生活胚囊的分离一般采用酶法。生活胚囊的分离一般采用酶法。 将胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心细胞离散，裸露出胚囊。将胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心细胞离散，裸露出胚囊。在酶解的基础上要适当辅以机械处理（振荡、吸打、压片或解剖）在酶解的基础上要适当辅以机械处理（振荡、吸打、压片或解剖），提高分离的效果。，提高分离的效果。1975年俄国科学家分离出烟草生活胚囊年俄国科学家分离出烟草生活胚囊 20世纪世纪80年代，周嫦与杨弘远等在金鱼草、向日葵与烟草中用酶年代，周嫦与杨弘远等在金鱼草、向日葵与烟草中用酶 解振荡法分离出生活胚囊解振荡法分离出生活胚囊 胡适宜等用酶法压片法分离出烟草、颠茄胚囊及其成员细胞。胡适宜等用酶法压片法分离出烟草、颠茄胚囊及其成员细胞。 Mol（1986）报道了蓝猪耳生活胚囊及其成员细胞的分离。报道了蓝猪耳生活胚囊及其成员细胞的分离。其他植物：玉米、麝香百合、白花丹、矮牵牛等。其他植物：玉米、麝香百合、白花丹、矮牵牛等。 孙蒙祥等（孙蒙祥等（1993）建立）建立新的酶解新的酶解-渗透压冲击渗透压冲击法法，提高分离效果，获得了卵细胞等胚囊成员细，提高分离效果，获得了卵细胞等胚囊成员细胞。胞。方法之一方法之一：将胚珠置于等渗甘露醇的酶液中保温，：将胚珠置于等渗甘露醇的酶液中保温，再转入低渗甘露醇溶液中冲击，辅以轻缓吸打。再转入低渗甘露醇溶液中冲击，辅以轻缓吸打。方法之二方法之二：将胚珠直接置于低渗甘露醇的酶液处：将胚珠直接置于低渗甘露醇的酶液处理。在酶与低渗双重作用下，胚囊由胚珠的珠孔理。在酶与低渗双重作用下，胚囊由胚珠的珠孔或胚柄断面溢出。或胚柄断面溢出。13.4.213.4.2卵细胞、合子与中央细胞卵细胞、合子与中央细胞胡适宜等（胡适宜等（1985）首次首次分离出烟草胚囊成员细胞。分离出烟草胚囊成员细胞。分离技术分为分离技术分为三三类：类：1、酶解法、酶解法分离出卵细胞、合子与中央细胞等分离出卵细胞、合子与中央细胞等在酶法分离胚囊的基础上延长酶解时间，降解胚囊壁，可使卵细在酶法分离胚囊的基础上延长酶解时间，降解胚囊壁，可使卵细胞等溢出。胞等溢出。蓝猪耳、矮牵牛、烟草等卵细胞和蓝猪耳、矮牵牛、烟草等卵细胞和/或中央细胞或中央细胞酶解酶解-研磨法分离出烟草合子研磨法分离出烟草合子2、解剖法、解剖法单独应用显微解剖技术，直接从胚珠中分离卵细胞等。单独应用显微解剖技术，直接从胚珠中分离卵细胞等。禾本科获得成功：大麦、小麦、玉米、水稻等卵细胞与合子分离禾本科获得成功：大麦、小麦、玉米、水稻等卵细胞与合子分离分离水稻卵细胞与合子时用了胚珠纵剖、分离水稻卵细胞与合子时用了胚珠纵剖、横剖横剖与积压三种方式。与积压三种方式。3、酶解、酶解-解剖法解剖法胚珠先酶解，然后作显微解剖胚珠先酶解，然后作显微解剖玉米、白花丹、黑麦草、烟草、小麦和水稻等玉米、白花丹、黑麦草、烟草、小麦和水稻等小结：小结：1.酶解法操作简单，适合分离大量的胚珠。但分离率低，酶可能产酶解法操作简单，适合分离大量的胚珠。但分离率低，酶可能产生毒害，影响材料的生活力。适用于胚珠小而数量多，具薄珠心生毒害，影响材料的生活力。适用于胚珠小而数量多，具薄珠心的植物材料如烟草。的植物材料如烟草。2.解剖法操作准确度高，分离率高，无酶伤害，易保持材料的生活解剖法操作准确度高，分离率高，无酶伤害，易保持材料的生活力。但需熟练的操作技巧，分离速度偏慢。多用于胚珠较大数量力。但需熟练的操作技巧，分离速度偏慢。多用于胚珠较大数量较少，具厚珠心的植物材料，如禾本科植物。较少，具厚珠心的植物材料，如禾本科植物。3.酶解酶解-解剖法以解剖为主，兼取酶法离解胚珠细胞间联系的优点，解剖法以解剖为主，兼取酶法离解胚珠细胞间联系的优点，在不少植物上获得。玉米在不少植物上获得。玉米13.513.5结语结语目前，在植物性细胞分离技术的基础上已转入了性细胞目前，在植物性细胞分离技术的基础上已转入了性细胞的培养、融合、转化等实验体系的建立，并开展相关的的培养、融合、转化等实验体系的建立，并开展相关的细胞生物学与分子生物学研究。细胞生物学与分子生物学研究。 幼嫩花粉原生质体的培养取得了阶段性进展幼嫩花粉原生质体的培养取得了阶段性进展 脱外壁花粉新系统的建立脱外壁花粉新系统的建立 利用分离的生殖细胞、精细胞、胚囊及胚囊细胞开展细利用分离的生殖细胞、精细胞、胚囊及胚囊细胞开展细胞生物学研究胞生物学研究存在的问题：存在的问题： 分离成功的植物材料有限分离成功的植物材料有限 分离的首次成功和分离技术的完善之间有距离，需要不分离的首次成功和分离技术的完善之间有距离，需要不断探索改进。断探索改进。