植物组织培养植物组织培养Good Morning第第八八章章 植物脱毒技术植物脱毒技术一一. .病毒在植物体内的分布及危害；病毒在植物体内的分布及危害； 二二. .植物脱毒的意义植物脱毒的意义三三. .植物脱毒的原理和方法；植物脱毒的原理和方法； 四四. .植物脱毒苗的鉴定；植物脱毒苗的鉴定； 五五. .植物脱毒苗保存、应用与繁殖植物脱毒苗保存、应用与繁殖教学内容教学内容 目的目的与与要求：要求：l了解：了解：1、病毒在植物体内的分布及危害。、病毒在植物体内的分布及危害。 l理解理解：1、脱毒苗的意义；、脱毒苗的意义；l 2、植物脱毒苗的鉴定、保存、应用与繁殖。、植物脱毒苗的鉴定、保存、应用与繁殖。 l掌握掌握：1、无病毒苗概念；、无病毒苗概念；l 2、植物脱毒的原理和方法。、植物脱毒的原理和方法。l病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。度减产，甚至全株死亡。 l潜隐性病毒潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危侵染植物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危险。害，不易被发现，尤其危险。l国内外解决作物病虫害的有效途径是国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病培育无病毒苗毒苗，实施农作物无病毒化栽培。，实施农作物无病毒化栽培。无病毒苗无病毒苗 是指不含该种植物的主要是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应在植物内的存在表现阴性反应的苗木。的苗木。脱毒后的马铃薯苗脱毒后的马铃薯苗一一. .病毒在植物体内的危害及分布病毒在植物体内的危害及分布1.1.危害危害: 绝大多数绝大多数植物都可以无植物都可以无性繁殖的性繁殖的, , 容易受到多种病原容易受到多种病原菌的侵染菌的侵染, , 体内积累浓度相当高的病毒。体内积累浓度相当高的病毒。l在无在无性繁殖的种类中性繁殖的种类中，由于病毒通过营养体进行传，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。l病原菌的侵染不一定会病原菌的侵染不一定会造成造成植物的死亡植物的死亡, , 却会大大却会大大降低降低植物的生长发育及产量和质量植物的生长发育及产量和质量, ,从而影响其栽培从而影响其栽培的经济效益的经济效益。l因此因此, , 脱除病毒及其他病原脱除病毒及其他病原菌菌对对植物栽培植物栽培生产是非生产是非常必要的。常必要的。一一. .病毒在植物体内的危害及分布病毒在植物体内的危害及分布l2.2.分布分布l在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异和年龄而异。老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高根尖、茎尖生长点约根尖、茎尖生长点约0.11mm1mm区域内，几乎不含区域内，几乎不含病毒。（原因？）病毒。（原因？）( (原因：原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。) )二、植物脱毒的意义二、植物脱毒的意义 任何一种优良品种均需有一个任何一种优良品种均需有一个稳稳定定地保存其遗传性状的繁殖方法。地保存其遗传性状的繁殖方法。 离体无性繁殖可以很好地保持品离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。育的理想途径。1 1、能够有效地保持优良品种的特性、能够有效地保持优良品种的特性2、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用、快速繁殖品种，使优良品种迅速应用 离体繁殖周期短离体繁殖周期短 不受季节限制不受季节限制 繁殖系数高繁殖系数高 繁殖速度是任何其繁殖速度是任何其 他方法所不能比的他方法所不能比的 又称之为快繁又称之为快繁3、生产无病毒种苗，防止品种退化、生产无病毒种苗，防止品种退化受病毒危害严重的作物：受病毒危害严重的作物：大田作物：大田作物：马铃薯马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草、甘薯、甘蔗、烟草蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰4、节约耕地，提高农产品的商品率、节约耕地，提高农产品的商品率 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例：每年产品用留作种的比例： 大蒜：留种量占产量的五到八分之一大蒜：留种量占产量的五到八分之一 马铃薯：留种量占产量的十分之一马铃薯：留种量占产量的十分之一 贝母：留种量占产量的三分之一贝母：留种量占产量的三分之一(贝母：贝母：多年生草本植物多年生草本植物,其鳞茎供药用其鳞茎供药用,有止咳化痰、清热有止咳化痰、清热散结之功。产于四川、云南、陕西秦巴山区，甘肃等地散结之功。产于四川、云南、陕西秦巴山区，甘肃等地)5、便于运输、便于运输 常规的块根、块茎等，体细胞大、常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便。含水量高，包装、运输十分不便。 离体繁殖的种苗体积小，易携带，离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。运输十分方便。以马铃薯为例：以马铃薯为例： 按一亩地按一亩地4000株计算，常规薯株计算，常规薯4000个重个重200kg（每个（每个50g），若用试管薯），若用试管薯4000个则只有个则只有2kg（每个（每个0.5g）。）。三、植物脱毒的原理和方法三、植物脱毒的原理和方法（一）植物脱毒原理（一）植物脱毒原理：1）植物病毒本身不具有主动转移）植物病毒本身不具有主动转移的能力的能力。 在一个植物体内，病毒易于通过维管在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；茎尖；2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制；抑制了病毒的复制；3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖毒的增殖 。（二）（二）植物脱病毒方法植物脱病毒方法物理方法物理方法化学方法化学方法生物方法生物方法高温处理高温处理茎尖培养茎尖培养微体嫁接微体嫁接珠心培养珠心培养愈伤脱毒愈伤脱毒热处理脱毒热处理脱毒1.热处理脱毒法热处理脱毒法热处理脱毒原理热处理脱毒原理 病毒病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。一起复制。 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。热处理方法热处理方法（1）愈伤组织热处理）愈伤组织热处理 离体培养离体培养 愈伤组织愈伤组织 热处理继热处理继代代 分化培养。分化培养。 常用温度及时间：常用温度及时间：低温低温3738处理处理2周、周、4周或周或8周；高温周；高温50处理处理35min。（2）热空气处理脱毒法）热空气处理脱毒法 试验母株在高温生长室中生长一段时试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。养。 生长室温度生长室温度35-40 光照光照300010000 lx热处理的优缺点热处理的优缺点优点优点: 方法简单，效果明显。方法简单，效果明显。缺点缺点: 1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。状病毒（千日红病毒）无效。2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失枯死，造成损失3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。植物组织中的抗性因子而降低处理效果。其它效果其它效果香石竹（康乃馨）在香石竹（康乃馨）在3840下经两个下经两个月处理可除去全部病毒。月处理可除去全部病毒。马铃薯在马铃薯在37下处理下处理1020天能除去卷叶天能除去卷叶病毒。病毒。2.组织培养脱毒法组织培养脱毒法 包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒。毒、珠心组织培养脱毒。（1）微茎尖培养脱毒法）微茎尖培养脱毒法 脱毒效果好脱毒效果好 后代遗传稳定后代遗传稳定 使用最广泛的一种方法使用最广泛的一种方法1）原理及依据）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少 病毒病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争分子与细胞分裂蛋白质合成竞争2）操作程序）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。内进行培养，并及时观察和记录培养结果。茎尖培养l1 1）茎尖大小：）茎尖大小：一般以带一般以带1-21-2片叶原基为好，大小为片叶原基为好，大小为0.2-0.30.2-0.3毫米为宜，超过毫米为宜，超过0.50.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎尖存活率低）尖存活率低）l2 2）培养基：）培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。l3 3）前处理：）前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱毒效率。毒效率。l4 4）培养条件）培养条件：同一般茎尖培养：同一般茎尖培养l5 5）外植体生理状态：）外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取由活跃生长的芽上切取优缺点： 茎尖越小，去病毒机会茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求求就越高，对剥离技术要求也越高。也越高。2、愈伤组织培养脱毒法、愈伤组织培养脱毒法（1）原理及依据）原理及依据 a、病毒在植物体内分布不均匀、病毒在植物体内分布不均匀 b、病毒复制的能力衰退或丢失、病毒复制的能力衰退或丢失 c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异、继代培养的愈伤组织产生抗性变异（2）技术关键）技术关键 诱导再生植株的愈伤组织诱导再生植株的愈伤组织（3）操作程序）操作程序 植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。化芽，长成植株。 愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出现一些变异。现一些变异。（3）珠心组织培养脱毒法珠心组织培养脱毒法 病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。离体培养获得无病毒植株。 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。缺点：缺点： 会有会有20%30%左右的变异率，同时无毒苗左右的变异率，同时无毒苗苗期较苗期较长。柑橘要长。柑橘要68年才能结果。年才能结果。3.微体嫁接离体培养脱毒法微体嫁接离体培养脱毒法 应用微体嫁接的原因应用微体嫁接的原因：木本植物茎尖培养难以生根形成植株。木本植物茎尖培养难以生根形成植株。具体做法：具体做法： 将极小的茎尖（将极小的茎尖（0.14mm1.0mm）作为接穗嫁接到）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。起在培养基上培养。优点：优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。苗的可能性大。 微嫁接要求的微嫁接要求的剥离技术高剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小嫁接成活率与接穗大小呈正相关呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关微体嫁接法(micrografting)脱除病毒的关键：脱除病毒的关键： 要求剥离技术很高要求剥离技术很高 需要考虑砧木和接穗对营养需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求；组成的不同要求； 与接穗的取材季节有密切关与接穗的取材季节有密切关系（苹果系（苹果46月取材嫁接成月取材嫁接成活率较高。）活率较高。）四、植物脱毒苗的鉴定四、植物脱毒苗的鉴定1、视觉观察法、视觉观察法 (直接检测法直接检测法) 看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。番番茄茄无无菌菌小小苗苗厚厚叶叶莲莲花花掌掌植物病毒的症状植物病毒的症状l植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起外部症状主要有以下几种：上由病毒引起外部症状主要有以下几种：l（1 1）变色）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。l（2 2）坏死）坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑条纹条纹等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。l（3 3）畸形：）畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。l（4 4）萎蔫）萎蔫 ：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水不足所出现的凋萎现象。不足所出现的凋萎现象。2、生物鉴定法、生物鉴定法 (指示植物指示植物indicating Plant法法) 由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法嫁接接种的方法, 利用嫁接法接种，把待测的植物利用嫁接法接种，把待测的植物接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否接种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱除了病毒。脱除了病毒。指指示示植植物物接接穗穗嫁接后嫁接后的植物的植物指示植物指示植物indicating Plant法l定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植将一些对病毒敏感、症状特征显著的植物作为指示植物物作为指示植物(又叫鉴别寄主又叫鉴别寄主),利用病毒在其利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法.优点优点:方法简单方法简单灵敏灵敏准确准确擦方便擦方便,仍为一种经济仍为一种经济有效的方法有效的方法缺点缺点:枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能而只能测出相对的感染力测出相对的感染力3、电子显微镜鉴定法、电子显微镜鉴定法 小于小于0.1mm的病毒颗的病毒颗粒粒 用电子显微镜直接观用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检察经脱毒培养的叶片，检查是否有的病毒粒子存在，查是否有的病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、还可测量病毒颗粒的大小、形状和结构。形状和结构。较为先进的方法，但需一较为先进的方法，但需一定的设备和技术定的设备和技术4 4、抗血清鉴定法、抗血清鉴定法 利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类未知病毒的种类，常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸附法。附法。附法。附法。其中酶联免役吸附反应其中酶联免役吸附反应（ELISA）是常用的一种方法。是常用的一种方法。特点特点:特异性高特异性高测定速度快测定速度快l很常用l抗血清的基本原理抗血清的基本原理是通过植物病毒的抗是通过植物病毒的抗原与抗体的专化结原与抗体的专化结合合, , 形成可见形成可见反反应而应而加以判断加以判断。由于植物病毒抗血清具有高由于植物病毒抗血清具有高度的专化性度的专化性, , 受体植物受体植物无无论显、隐症论显、隐症, , 无论是无论是何何种传播介质种传播介质, , 均可通过抗血清均可通过抗血清反应法准确判断病毒的存在与否反应法准确判断病毒的存在与否, , 进行进行病毒的快速诊断。病毒的快速诊断。五、无病毒种苗的保存、应用及繁殖五、无病毒种苗的保存、应用及繁殖（一）无病毒原种的保存（一）无病毒原种的保存 获得无毒原种不易，若保存不好会很快重获得无毒原种不易，若保存不好会很快重新感染病毒。为防止再度感染，应在新感染病毒。为防止再度感染，应在隔离条件隔离条件下保存。下保存。 若原种保存得好，无毒原种可以利用若原种保存得好，无毒原种可以利用5-10年年，在生产上可以创造更多的经济效益。在生产上可以创造更多的经济效益。1、隔离种植保存、隔离种植保存 通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保存。植物病毒的传播媒介主要是昆虫如蚜虫、叶蝉存。植物病毒的传播媒介主要是昆虫如蚜虫、叶蝉2、离体保存、离体保存 脱毒苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于脱毒苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。（二）无毒原种的应用（二）无毒原种的应用 获得无毒原种后，一方面要积极进行无获得无毒原种后，一方面要积极进行无毒苗的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁毒苗的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁育。育。 无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才能取得良好的效果；在老病区使用时应实行统能取得良好的效果；在老病区使用时应实行统一的防治措施，一次性全区换种，才能取得应一的防治措施，一次性全区换种，才能取得应有的效果。有的效果。（三）无病毒原种的繁殖（三）无病毒原种的繁殖 可在无毒源和其他病虫害的大田可在无毒源和其他病虫害的大田中进行，场地土壤要进行消毒，防治中进行，场地土壤要进行消毒，防治蚜虫、线虫和其他传毒媒介，并建立蚜虫、线虫和其他传毒媒介，并建立一套严格的原种繁育制度和栽培管理一套严格的原种繁育制度和栽培管理制度，防止病毒的再次感染。制度，防止病毒的再次感染。离体繁殖的使用范围离体繁殖的使用范围1.用于加速某些用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要加速繁殖的或某些需要加速繁殖的特殊基因型特殊基因型，如名贵花，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等。卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等。用于自然繁殖极用于自然繁殖极易感染病毒易感染病毒的植物，如马铃薯、的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等用于用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等，如非洲菊、花竹、紫罗兰等本章小结本章小结l(1)去除植物病毒的方法去除植物病毒的方法有热处理法、微茎尖培养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法。前两种是主要方法。l(2)热处理法热处理法:为温汤浸渍处理法和热处理法。其中后者因不损伤植物材料，因而是目前最为常用的方法。l(3)病毒主要分布病毒主要分布于植物体成熟和衰老的组织及器官中，靠维管束传播。由于茎尖尚未形成维管束，所以茎尖一般是无毒的，可用于组织培养无毒苗。 l(4)无毒苗的鉴定方法无毒苗的鉴定方法主要有：指示植物鉴定法；抗血清鉴定法；电子显微镜检查法；酶联免疫鉴定法。其中，最后-种是目前比较精确和常用的鉴定方法。