陈陈 同同 生生荧光共振能量转移荧光共振能量转移Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)分子能级与荧光S0S1T1hn0hn1hn22. 荧光（荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。 4. 激发(Excitation, Ex)和发射(Emission, Em)光谱（Spectra):1. 能级（能级（ Energy Level）：）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级和转动。3. 磷光（磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。CFPEx. 440nmEx. 470nmEm. 470nmYFPEm. 535nm荧光共振能量转移(FRET)现象3. FRET现象的特征现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光1. 供体供体(Donor, D)Donor2. 受体受体(Acceptor, A)AcceptorFRET 原理(Principle)FRET的条件发生发生FRETFRET需要三个条件：需要三个条件：1 1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般大于谱必须有显著的重迭，一般大于 30 30；2 2、供体分子和受体分子间的距离必须在、供体分子和受体分子间的距离必须在 1 10 nm 1 10 nm 之间之间. D. D和和A A间的间的FRET FRET 效率：效率： 3 3、供体分子的发射态偶极矩与受体分、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件须满足一定的条件R0: E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数;R: 供体和受体分子间的距离.E: FRET效率. 对于R特别灵敏.举例: 假设 R0=5nm, 1） R=10nm, E=1.5%2） R=5nm, E=50%3） R=6nm, E=25% 450 500 550 600l (nm)D EmA Ex1)蛋白分子的共定位;2)蛋白分子聚合体;3)转录机制;4)转换途径;5)分子运动;6)蛋白折叠等生物学问题.FRET的应用的应用通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题:LaserLaserDAFRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位荧光标记利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略FRET技术应用二: 检测分子间的相互作用LaserLaserFRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887(b) BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED在FRET实验中经常使用的供体-受体荧光分子对2. 绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs)1.染料类(Dye)FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5参考阅读文献参考阅读文献1.Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:8999092.Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-13953.Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 6296334.Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997150025.Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:5996116. Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:13951398 思思 考考 题题2.你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。1. 为什么FRET效率对供体受体分子间的空间距离非常灵敏?3. A和B分子都不能发射荧光,要求采用FRET技术检测二者之间的相互作用特征,请问应该如何处理?论文题目：供体受体对之间R0定量分析与计算