HPLC的保养和故障排除的保养和故障排除HPLC的日常操作条件的日常操作条件u最好是恒温、恒湿最好是恒温、恒湿 温度：温度：1530 相对湿度相对湿度80%u房间应有良好的通风房间应有良好的通风u空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器u避免光线直射避免光线直射u远离高电干扰、高振动设备远离高电干扰、高振动设备泵的使用与维护注意事项泵的使用与维护注意事项v防止任何固体微粒进入泵体（防止任何固体微粒进入泵体（0.2um或或0.45um的的微孔滤膜过滤）微孔滤膜过滤）v流动相不应含有任何腐蚀性特质，含有缓冲液的流动相不应含有任何腐蚀性特质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内流动相不应保留在泵内v泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否否则空泵则空泵运转也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液运转也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液v输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力v流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性量的稳定性流动相的选择流动相的选择v采用采用 “HPLC” 级溶剂级溶剂v对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度v溶剂粘度要小溶剂粘度要小v与检测器相匹配与检测器相匹配v溶剂的等级溶剂的等级HPLC级级优级纯优级纯分析纯分析纯溶剂等级溶剂等级微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱都都经过蒸馏和经过蒸馏和0.45u的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过级经过0.2u的过滤的过滤,且除去有紫外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质溶剂纯度的影响溶剂纯度的影响溶剂中的杂质会导致出现溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰鬼峰”，特别是梯度解吸，特别是梯度解吸时时注意：注意： 只能使用色谱级的溶剂只能使用色谱级的溶剂! 不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液缓冲液的使用缓冲液的使用缓冲液的使用缓冲液的使用v 使用前必须过滤使用前必须过滤v 使用后一定要进行清洗使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨，以免造成腐蚀、磨损、阻塞损、阻塞:v 第二天接着用：用第二天接着用：用20%甲醇：甲醇：80%水冲洗水冲洗20-30分钟分钟v 隔几天再用：用甲醇：水冲洗后，再用纯甲醇隔几天再用：用甲醇：水冲洗后，再用纯甲醇冲洗冲洗v易受到细菌和霉菌的影响易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗不能直接用有机溶剂冲洗流动相流动相流动相流动相的的的的过过过过滤滤滤滤过滤：过滤：0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜v 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时制的缓冲液时过滤膜种类过滤膜种类v 水系过滤膜水系过滤膜 水系滤膜严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解水系滤膜严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解v 有机系过滤膜有机系过滤膜 脱气脱气v 目的：除去流动相中因溶解或混合而目的：除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡产生的气泡 产生原因：产生原因：v温度上升温度上升v压力下降压力下降v 溶剂混合溶剂混合流动相流动相流动相流动相的脱气的脱气的脱气的脱气v流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能贮存在塑料容器中中，不能贮存在塑料容器中。v容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。v磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应临用磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应临用现现制制。v容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。和可能生长的微生物。流动相流动相流动相流动相的的的的贮存贮存贮存贮存流动相过滤头产生的问题流动相过滤头产生的问题故障特征故障特征“鬼峰鬼峰”(由已被污染的过滤头造成由已被污染的过滤头造成)保留时间不断改变保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞由于过滤头堵塞或部分堵塞)清洗步骤清洗步骤：1. 水水2. 稀硝酸稀硝酸3. 水水4. 异丙醇异丙醇5. 水水(超声波清洗超声波清洗)流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和峰面积改变保留时间和峰面积v流动相中形成气泡对液流的不良影响流动相中形成气泡对液流的不良影响v泵中形成气泡使液流波动泵中形成气泡使液流波动峰变形峰变形v柱中气泡形成和累积使流动相绕流柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声尖峰或锯齿状噪声v检测池中气泡形成和累积产生基线噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声1. 使用流动相溶解样品使用流动相溶解样品 - 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要由为重要 - 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀在系统中尤其在柱中产生沉淀 2. 进样前最好使用进样前最好使用0.45um 的膜的膜进行过滤进行过滤 如果样品很脏，要使用如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤的膜进行过滤样品处理样品处理梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱优点优点：可提高分离度、缩短分离时间和提高分离精度可提高分离度、缩短分离时间和提高分离精度注意事项：注意事项：v溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差，进，进行样品之前必须进行空白梯度洗脱行样品之前必须进行空白梯度洗脱 ，以辨认溶剂杂，以辨认溶剂杂质峰。质峰。v梯度混合的溶剂互溶性要好梯度混合的溶剂互溶性要好v梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）（如示差折光检测器）v每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡。每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡。梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱溶剂混合产生的问题溶剂混合产生的问题流动相中所使用的不同溶剂必须互溶流动相中所使用的不同溶剂必须互溶流动相中溶剂不互溶会导致流动相中溶剂不互溶会导致:1. 基线漂移，基线漂移，2. 保留时间的重现性差，保留时间的重现性差，3. 出现肩峰和出现肩峰和“鬼峰鬼峰”的问题的问题.混合器混合器低低压梯度比例梯度比例阀 高高压梯度梯度低低压梯度梯度脱气机脱气机高压高压高压高压/ / / /低压梯度系统低压梯度系统低压梯度系统低压梯度系统高压梯度系统高压梯度系统梯度准确度好梯度准确度好系统复杂系统复杂 (需两台或三台泵需两台或三台泵)低压梯度系统低压梯度系统系统简单系统简单需在线脱气机需在线脱气机存在时间滞后效应存在时间滞后效应高压高压高压高压/ / / /低压梯度系统低压梯度系统低压梯度系统低压梯度系统输液泵发生故障及相应排除措施输液泵发生故障及相应排除措施故障故障 可能原因可能原因 解决办法解决办法 无流动相流出，无流动相流出，又无压力指示又无压力指示泵内有大量气体泵内有大量气体打开泄压阀，以较大流打开泄压阀，以较大流量（量（5 5mL/min)mL/min)运转，运转，密封圈损坏密封圈损坏更换更换压力和流量不稳压力和流量不稳有气泡有气泡打开泄压阀，以较大流打开泄压阀，以较大流量（量（5 5mL/min)mL/min)运转，运转，单向阀内单向阀内有异物有异物稀硝酸超声清洗稀硝酸超声清洗压力高压力高 堵堵压力低压力低漏漏 手动进样器手动进样器手动进样器手动进样器操作注意点：操作注意点：1 1）样品溶液必须用样品溶液必须用0.45um0.45um的滤膜过滤的滤膜过滤2）进样时，进样针应插到底进样时，进样针应插到底，不使用时不使用时将针头留在进样器内将针头留在进样器内3 3）进样应使用液相色谱专用平头）进样应使用液相色谱专用平头进样针进样针4 4）转动阀芯时不能太慢，更不能停留在转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置中间位置5）样品溶液样品溶液pH小于小于10, 常用密封垫的材常用密封垫的材质适用质适用pH10, 否则换特氟隆材质的密否则换特氟隆材质的密封垫封垫pH10-13定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套进样器的保养进样器的保养进样器的保养进样器的保养进样体积进样体积过大的进样体积会导致产生过大的进样体积会导致产生宽峰或宽峰或峰形不对称峰形不对称通常引起色谱柱过载或超出检通常引起色谱柱过载或超出检测器的检测限是由于样品浓度测器的检测限是由于样品浓度过高而不是体积的问题过高而不是体积的问题注意：注意： 使用微径柱时，必须保使用微径柱时，必须保证柱子不要过载证柱子不要过载v柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动震动柱的保养柱的保养8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:输液时不要打开排液阀输液时不要打开排液阀v当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净干净v要注意流动相的脱气要注意流动相的脱气v避免使用高粘度的溶剂作为流动相避免使用高粘度的溶剂作为流动相v进样样品要提纯进样样品要提纯v控制进样量控制进样量v每天分析工作结每天分析工作结束束后，要清洗进样阀中残留的样后，要清洗进样阀中残留的样品品v每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱v当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存柱的保养柱的保养噪音高或噪音高或基线漂移基线漂移解决问题解决问题可能原因可能原因柱子没有平衡好柱子没有平衡好杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质组分从色谱柱中缓慢流出杂质在柱子中的富集杂质在柱子中的富集检测器或色谱柱的温度差异检测器或色谱柱的温度差异系统有气泡系统有气泡检测器氘灯需更换检测器氘灯需更换电压不稳造成干扰电压不稳造成干扰解决办法解决办法继续冲洗色谱柱至平衡继续冲洗色谱柱至平衡利用强极性的溶剂冲洗色谱柱利用强极性的溶剂冲洗色谱柱冲洗色谱柱；提高样品的预处理；冲洗色谱柱；提高样品的预处理；使用色谱纯的溶剂使用色谱纯的溶剂使用色谱柱恒温箱使用色谱柱恒温箱流动相脱气；流动相脱气；更换氘灯更换氘灯使用稳压电源；检查供电系统使用稳压电源；检查供电系统出现出现“鬼鬼峰峰”解决问题解决问题可能原因可能原因上一针样品中没有上一针样品中没有完完全流出的物质全流出的物质色谱柱被污染色谱柱被污染溶剂中有杂质溶剂中有杂质流动相和溶解样品流动相和溶解样品的溶剂不互溶的溶剂不互溶解决办法解决办法待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个样品；样品；每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲洗色谱柱；洗色谱柱；改进样品的预处理改进样品的预处理每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲色谱柱；色谱柱；改进样品的预处理改进样品的预处理使用色谱纯的溶剂使用色谱纯的溶剂尽量用流动相溶解样品尽量用流动相溶解样品；出现肩峰或出现肩峰或前延峰前延峰解决问题解决问题可能原因可能原因柱头柱头“塌陷塌陷”造成死体积造成死体积溶解样品的溶剂选择错误溶解样品的溶剂选择错误干扰物质的存在；干扰物质的存在；样品中的杂质样品中的杂质色谱柱过载色谱柱过载柱外效应的影响柱外效应的影响解决办法解决办法更换色谱柱更换色谱柱用流动相溶解样品用流动相溶解样品改进样品预处理；改进样品预处理；使用色谱纯溶剂使用色谱纯溶剂将样品稀释将样品稀释检查管路连接检查管路连接峰形展宽峰形展宽解决问题解决问题解决办法解决办法更换色谱柱或预柱更换色谱柱或预柱减少进样体积；稀释样品减少进样体积；稀释样品用流动相溶解样品用流动相溶解样品检查管路连接检查管路连接检查是否有漏；使用小的检查是否有漏；使用小的检测池检测池提高色谱柱温度提高色谱柱温度更换色谱柱更换色谱柱可能原因可能原因色谱柱或预柱被污染或不合适色谱柱或预柱被污染或不合适色谱柱色谱柱“过载过载”或进样体积过大或进样体积过大溶解样品的溶剂选用不当溶解样品的溶剂选用不当柱外效应的影响柱外效应的影响色谱柱和检测器之间有漏；色谱柱和检测器之间有漏；检测器的检测池过大检测器的检测池过大色谱柱温度太低；色谱柱温度太低；流动相的黏度太高流动相的黏度太高色谱柱柱效下降色谱柱柱效下降出现脱尾峰出现脱尾峰解决问题解决问题解解决办法决办法减少样品体积；减少样品体积；改进样品预处理；改进样品预处理；调节流动相的组成；调节流动相的组成；使用流动相改性剂（如三乙胺）；使用流动相改性剂（如三乙胺）；降低流动相的降低流动相的pHpH值；值；使用碱性去活的色谱柱使用碱性去活的色谱柱更换滤网；使用柱前过滤系统；更换滤网；使用柱前过滤系统；将样品过滤将样品过滤检查管路连接检查管路连接更换色谱柱；更换色谱柱；可能原因可能原因色谱柱过载色谱柱过载干扰峰；杂质干扰峰；杂质硅胶表面未完全键合的硅胶表面未完全键合的硅羟基的影响硅羟基的影响色谱柱的滤网堵塞色谱柱的滤网堵塞柱外效应的影响；柱外效应的影响；死体积死体积色谱柱有色谱柱有“塌陷塌陷”、短流或断流、短流或断流出现双重峰或出现双重峰或分叉峰分叉峰解决问题解决问题可能原因可能原因样品体积过大；样品体积过大；色谱柱过载色谱柱过载溶解样品的溶剂选用不溶解样品的溶剂选用不当当色谱柱有色谱柱有“塌陷塌陷”、短、短流或断流流或断流色谱柱滤网堵塞色谱柱滤网堵塞进样器没有彻底清洗进样器没有彻底清洗解决办法解决办法减少进样体积；减少进样体积；稀释样品；稀释样品；将样品在流动相中溶解将样品在流动相中溶解更换色谱柱；更换色谱柱；使用较温和的分离条件使用较温和的分离条件更换色谱柱的滤网；更换色谱柱的滤网；使用柱前过滤装置；使用柱前过滤装置；过滤样品过滤样品彻底清洗进样器；彻底清洗进样器；更换进样器转子更换进样器转子保留时间变长保留时间变长解决问题解决问题可能原因可能原因流速降低流速降低硅胶表面有活性点硅胶表面有活性点键合相流失键合相流失流动相的组成有变化流动相的组成有变化温度降低温度降低解决办法解决办法检查系统是否有漏；检查系统是否有漏；更换泵的密封圈；更换泵的密封圈；排净气泡；排净气泡；使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；使用碱性去活的色谱柱使用碱性去活的色谱柱保持流动相保持流动相pHpH值在值在2-7.5 2-7.5 范围内范围内检查泵；检查滤网；检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱使用色谱柱恒温箱保留时间缩短保留时间缩短解决问题解决问题可能原因可能原因流速升高流速升高色谱柱过载色谱柱过载键合相流失键合相流失流动相组成发生变化流动相组成发生变化温度升高温度升高色谱柱老化色谱柱老化解决办法解决办法检查泵；检查流速检查泵；检查流速降低样品的浓度或进样体积降低样品的浓度或进样体积流动相的流动相的pHpH值保持在值保持在2-7.5 2-7.5 范围内范围内检查泵；检查滤网；检查泵；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱使用色谱柱恒温箱更换色谱柱；更换色谱柱；使用预柱使用预柱保留时间保留时间无规则改变无规则改变解决问题解决问题可能原因可能原因流速发生变化流速发生变化色谱柱尚未平衡；色谱柱尚未平衡；流动相组成发生变化；流动相组成发生变化；流动相中的溶剂互溶性差流动相中的溶剂互溶性差色谱柱温度发生变化色谱柱温度发生变化杂质在色谱柱中杂质在色谱柱中“堆积堆积”解决办法解决办法检查是否有漏；检查是否有漏；更换泵的密封；更换泵的密封；排净气泡排净气泡至少用至少用1010倍柱体积的流动相倍柱体积的流动相平衡色谱柱；平衡色谱柱；检查泵；检查泵；检查滤网；检查滤网；防止流动相的挥发或降解防止流动相的挥发或降解使用色谱柱恒温箱使用色谱柱恒温箱冲洗色谱柱；冲洗色谱柱；检测器的保养检测器的保养u紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时，打开检紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时，打开检测器；在分析完闭后，先关测器；在分析完闭后，先关紫外灯紫外灯。（频繁的开关。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命）灯会缩短灯的使用寿命）u样品池要保养样品池要保养1）用）用HPLC级溶剂级溶剂2）过滤流动相和溶剂）过滤流动相和溶剂3）脱气）脱气4）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中避免问题避免问题 将处理问题的时间降到最低将处理问题的时间降到最低 预测可能出现的问题预测可能出现的问题确定问题所在！确定问题所在！一次仅改变一种因素一次仅改变一种因素!确保同样的问题发生过至少两次确保同样的问题发生过至少两次!尽量预计下一个可能出现的问题，并尽快更尽量预计下一个可能出现的问题，并尽快更正，以避免出现紧急情况正，以避免出现紧急情况!对自己所做的故障排除工作作好记录对自己所做的故障排除工作作好记录!