流行性脑脊髓膜炎实验室诊断 天津市卫生防病中心病原生物学部 井良义何谓流行性脑脊髓膜炎？流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitides，Nm）通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患者以儿童为多见，现在成年人发病有增多趋势。人受Nm感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者。正常人群中Nm带菌率可达530%。，带菌者为流脑流行的重要传染源。细菌经飞沫传播，患者潜伏期14天，其发展经过可分为三期：1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时局部有炎症。2.少数细菌侵入血流，造成单纯菌血症，可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症状。适宜的检测样品鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、血清及脑脊液等。其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为确诊依据。样品采集与运送样品采集与运送 样品采集（一）样品采集（一） 脑脊液：无菌操作，吸出CSF35mL，立即放到无菌试管内离心(20003000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于20待测)，5二氧化碳环境37培养2472h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。样品采集（二）样品采集（二）血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20待测)，同上述条件培养2472h，每日进行分离培养。样品采集（三）样品采集（三）淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌812h后分离培养或直接接种10羊血巧克力色琼脂；涂片，干后革兰染色，直接镜检。样品采集（四）样品采集（四）咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养基或巧克力双抗平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌8 12h后分离培养。咽拭子接种咽拭子接种不合格咽拭子接种不合格咽拭子接种样品的处理和运送样品的处理和运送 早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的检出水平。及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接种培养。保温运送：应尽可能保持样品处于2036之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。流脑病原学检查方法流脑病原学检查方法 生长特性脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需510%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37。菌落特征及菌体形态菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%CO2，37培养24小时后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.80.6大小。常成对排列，邻近两边扁平凹陷菌 落 特 征菌 落 特 征脑 脊 液 涂 片 生化特征 分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分离蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性血清分群鉴定 检查从病人分离的疑似Nm时，先用多价、多价、多价抗血清检测，如果阳性再用分群血清（A群、B群、C群、W135群抗血清等）检测。不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血清分群。菌种保存菌种保存 短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保存，可保存7天。2长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。所有的细菌都可在-70冰箱中冷冻保存。将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳培养箱中3537孵育1820小时，收集细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。-70低温冰箱分类保存。流脑血清学检查方法（一）流脑血清学检查方法（一） 玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。Nm诊断血清：国产售品有多价（包含A、B、C、D群），多价含1889（Y）、1890（H）、1892（29E），多价含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群及各群单价血清，共计14种。（括号内为国际编码）流脑血清学检查方法（二）流脑血清学检查方法（二）酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中抗A群流脑IgG的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。流脑血清学检查方法（三）流脑血清学检查方法（三）杀菌力试验：应用微量杀菌力试验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。流脑其它检查方法（一）流脑其它检查方法（一）胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公司的试剂盒）。方法：一滴乳胶试剂（30l）加上一滴病人的脑脊液，涂匀，在2分钟内出现明显凝集者为阳性。流脑其它检查方法（二）流脑其它检查方法（二）PCR检测：应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。培养基制备培养基制备巧克力色血液琼脂：成份：营养琼脂（pH7.6）100ml脱纤维血510ml制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入羊血，摇匀。置水浴锅内，维持在902030min。待培养基冷至50时才倾注平板。如做病人密切接触者或健康人群带菌调查时，则需加双抗，每1000ml培养基加入多粘菌素4.2mg（或2.5万单位），万古霉素3.3mg。卵黄盐水将新鲜鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈乳状分装试管，56加温30min，置37作无菌试验。（脑膜炎双球菌保菌用）增菌肉汤成份：新鲜牛肉汤100ml葡萄糖0.5g配制：混合上述成份，调pH至7.47.6分装试管，2ml/管或30ml/瓶，高压灭菌10磅10分钟，无菌检验合格后供增菌用。诊断试剂诊断试剂1、诊断血清：中国CDC传控所呼吸道细菌室流脑组（北京昌平流字五号）或中国药品生物制品检定所（天坛西里2号）。2、巧克力平板：自制或市售。3、多粘菌素或万古霉素：北京陆桥技术有限责任公司有售。4、胶乳凝集试剂盒：法国梅里埃公司有乳胶凝集法脑膜炎检测试剂盒。可测定A群、B群及C群流脑，所用材料为病人脑脊液。谢谢2006.08.23