氯霉素眼药水的高效液相色谱分析氯霉素眼药水的高效液相色谱分析彭花萍彭花萍仪器分析实验仪器分析实验目的要求：目的要求：1、了解高效液相色谱的基本原理、了解高效液相色谱的基本原理2、了解高效液相色谱仪的结构及正确使用、了解高效液相色谱仪的结构及正确使用3、学习外标法测定组分的含量、学习外标法测定组分的含量色谱起源色谱起源石油醚石油醚碳酸碳酸钙颗钙颗粒粒色素色素混合物混合物色色谱谱分离分离组组分分色谱的发明人色谱的发明人色谱的发明人色谱的发明人俄国科学家：俄国科学家：俄国科学家：俄国科学家：M. S. TswettM. S. Tswett提出经典液相色谱提出经典液相色谱提出经典液相色谱提出经典液相色谱植物的石油醚提取液在碳酸钙吸附剂填充的玻璃管中分离出叶绿素及其他色素流动相：流动相：携带样品流过携带样品流过整个系统的流体整个系统的流体固定相：固定相：静止不动的一静止不动的一相，色谱柱相，色谱柱色谱法分离的基本原理：色谱法分离的基本原理：各组分性质结构差异各组分性质结构差异与固定相相互作用差异与固定相相互作用差异随流动相移动的速度不等随流动相移动的速度不等反复多次分配平衡反复多次分配平衡(吸附吸附解吸解吸)保留时间不同保留时间不同达到分离效果达到分离效果A+B+CABCCBACBACCB色谱洗脱过程与色谱图色谱洗脱过程与色谱图 t，minABC信信号号色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术离的技术色色谱定义谱定义v色谱是一种色谱是一种分离分离技术技术. .v色谱的主要目的是对混合物中的目标物色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离分离和和定量定量 色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间号强度，横坐标为保留时间。保留体积保留体积V VR R调整保留体积调整保留体积V VR R死体积死体积V V0 0峰面积峰面积相对保留值相对保留值保留指数保留指数V=V=；FcFc为流动相流速为流动相流速保留值保留值区域宽度区域宽度WW1/21/2 W=4W=4W1/2W液相色谱液相色谱按流动相与固定相的分子聚集状态分类按流动相与固定相的分子聚集状态分类 流动相流动相固定相固定相气体气体(gas,G)液体液体(liguid,L)超临界流体超临界流体(supercrttical fluid,SF)固体固体(solid,S)GSCLSCSFSC液体液体(liguid,L)GLCLLCSFLC化学键合相化学键合相(bonded phase,BP)GBPCLBPCSFBPC气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱超临界色谱超临界色谱液相色谱液相色谱：以：以液体液体作为流动相的色谱分离方法作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用HPLC是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：高精度、耐高压的输液泵高精度、耐高压的输液泵高性能的色谱柱高性能的色谱柱高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器HPLC特点特点 分离性能好分离性能好 灵敏度高（灵敏度高（10-910-12 g） 选择性高（同分异构，旋光异构）选择性高（同分异构，旋光异构） 分析速度快分析速度快 进样量小（进样量小（1-100 m mL）1010HPLC应用领域应用领域药物分析（抗生素、维生素）药物分析（抗生素、维生素）临床分析（药物代谢）临床分析（药物代谢）化学品（邻苯二甲酸、醛、酮、药物中间体）化学品（邻苯二甲酸、醛、酮、药物中间体）环境（多环芳烃、农残、微嚢藻毒素）环境（多环芳烃、农残、微嚢藻毒素）食品（孔雀石绿、苏丹红）食品（孔雀石绿、苏丹红）生命科学（蛋白质、多肽）生命科学（蛋白质、多肽）液相液相色谱的基本流程图色谱的基本流程图流动相流动相 高压泵高压泵色谱柱色谱柱检测器检测器高压输高压输液系统液系统分离系统分离系统检测系统检测系统记录系统记录系统AEGBCDF进样阀进样阀进样进样系统系统预备柱预备柱 1212HPLC分析过程 分析前，分析前，选择适当的色谱柱和流动相选择适当的色谱柱和流动相，开泵开泵，冲洗柱子冲洗柱子，待柱子达到平衡而且待柱子达到平衡而且基线平直基线平直后，用微量注射器把样品注入后，用微量注射器把样品注入进进样样口，流动相把试样带入色谱柱进行口，流动相把试样带入色谱柱进行分离分离，分离后的组分依次，分离后的组分依次流入检测器的流通池流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起，最后和洗脱液一起排入流出物收集器排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。定量和评价柱效高低的依据。美国美国AgilentAgilent美国美国WatersWaters日本岛津日本岛津常用的高效液相色谱仪常用的高效液相色谱仪LC-15C4.2.2 高效液相色谱主要部件高效液相色谱主要部件(1) 泵输液系统泵输液系统主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：1535MPa。提供高压流动相。提供高压流动相应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。(2) 进样装置进样装置 流路中为高压力工作状流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的态，通常使用耐高压的六六通阀通阀 其结构如图所示：其结构如图所示：泵泵柱柱进样进样排放排放泵泵排放排放柱柱进样进样六通阀是很好的定量装置，使得六通阀是很好的定量装置，使得高效液相色谱的进样量得到准确高效液相色谱的进样量得到准确的控制。的控制。定量环定量环 装填状态装填状态进样状态进样状态色谱柱（色谱柱（C18柱，柱，ODS） ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；由于它是柱；由于它是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，适合分离长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，适合分离有机物，因此在分析工作中应用的最为广泛。有机物，因此在分析工作中应用的最为广泛。常用流动相：水、甲醇、乙腈常用流动相：水、甲醇、乙腈目前最普遍的检测器目前最普遍的检测器测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大紫外检测器紫外检测器朗伯朗伯比尔定律比尔定律眼药水中的氯霉素眼药水中的氯霉素 氯霉素滴眼液氯霉素滴眼液 用于治疗由大肠杆用于治疗由大肠杆菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、金黄菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感色葡萄球菌、溶血性链球菌和其他敏感菌所致眼部感染，如沙眼、结膜炎、角菌所致眼部感染，如沙眼、结膜炎、角膜炎、眼睑缘炎等。膜炎、眼睑缘炎等。 为无色或几乎无为无色或几乎无色的澄明液体。色的澄明液体。 其主要成份其主要成份氯霉素氯霉素，辅料为硼酸、，辅料为硼酸、硼沙、氯化钠、防腐剂等硼沙、氯化钠、防腐剂等氯霉素氯霉素条件：需要已知浓度的标准样品条件：需要已知浓度的标准样品 待测成分与杂质间分离良好待测成分与杂质间分离良好对照品对照品 20ul成份成份 A样品样品 20uL成份成份 A峰面积峰面积A样品样品峰面积峰面积A对照对照外标一点法外标一点法色谱定量：色谱定量：峰面积与样品浓度峰面积与样品浓度成正比。成正比。已知浓度已知浓度的氯霉素的氯霉素溶液溶液眼药水稀眼药水稀释液释液氯霉素含量的测定氯霉素含量的测定 精密吸取眼药水精密吸取眼药水10mL，用，用7:3的水的水:甲醇溶液稀释至，配甲醇溶液稀释至，配制成眼药水的稀释溶液制成眼药水的稀释溶液1、对照品配制（、对照品配制（0.1mg/mL) 用清洗溶剂清洗微量进样针三次，用待测溶液润洗三次，用清洗溶剂清洗微量进样针三次，用待测溶液润洗三次，吸取待测溶液约吸取待测溶液约25L，进样，记录，进样，记录5分钟，得色谱图。分钟，得色谱图。2、眼药水样品配制、眼药水样品配制 精密称取氯霉素样品，用精密称取氯霉素样品，用5mL甲醇溶解，用甲醇溶解，用7:3的水的水:甲甲醇溶液稀释至，配制成的对照品溶液醇溶液稀释至，配制成的对照品溶液3、色谱测试、色谱测试色谱条件：色谱条件：色谱仪色谱仪 岛津岛津LC-15C高效液相色谱高效液相色谱色谱柱色谱柱 C18柱（柱（5m，），）柱温柱温 室温室温流动相流动相 甲醇甲醇 水（水（ 70 30 ）流速流速 波长波长 272nm色谱操作步骤：色谱操作步骤：1、依次打开检测器、泵的开关、依次打开检测器、泵的开关2、打开电脑主机，打开操作界面、打开电脑主机，打开操作界面3、排气泡、排气泡4、设置色谱条件，打开泵开关、设置色谱条件，打开泵开关5、让流动相冲洗色谱系统，至色谱基线水平，约半小时、让流动相冲洗色谱系统，至色谱基线水平，约半小时6、基线调零，填写数据文件名及信息、基线调零，填写数据文件名及信息7、单次运行，进样并记录数据、单次运行，进样并记录数据8、数据处理及打印报告、数据处理及打印报告9、关氘灯，冲洗色谱系统约半小时，关机。、关氘灯，冲洗色谱系统约半小时，关机。1、实验目的、实验目的2、原理、原理3、步骤、步骤4、数据处理、数据处理5、结果讨论、结果讨论 实验结束后原始报告单要签字。实验结束后原始报告单要签字。 同一组的同学交实验报告的时候放在一起，原始报告单同一组的同学交实验报告的时候放在一起，原始报告单附在末尾。附在末尾。实验报告实验报告