1影响免疫功能药物药理研究方法影响免疫功能药物药理研究方法中药药理教研室中药药理教研室 洪敏洪敏唐仲英科技楼唐仲英科技楼406 Tel：15805191595Email:hongmin72126.com2第一节第一节 概述概述一、免疫学研究概况一、免疫学研究概况 免疫学的免疫学的3个时期：个时期： 经验免疫期经验免疫期 科学免疫期科学免疫期 现代免疫期现代免疫期3经验免疫学时期经验免疫学时期 中国明代，正式记载接种中国明代，正式记载接种“人痘人痘”，预防天，预防天花花 1818世纪中叶，英国医生世纪中叶，英国医生Edward Edward Jenner Jenner 种牛痘预防天花种牛痘预防天花 目前，通过全球性大面积疫苗接种我目前，通过全球性大面积疫苗接种我们已经消灭了天花病毒们已经消灭了天花病毒 45 科学免疫学时期科学免疫学时期 病原菌的发现与疫苗使用的推广病原菌的发现与疫苗使用的推广 1919世纪中叶，显微镜的改进使人们可在镜下直接观察到细菌，世纪中叶，显微镜的改进使人们可在镜下直接观察到细菌，导致病原菌的发现。导致病原菌的发现。 18501850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽杆菌。年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽杆菌。 PasteurPasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染致病，并且发明了液体培养基，以培养细菌。致病，并且发明了液体培养基，以培养细菌。 KochKoch发明固体培养基，分离培养结核杆菌成功，提发明固体培养基，分离培养结核杆菌成功，提出病原菌致病的概念。出病原菌致病的概念。Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel Prize in 1901 for demonstrating that circulating antitoxins against diphtheria（白喉）白喉）and tetanus（破伤风）破伤风）toxins conferred immunity. Louis Pasteur 1822-1895, Father of immunology, attenuated bacteria and viruses as vaccine against anthrax（炭炭疽）疽）.Edward Jenner 1749-1822Successful vaccination against smallpox（天花）（天花）Robert Koch 1843-1910, Nobel Prize in 1905 for his work on tuberculosis（肺结核）（肺结核）, Anthrax（炭疽）（炭疽）, Cholera（霍乱）（霍乱）, Tubercule bacillus（结核杆菌）（结核杆菌）8科学免疫学时期的重要成就科学免疫学时期的重要成就u 减毒疫苗的发明减毒疫苗的发明 u 抗毒素的发现抗毒素的发现 u 补体的发现补体的发现 u 血清学方法的建立血清学方法的建立 u 免疫化学的研究免疫化学的研究 现代免疫学时期现代免疫学时期u 免疫应答细胞和免疫应答细胞和T T细胞亚类的发现细胞亚类的发现u 免疫网络学说的提出免疫网络学说的提出u 抗体生成克隆选择学说抗体生成克隆选择学说的提出的提出u 细胞因子研究进展细胞因子研究进展u 免疫学技术的发展（免疫标记技术）免疫学技术的发展（免疫标记技术）u 免疫耐受现象的发现免疫耐受现象的发现 Clonal Selection Theory（ Burnet学说学说, 1960年诺贝尔奖年诺贝尔奖）l体内存有能识别各种抗原的细胞克隆体内存有能识别各种抗原的细胞克隆(clone)(clone)，每一细胞表，每一细胞表面均有对特定抗原的受体，能与相应抗原结合而识别它们。面均有对特定抗原的受体，能与相应抗原结合而识别它们。l抗原的作用在于选择与其相应的细胞克隆与其受体结合后，抗原的作用在于选择与其相应的细胞克隆与其受体结合后，引起细胞的增殖分化，产生免疫应答。引起细胞的增殖分化，产生免疫应答。l 胎生期免疫细胞与自己抗原相接触形成天然自身耐受状态胎生期免疫细胞与自己抗原相接触形成天然自身耐受状态（禁忌细胞系）（禁忌细胞系）l 免疫细胞系可突变产生与自己抗原发生反应的细胞系可形免疫细胞系可突变产生与自己抗原发生反应的细胞系可形成自身免疫反应成自身免疫反应 此学说对此学说对免疫学中的根本问题免疫学中的根本问题自我识别自我识别有了比较满意的有了比较满意的解释，对免疫学中的其他重要问题，诸如免疫记忆、免疫耐解释，对免疫学中的其他重要问题，诸如免疫记忆、免疫耐受性、自身免疫性等现象也能作出恰当的说明，因此被人们受性、自身免疫性等现象也能作出恰当的说明，因此被人们广为接受，成为广为接受，成为现代免疫学的理论基础现代免疫学的理论基础。 1112 研究进展研究进展1.1.抗原识别受体多样性的产生抗原识别受体多样性的产生2.2.信号转导途径的发现信号转导途径的发现3.3.细胞程序性死亡途径的发现细胞程序性死亡途径的发现4.4.造血与免疫细胞的发育造血与免疫细胞的发育5.5.应用免疫学的发展应用免疫学的发展 (1)DNA(1)DNA疫苗疫苗 (2)(2)基因工程制备重组细胞因子基因工程制备重组细胞因子 (3)(3)免疫细胞治疗免疫细胞治疗 (4)(4)完全人源抗体完全人源抗体 (5)(5)口服自身抗原口服自身抗原, ,预防自身免疫病预防自身免疫病13二、免疫功能的病理生理及免疫功能的调节二、免疫功能的病理生理及免疫功能的调节 免疫应答：免疫应答：是机体借助理化屏障及神经体液调节控制，是机体借助理化屏障及神经体液调节控制，通过免疫细胞及有关的体液因子（通过免疫细胞及有关的体液因子（抗体抗体or淋巴因子等淋巴因子等）发挥）发挥识别自己、排除异己，以维持机体内外环境统一的一种功能。识别自己、排除异己，以维持机体内外环境统一的一种功能。 非特异性免疫应答：非特异性免疫应答：是机体防御异物进入机体以及对进是机体防御异物进入机体以及对进入体内异物的清除作用，是机体与生俱来的免疫功能。入体内异物的清除作用，是机体与生俱来的免疫功能。 特异性免疫应答：特异性免疫应答：是机体发育过程中接触抗原后发展而是机体发育过程中接触抗原后发展而成的免疫力，包括体液免疫和细胞免疫。成的免疫力，包括体液免疫和细胞免疫。14免疫应答的免疫应答的3个阶段：个阶段： （1 1）感应期感应期 抗原进入机体后，多数由单核抗原进入机体后，多数由单核巨噬细胞摄取与加工，再将抗原信息传递给巨噬细胞摄取与加工，再将抗原信息传递给T T、B B淋淋巴细胞，使之能特异性地识别抗原。巴细胞，使之能特异性地识别抗原。 （2 2）增殖分化期增殖分化期 抗原激活抗原激活淋巴细胞淋巴细胞TT、B B淋巴细胞淋巴细胞致敏淋巴细胞、浆细胞。致敏淋巴细胞、浆细胞。 （3 3）效应期效应期 再次遇到抗原再次遇到抗原致敏淋巴细致敏淋巴细胞、抗体胞、抗体细胞免疫、体液免疫。细胞免疫、体液免疫。15161819免疫病理与免疫性疾病免疫病理与免疫性疾病按发病机制不同按发病机制不同, ,免疫性疾病分为：免疫性疾病分为： 超敏反应性疾病超敏反应性疾病 免疫缺陷病免疫缺陷病：先天性及继发型免疫缺陷病：先天性及继发型免疫缺陷病 自身免疫病自身免疫病：类风湿性关节，系统性红斑狼疮：类风湿性关节，系统性红斑狼疮, ,干燥干燥 综合征综合征, ,多发性硬化多发性硬化 移植排斥和移植物抗宿主反应移植排斥和移植物抗宿主反应速发型：由抗体介导，速发型：由抗体介导， 发作快发作快 如：哮喘、荨麻疹等如：哮喘、荨麻疹等 迟发型：由细胞免疫介导，发作慢迟发型：由细胞免疫介导，发作慢 见于结核病、接触性皮炎见于结核病、接触性皮炎22三、研究的基本要求三、研究的基本要求（一）动物的选择（一）动物的选择 由于免疫反应和基因类型有关，尽可能用由于免疫反应和基因类型有关，尽可能用纯系纯系动物。如纯系小鼠和大鼠，并控制鼠龄、动物。如纯系小鼠和大鼠，并控制鼠龄、性别和体重，以减少个体差异。若用杂种动性别和体重，以减少个体差异。若用杂种动物，最好用物，最好用同窝同窝动物。动物。23（二）（二） 动物模型动物模型 1、模型特点和要求、模型特点和要求 （1）正常正常实验动物实验动物 （2）免疫功能）免疫功能低下低下的动物模型的动物模型（肿瘤、衰老、肿瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下慢性病均可造成免疫功能低下） 免疫抑制剂造模（免疫抑制剂造模（如环磷酰胺、氢化可如环磷酰胺、氢化可的松、环孢霉素的松、环孢霉素A A） 辐射引起免疫功能低下动物模辐射引起免疫功能低下动物模型型 24常用的免疫抑制剂常用的免疫抑制剂 1. 1. 环磷酰胺环磷酰胺：8080100mg/kg100mg/kg，ScSc，5 5天后免疫功天后免疫功能显著降低。能显著降低。 2. 2. 氢化可的松氢化可的松：5050100mg/kg100mg/kg，ScSc，6 68 8天后免疫功能显著降低。天后免疫功能显著降低。 3. 3. 抗淋巴细胞血清抗淋巴细胞血清（ALSALS）:ip 0.2ml:ip 0.2ml，5 56 6天后免疫功能显著降低。天后免疫功能显著降低。 4. 4. 6060CoCo或或X X射线射线600600800800拉德照射拉德照射1 1次，次，4 4日后免疫功能显著降低，动物存活时间显著缩短。日后免疫功能显著降低，动物存活时间显著缩短。25（3）免疫缺陷免疫缺陷动物动物 NudeNude小鼠小鼠：该小鼠先天性无胸腺，细胞免疫力低下，失去正常T细胞功能。但其B淋巴细胞功能基本正常。BALB/cnu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu ScidScid小鼠小鼠：即重度联合免疫缺陷小鼠。Scid 小鼠外观与普通小鼠差别不大，有毛，被毛白色，体重发育正常。但胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的30%，组织学上表现为淋巴细胞显著缺陷。 BALB/c-Scid 26（4）自身免疫性疾病自身免疫性疾病模型： 类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化症 （5）过敏性疾病过敏性疾病模型： 哮喘，过敏性鼻炎，接触性皮炎等27 佐剂性关节炎模型佐剂性关节炎模型是免疫性关节炎动物模型的基本方法。造模多采用大鼠, 足跖部皮下注射法, 原发病变主要表现为致炎局部的炎症反应, 续发病变一般于致炎后10-20天左右出现, 20天左右达到高峰, 病理改变为滑膜下组织炎症, 滑膜增生, 血管翳形成, 软骨破坏, 4周后, 关节红肿减退, 骨质减少, 新骨形成, 关节间隙变窄, 形成不可逆的关节改变。AA大鼠的关节组织病理学及血中变化与人相似, 同时, 对其免疫学机制研究发现, 此模型存在明显的细胞免疫异常。28II 型胶原诱导的关节炎模型型胶原诱导的关节炎模型II 型胶原+完全弗氏佐剂, 乳化制成乳剂, 将该乳剂于小鼠的尾根部皮内注射致炎, 腹腔注射乳剂作为激发注射。表现为多发性外周关节炎, 关节局部红肿, 严重致关节畸形, 病理变化为增生性滑膜炎, 关节软骨破坏, 骨侵蚀, 关节腔内有炎性细胞浸润, 体内可检出针对自身型胶原的高滴度的IgG抗体, 这些临床表现及实验室指标与人密切相关。不出现病情的波动和复发情况, 也没有的皮下结节, 浆膜炎, 血管炎等表现,不出现类风湿因子及抗核抗体29卵蛋白诱导的关节炎模型卵蛋白诱导的关节炎模型卵蛋白+福氏佐剂混匀, 注入动物背部皮下, 致敏, 末次注射后一周于关节内注入溶解的卵蛋白, 24小时内此关节出现红肿热痛等急性炎症的表现, 发病率达100%。卵蛋白诱导的关节炎模型的病理改变有滑膜增生、血管翳形成和软骨及骨破坏。第一阶段为关节内注入抗原后, 24小时出现关节肿胀, 关节直径增加, 病理表现为急性滑膜炎。第二阶段为1-4周, 关节滑膜明显增生, 血管翳形成。滑膜细胞以单核细胞、巨噬细胞为主,其次为淋巴细胞, 以CD4+淋巴细胞多见, 这一阶段部分动物可出现早期软骨破坏。第三阶段在4周后, 不可逆的关节软骨及骨破坏出现,最后可出现骨变形。最长的观察到6个月, 慢性炎症仍存在, 证明卵蛋白诱导的关节炎模型与在发病机理上的某些类似。302、观察指标、观察指标 （1）非特异性免疫非特异性免疫功能的测定指标功能的测定指标 （2）体液免疫体液免疫功能的测定指标功能的测定指标 （3）细胞免疫细胞免疫功能的测定指标功能的测定指标3、给药途径和剂量、给药途径和剂量4、对照实验、对照实验31（1）组间对照标准品对照组弱阳性对照组（2）自身对照（3）配对对照对照组阴性对照组空白对照组假处理对照组阳性对照组32第二节第二节 实验方法实验方法一、影响非特异性免疫功能实验一、影响非特异性免疫功能实验（一）碳粒廓清法（一）碳粒廓清法【基本原理基本原理】 网状内皮系统（网状内皮系统（RESRES）是机体最主要的防御系统，）是机体最主要的防御系统，具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物质。质。 当静脉注入当静脉注入特定大小特定大小的的惰性惰性颗粒后，它即可被颗粒后，它即可被RESRES细胞迅速吞噬而从血流中廓清，因此，可借助测细胞迅速吞噬而从血流中廓清，因此，可借助测定定血流中炭粒的消失速度血流中炭粒的消失速度来反映来反映RESRES吞噬异物的能力。吞噬异物的能力。33【实验步骤实验步骤】（1）取小鼠，随机分组，给药。）取小鼠，随机分组，给药。（2）末次给药后）末次给药后30min，每鼠，每鼠iv印度墨汁印度墨汁0.050.1ml/10g体重。体重。（3）于）于1min（t1）和）和5min（t5）后，每鼠眼）后，每鼠眼眶静脉眶静脉取血取血20m ml，加到，加到2ml 0.1%NaCO3溶液溶液中摇匀。中摇匀。（4）测测OD680nm，计算廓清指数（，计算廓清指数（K）、吞）、吞噬指数。噬指数。34 廓清指数廓清指数K K 吞噬指数吞噬指数 即校正廓清指数即校正廓清指数 35【注意事项注意事项】 （1 1）印度墨汁应用）印度墨汁应用NSNS稀释稀释1 15 5倍左右，最好经倍左右，最好经超声超声处理后处理后离心离心，弃去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛，弃去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛细血管，引起动物猝死。细血管，引起动物猝死。 印度墨汁的质量可影响测定结果的准确性，墨印度墨汁的质量可影响测定结果的准确性，墨汁颗粒大小有严格要求，汁颗粒大小有严格要求，过大则不被吞噬，过小则被过大则不被吞噬，过小则被其他吞噬细胞吞噬，其他吞噬细胞吞噬，如小吞噬细胞。印度墨汁因颗粒如小吞噬细胞。印度墨汁因颗粒大小均匀，能特异性地被单核巨噬细胞所吞噬，因而大小均匀，能特异性地被单核巨噬细胞所吞噬，因而适用于本实验。适用于本实验。 （2 2）iviv要熟练，要熟练，印度墨汁的剂量、取血时间印度墨汁的剂量、取血时间必须必须准确无误。另外，取血的时间间隔也可延长至准确无误。另外，取血的时间间隔也可延长至1010分钟。分钟。36【评价评价】 印度墨汁法测定印度墨汁法测定RESRES吞噬活性是吞噬活性是最经典最经典的一种的一种免疫学研究方法，实验条件要求不高，方法简便，免疫学研究方法，实验条件要求不高，方法简便，结果可靠，重现性好。结果可靠，重现性好。 若再配合小鼠腹腔若再配合小鼠腹腔巨噬细胞吞噬消化鸡红血巨噬细胞吞噬消化鸡红血球球实验及实验及白细胞游走白细胞游走实验，则可较全面地反映单核实验，则可较全面地反映单核巨噬细胞系统清除异物功能状态。巨噬细胞系统清除异物功能状态。37（二）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法（二）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法【基本原理基本原理】 MM具有强大的吞噬能力，鸡红细胞对鼠类是一具有强大的吞噬能力，鸡红细胞对鼠类是一种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔引起腹腔MM聚集并吞噬，注入定量鸡红细胞聚集并吞噬，注入定量鸡红细胞（CRBCCRBC），隔一定时间后，吸取腹腔），隔一定时间后，吸取腹腔MM，镜检其吞镜检其吞噬活性噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指数的高低表示，并以吞噬百分率及吞噬指数的高低表示MM吞噬能力的大小。吞噬能力的大小。38【实验步骤实验步骤】 （1）取）取1822g小鼠，雌雄各半，随机分组。小鼠，雌雄各半，随机分组。 （2）若筛选免疫抑制药，预先用）若筛选免疫抑制药，预先用M诱导剂诱导剂，可在，可在实验前实验前34天，天，ip0.5淀粉淀粉生理盐水溶液，每鼠生理盐水溶液，每鼠0.5ml。 （3）4天后，天后，ip，5 CRBC 0.5ml。812h后脱后脱颈椎处死小鼠，颈椎处死小鼠，ip2ml NS，轻揉腹部，轻揉腹部1min，然后，然后吸吸出洗液出洗液1ml，分滴于两片载玻片上，放入垫有湿纱布，分滴于两片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置的搪瓷盒内，移置37孵箱孵箱温育温育30min。 （4）用）用NS漂洗，除去未粘片的细胞。晾干，漂洗，除去未粘片的细胞。晾干，1 1丙丙酮甲醇溶液酮甲醇溶液固定固定5min。4（V/V）Giemsa磷酸磷酸缓冲液缓冲液染色染色3min，用流水冲洗、晾干，用流水冲洗、晾干，镜检镜检。39【结果判定结果判定】 油镜下计每片油镜下计每片200200个个MM，计算吞噬百分，计算吞噬百分率、吞噬指数。率、吞噬指数。吞噬百分率吞噬百分率 100100 吞噬指数吞噬指数 2 240CRBC被消化的程度，通常分被消化的程度，通常分4级：级： 级：级：未消化。未消化。CRBCCRBC完整，胞质浅红或浅黄带绿完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核呈浅紫红色。色，胞核呈浅紫红色。 级：级：轻度消化。轻度消化。胞质浅黄绿色，胞核固缩呈胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。紫蓝色。 级：级：重度消化。重度消化。胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。 级：级：完全消化。完全消化。MM内仅见形态类似内仅见形态类似CRBCCRBC大小大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。41【注意事项注意事项】 （1 1）实验各步骤均需保持）实验各步骤均需保持无菌操作无菌操作。MM诱导剂诱导剂仅用于免疫抑制药研究。仅用于免疫抑制药研究。 （2 2）若滴片）若滴片染色染色过深，可用过深，可用1%HCl1%HCl脱色，过浅则脱色，过浅则可复染。可复染。 （3 3）每鼠）每鼠两片的计数两片的计数应基本一致，若差距过大，应基本一致，若差距过大，应予淘汰。腹腔吸出的液体若有血性渗出时，则应予淘汰。腹腔吸出的液体若有血性渗出时，则不宜使用。不宜使用。 42（4 4）掌握好）掌握好实验时间实验时间，时间太短，吞噬鸡红细胞较，时间太短，吞噬鸡红细胞较少，过长则鸡红细胞已被消化。少，过长则鸡红细胞已被消化。 （5 5）避免腹腔注射受试药物避免腹腔注射受试药物，以免干扰实验结果。，以免干扰实验结果。【评价评价】 本法简便，但操作慢而欠精确，可配合其本法简便，但操作慢而欠精确，可配合其他方法进行综合分析。他方法进行综合分析。43（三）巨噬细胞吞噬作用的化学发光测定法（三）巨噬细胞吞噬作用的化学发光测定法【基本原理基本原理】 化学反应中电子化学反应中电子激发态激发态产物，在其回到产物，在其回到基态基态过程过程中，以光的形式释放能量中，以光的形式释放能量oror将能量转移到另一分子将能量转移到另一分子而发射光子，利用而发射光子，利用发光检测仪发光检测仪测定发射光的强度测定发射光的强度oror速度，即可计算发光物质速度，即可计算发光物质oror发光物质标记的抗原发光物质标记的抗原oror抗体的含量。测定发光强度的方法，即光子计数法，抗体的含量。测定发光强度的方法，即光子计数法，可用可用液体闪烁仪液体闪烁仪进行测定。进行测定。 44 M M吞噬颗粒吞噬颗粒oror受其他生物与化学因子刺受其他生物与化学因子刺激后，细胞代谢猛增，其特征是激后，细胞代谢猛增，其特征是耗氧量增加耗氧量增加，产生产生大量自由基大量自由基（氧负离子、过氧化氢、羟（氧负离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧），同时，往往伴有自由基、单线态氧），同时，往往伴有化学化学发光发光现象，但十分微弱，难以检测。若在体现象，但十分微弱，难以检测。若在体系中加入系中加入鲁米诺鲁米诺等等发光增强剂发光增强剂，就能增强发，就能增强发光强度，因为氧化剂激发鲁米诺，可发出光强度，因为氧化剂激发鲁米诺，可发出425nm425nm的光，易被检测到。的光，易被检测到。45【操作步骤操作步骤】 （1）用）用HBSS将将M调整至调整至2106个个/ml的的细胞悬液细胞悬液备备用。用。 （2）取细胞悬液）取细胞悬液1ml，置聚乙烯小管中，加入，置聚乙烯小管中，加入10-4M鲁米诺鲁米诺200m ml，将小管放入液闪测量瓶中，测定发光，将小管放入液闪测量瓶中，测定发光6秒钟，作为本底。秒钟，作为本底。 （3）加入）加入调理调理的的酵母多糖酵母多糖200m200ml，摇匀，即刻测发，摇匀，即刻测发光光6秒钟，以后每隔秒钟，以后每隔35min测一次发光，直至加酵测一次发光，直至加酵母多糖母多糖1h。 （4）以发光强度（）以发光强度（cpm）为纵坐标，加酵母多糖后）为纵坐标，加酵母多糖后的时间为横坐标，绘制的时间为横坐标，绘制M吞噬发光的动力曲线。比吞噬发光的动力曲线。比较各组的峰高、峰时（峰高的时间）、发光积分值及较各组的峰高、峰时（峰高的时间）、发光积分值及早期曲线斜率的变化。早期曲线斜率的变化。46【注意事项注意事项】 （1）注意无菌操作。所用试管、滴管、缓冲液等）注意无菌操作。所用试管、滴管、缓冲液等均需高压灭菌，应在超净台内操作，避免污染。均需高压灭菌，应在超净台内操作，避免污染。 （2）用台盼蓝染色，）用台盼蓝染色，M活力应在活力应在90以上。以上。 （3）所用药物应能完全溶解，悬浮的微粒将会影）所用药物应能完全溶解，悬浮的微粒将会影响响M的反应性。的反应性。 （4）小试管与测量瓶先置暗室）小试管与测量瓶先置暗室24h，整个操作系，整个操作系统均在暗室进行。统均在暗室进行。47【方法评价方法评价】 （1）本法也可检测）本法也可检测M氧代谢功能与血清调氧代谢功能与血清调理作用，故作为检测吞噬功能的指标的专一理作用，故作为检测吞噬功能的指标的专一性不够。性不够。 （2）因液闪仪无温控装置，不能使反应系）因液闪仪无温控装置，不能使反应系统达到统达到37，只能通过恒定的室温（，只能通过恒定的室温（251）与水浴与水浴37进行间接控制。进行间接控制。48（四）溶菌酶测定法（四）溶菌酶测定法【基本原理基本原理】 溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、痰、鼻涕、液、痰、鼻涕、WBCWBC、血清等。测定它在体液、血清等。测定它在体液oror分分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能的一个指标。防御功能的一个指标。 体液和分泌物中的溶菌酶活性，可通过检查体液和分泌物中的溶菌酶活性，可通过检查其对指定其对指定敏感菌株敏感菌株的裂解作用来进行测定。的裂解作用来进行测定。492种测定法：种测定法：（1 1）光学测定法：）光学测定法：将检品与菌液混合，用分将检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数。分数。（2 2）平板打孔测定法：）平板打孔测定法：在混有菌液的琼脂凝在混有菌液的琼脂凝胶上打孔，检品放在孔内，一定时间后测胶上打孔，检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环直径。定溶菌环直径。50二、影响特异性体液免疫功能的实验方法二、影响特异性体液免疫功能的实验方法（一）血清溶血素测定法（一）血清溶血素测定法【基本原理基本原理】 经经SRBCSRBC免疫动物的淋巴细胞可产生抗免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBCSRBC抗体抗体（溶血素溶血素），并释放至外周血。这种抗体在试管内），并释放至外周血。这种抗体在试管内与与SRBCSRBC温育，在补体（温育，在补体（正常血清中的一组酶蛋白，正常血清中的一组酶蛋白，具有溶解和杀伤细胞，增强吞噬等作用具有溶解和杀伤细胞，增强吞噬等作用）参与下可）参与下可产生溶血反应，通过测定产生溶血反应，通过测定血红蛋白的释放量血红蛋白的释放量多少来多少来间接测出血清中溶血素的含量。间接测出血清中溶血素的含量。 血红蛋白与血红蛋白与都氏试剂都氏试剂反应形成反应形成氰化血红蛋白氰化血红蛋白后比色测定。后比色测定。51【操作步骤操作步骤】 （1）免疫：免疫：小鼠，小鼠，ip 20SRBC 0.2ml/天，天，第第4天取血、分离血清，将血清稀释后供测定天取血、分离血清，将血清稀释后供测定（一般（一般500倍以上）。倍以上）。 （2）溶血反应：溶血反应：在试管内依次加入在试管内依次加入血清血清1ml、5SRBC 0.5ml、10补体补体1ml，置，置37水浴水浴30min，然后移至冰浴中终止反应，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心离心5min，取上清，取上清1ml，加都氏液，加都氏液3ml，摇匀，摇匀放置放置10min，测，测OD540nm。 52（3 3）SRBCSRBC半数溶血值半数溶血值：取：取5 5SRBC 0.25mlSRBC 0.25ml加都加都氏液氏液4ml4ml，测，测ODOD540nm540nm。 （4 4）计算：计算：样品管半数溶血值样品管半数溶血值HCHC5050： 每只鼠的血清每只鼠的血清 HCHC5050 稀释倍数稀释倍数53【评价评价】 （1 1）简单易行，快速，重复性好。测定）简单易行，快速，重复性好。测定HCHC5050较准确，客观，可克服溶血空斑法用肉眼较准确，客观，可克服溶血空斑法用肉眼计数的错误。计数的错误。 （2 2）本实验用）本实验用615615纯种小鼠测出的数据比纯种小鼠测出的数据比较稳定，重现性好。较稳定，重现性好。54（二）抗体形成细胞测定法（二）抗体形成细胞测定法（PFC）1 溶血空斑试验（溶血空斑试验（haemolytic plaque assay，HPA）【基本原理基本原理】 PFCPFC是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。将的方法。将SRBCSRBC免疫的小鼠脾细胞、免疫的小鼠脾细胞、SRBCSRBC、补体混合、补体混合于琼脂内，抗体形成细胞分泌的抗体在补体的参与下，于琼脂内，抗体形成细胞分泌的抗体在补体的参与下，使其周围的使其周围的SRBCSRBC的溶解形成肉眼可见的溶血空斑，这的溶解形成肉眼可见的溶血空斑，这种溶血空斑大体上可以反映抗体形成细胞数。种溶血空斑大体上可以反映抗体形成细胞数。 方法：琼脂固相法（平皿法）：常用。方法：琼脂固相法（平皿法）：常用。 液相单层细胞法（玻片法）：很少液相单层细胞法（玻片法）：很少使用。使用。56直接溶血空斑试验直接溶血空斑试验: :测定测定产生产生 IgM IgM 型抗体型抗体的细胞的细胞。因为活化补体的能力强，只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。间接溶血空斑试验间接溶血空斑试验: : 产生其他类型抗体的产生其他类型抗体的（如（如 IgG IgG 或或 IgA IgA 等）细胞等）细胞检测，检测，需要加靶细胞和抗各类 Ig 的抗血清,再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。 57【操作步骤操作步骤】（1）琼脂固相法）琼脂固相法直接法直接法 1）免疫动物：免疫动物：选用纯系小鼠，随机分组，每鼠选用纯系小鼠，随机分组，每鼠腹腔注射腹腔注射5的的SRBC 0.2ml致敏。致敏。 2）制备补体，制备补体，同前。同前。 3）制备底层琼脂：制备底层琼脂：称取称取1.4g琼脂糖加入琼脂糖加入100mlGeys液中，煮沸，溶化后分装若干只预温的液中，煮沸，溶化后分装若干只预温的试管，每管试管，每管5ml，置，置45恒温水浴保温。然后倾入恒温水浴保温。然后倾入水平放置的平皿（直径水平放置的平皿（直径9cm）中，凝固后打开平皿）中，凝固后打开平皿盖，将平皿反扣放入盖，将平皿反扣放入37温箱温箱1h，备用。，备用。584）制备脾细胞悬液：制备脾细胞悬液：免疫后第免疫后第4天，用冷天，用冷Geys制备制备107/ml脾细胞悬液，置脾细胞悬液，置4冰箱备用。冰箱备用。5）上层琼脂的制备：上层琼脂的制备：称取称取0.7琼脂糖加入琼脂糖加入100mlGeys液中煮沸，溶化后分装若干只预温的液中煮沸，溶化后分装若干只预温的试管，每管试管，每管1.5ml，置，置45恒温水浴保温。逐个取恒温水浴保温。逐个取出，依次加入出，依次加入SRBC悬液（悬液（2109/ml）0.1ml、107/ml脾细胞悬液脾细胞悬液0.1ml，充分混匀，立即倾入上，充分混匀，立即倾入上述制备好的底层琼脂平皿中，均匀铺平，凝固后静述制备好的底层琼脂平皿中，均匀铺平，凝固后静止止10min。596）将平皿置）将平皿置37、5CO2培养箱培养箱培养培养2h，每皿中加入每皿中加入1 10稀释的稀释的豚鼠血清豚鼠血清1.0ml，均匀覆盖于表面，继续温育均匀覆盖于表面，继续温育4050min，取出后置室温取出后置室温1h，4冰箱过夜，次日倾去冰箱过夜，次日倾去补体，补体，or加入加入0.25%的戊二醛（的戊二醛（NS配置），配置），使使细胞固定后计数空斑细胞固定后计数空斑。60 7）空斑计数与评定：空斑计数与评定：用放大镜用放大镜or双目解剖双目解剖镜可见每个空斑由抗体分泌细胞及其周围的镜可见每个空斑由抗体分泌细胞及其周围的透明区域组成。计数每个平皿（透明区域组成。计数每个平皿（106个细胞）个细胞）的空斑数。的空斑数。（2）琼脂固相法）琼脂固相法间接法：在上述间接法：在上述5）中）中再加入适当浓度的抗再加入适当浓度的抗-Ig血清血清0.1ml，其他步骤，其他步骤相同。相同。61 【注意事项注意事项】（1 1）SRBCSRBC既是免疫细胞，又是靶细胞和指示既是免疫细胞，又是靶细胞和指示细胞，故细胞，故SRBCSRBC要新鲜，洗涤不得超过要新鲜，洗涤不得超过3 3次，每次，每次离心次离心5min5min。用。用AlseverAlsevers s液保存的液保存的SRBCSRBC可可使用使用2 2周。周。 （2 2）为了）为了消除非特异性溶血消除非特异性溶血，豚鼠血清在使，豚鼠血清在使用前必须经用前必须经SRBCSRBC吸收，补体的浓度以吸收，补体的浓度以110110稀稀释为宜。释为宜。 62（3 3）制备脾细胞悬液：若将取出的脾立即）制备脾细胞悬液：若将取出的脾立即放入放入00冰浴，可明显降低空斑计数；在冰浴，可明显降低空斑计数；在2020以下操作，不超过以下操作，不超过15min15min，对空斑计，对空斑计数并无影响。数并无影响。 （4 4）测定抗血清的显斑常数（）测定抗血清的显斑常数（K KD D）和抑斑）和抑斑常数（常数（K KI I），作为空斑计数的校正。），作为空斑计数的校正。63 （5 5）倾注底层琼脂糖时，一定要将平皿放）倾注底层琼脂糖时，一定要将平皿放置置水平位置水平位置，以便使底层琼脂糖水平光滑。，以便使底层琼脂糖水平光滑。倾上层琼脂糖时，各种细胞成分要充分混匀。倾上层琼脂糖时，各种细胞成分要充分混匀。不能剧烈震荡不能剧烈震荡，以免出现气泡。水浴温度应以免出现气泡。水浴温度应控制在控制在47474949之间，温度过高使细胞变性；之间，温度过高使细胞变性；过低使琼脂糖凝固，影响细胞分散。过低使琼脂糖凝固，影响细胞分散。642 分光光度法分光光度法【基本原理基本原理】 又称又称SRBCSRBC的定量溶血测定法，基本原理同的定量溶血测定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可溶血空斑法。但本法可定量测定定量测定抗体形成细抗体形成细胞所分泌的胞所分泌的抗体抗体，较溶血空斑法精确较溶血空斑法精确。同时。同时操作比较简便。操作比较简便。65【操作步骤操作步骤】 （1）免疫动物：同前。）免疫动物：同前。 （2）制备脾细胞悬液：基本同前，制成）制备脾细胞悬液：基本同前，制成5106/ml脾细胞悬液，或按脾细胞悬液，或按15mg脾重脾重/ml制成脾细胞悬液。制成脾细胞悬液。 （3）溶血反应溶血反应：取试管若干只，每管依次加入：取试管若干只，每管依次加入脾脾细胞悬液细胞悬液、0.2SRBC、1 10豚鼠血清豚鼠血清各各0.5ml，充分混匀，另设不加补体的空白组。置充分混匀，另设不加补体的空白组。置37水浴中水浴中温育温育1h，离心，离心3000rpm，5min。 （4）测测OD值值：取上清测：取上清测OD413nm。66【注意事项注意事项】 （1）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。差。 （2）反应系统中其他条件不变时，）反应系统中其他条件不变时，SRBC浓度可根据受试药的免疫增强浓度可根据受试药的免疫增强or抑制作用作抑制作用作适当调整。适当调整。67三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法（一）淋巴细胞转化试验（一）淋巴细胞转化试验（3H-TdR掺入法）掺入法）【基本原理基本原理】 淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养液中加入液中加入3 3H-TdRH-TdR，使其掺入到新合成的，使其掺入到新合成的DNADNA中，中，可以定量细胞内的可以定量细胞内的DNADNA合成强度。合成强度。68有丝分裂原：有丝分裂原： PHAPHA（植物血凝素）（植物血凝素） 刺激刺激T T细细胞胞 Con-ACon-A（刀豆球蛋白）（刀豆球蛋白） 刺激刺激T T细胞细胞 LPSLPS（脂多糖）（脂多糖） 刺激刺激B B细胞细胞69【操作步骤操作步骤】 （1）纯系小鼠，）纯系小鼠，23月龄，雌雄均可。处月龄，雌雄均可。处死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入盛有盛有RPMI1640培养液的平皿中（冰浴），剪培养液的平皿中（冰浴），剪碎，用注射器针芯捣烂，过碎，用注射器针芯捣烂，过100目钢筛，目钢筛，制成制成脾细胞悬液脾细胞悬液。 （2）用培养液离心洗涤脾细胞）用培养液离心洗涤脾细胞3次，用次，用台盼台盼蓝蓝检查活细胞数在检查活细胞数在95以上。将细胞用培养以上。将细胞用培养液稀释成液稀释成2106个个/ml。 70 （3）将脾细胞加入）将脾细胞加入96孔培养板，每孔孔培养板，每孔200l，34复孔（复孔（也可更多也可更多）。）。加入有丝分裂原，加入有丝分裂原，培养培养72h。 （4）终止前）终止前6h，每孔，每孔加入加入3H-TdR 1m1ml，使，使其终浓度为其终浓度为15ci/ml。 （5）用）用微量多头微量多头细胞收集细胞收集仪仪，将细胞抽吸在，将细胞抽吸在49型玻璃纤维滤纸上，置型玻璃纤维滤纸上，置80烘箱内干燥烘箱内干燥30min。 （6）将烘干的滤纸片放入盛有闪烁液的小瓶）将烘干的滤纸片放入盛有闪烁液的小瓶中，用中，用液闪仪液闪仪测定样品中的放射强度测定样品中的放射强度（cpm）。）。72【注意事项注意事项】 （1 1）无菌操作。）无菌操作。 （2 2）脾细胞制备要放在冰浴中，避免细胞死）脾细胞制备要放在冰浴中，避免细胞死亡带来误差。亡带来误差。 （3 3）中药粗制剂中影响因素较多，注意假阳）中药粗制剂中影响因素较多，注意假阳性。性。【评价评价】（1 1）3 3H-TdRH-TdR掺入法客观准确。掺入法客观准确。经典方法。经典方法。（2 2）可直接观察药物本身对淋巴细胞转化的）可直接观察药物本身对淋巴细胞转化的影响，也可观察与有丝分裂原的协同影响，也可观察与有丝分裂原的协同oror拮抗拮抗作用。作用。73MTT法：法：【基本原理基本原理】 MosmannMosmann等根据细胞内能量代谢水平与等根据细胞内能量代谢水平与DNADNA合合成水平平行相关，首创了成水平平行相关，首创了四甲基偶氮唑盐（四甲基偶氮唑盐（MTTMTT）比色法。比色法。MTTMTT进入细胞后作为反应底物，被氧化成进入细胞后作为反应底物，被氧化成蓝色的蓝色的甲臜甲臜（formazanformazan），存积于细胞内及周围，），存积于细胞内及周围，加入加入DMSODMSO，使细胞破裂，并使细胞内甲臜释放出，使细胞破裂，并使细胞内甲臜释放出来，测定来，测定ODOD490nm490nm。 74（二）二硝基氟苯诱导小鼠（二）二硝基氟苯诱导小鼠DTH反应反应【基本原理基本原理】 DNFBDNFB是一种是一种半抗原半抗原，将其溶液涂抹腹部，将其溶液涂抹腹部皮肤后，与皮肤蛋白结合成皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原完全抗原，由，由此刺激此刺激T T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4747天后将其再次涂抹皮肤，可使局部产生天后将其再次涂抹皮肤，可使局部产生DTHDTH反应，一般在抗原攻击反应，一般在抗原攻击2448h2448h达高峰达高峰，故此时测定局部肿胀。故此时测定局部肿胀。75【操作步骤操作步骤】 （1 1）致敏：致敏：小鼠，随机分组，腹部去毛，小鼠，随机分组，腹部去毛，范围约范围约3 33cm3cm2 2，并将，并将1 1DNFBDNFB溶液均匀涂抹溶液均匀涂抹于腹部皮肤，必要时于次日再强化一次。于腹部皮肤，必要时于次日再强化一次。 （2 2）DTHDTH反应产生与测定：反应产生与测定：致敏后第致敏后第5 5天，天，将将1 1DNFBDNFB溶液溶液10l10l均匀涂抹于小鼠右耳均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行（两面）进行攻击攻击，对照组同样涂耳但未致，对照组同样涂耳但未致敏。敏。 76 攻击攻击24h24h后，脱颈处死小鼠，用直径后，脱颈处死小鼠，用直径8mm8mm的打孔器的打孔器打下圆形打下圆形耳片耳片，称重，以左右耳片总量之差为，称重，以左右耳片总量之差为肿胀肿胀度度；同时取小鼠；同时取小鼠胸腺及脾脏胸腺及脾脏称重，计算脾指数和胸称重，计算脾指数和胸腺指数（以每腺指数（以每10g10g体重计）。体重计）。【注意事项注意事项】 （1 1）DNFBDNFB溶液要临用前溶液要临用前新鲜配制新鲜配制。 （2 2）在小鼠腹部应尽量去毛，且应避免剪破皮肤。）在小鼠腹部应尽量去毛，且应避免剪破皮肤。 （3 3）操作者避免）操作者避免DNFBDNFB与皮肤接触。实验环境控制与皮肤接触。实验环境控制在在202022为宜。为宜。小小 结结一、影响非特异性免疫功能实验一、影响非特异性免疫功能实验（一）碳粒廓清法（一）碳粒廓清法/ /吞噬鸡红细胞法吞噬鸡红细胞法/ /化学发光测定法化学发光测定法( (巨噬巨噬细胞细胞) )（二）溶菌酶测定法（二）溶菌酶测定法（三）硝类兰四氮唑（三）硝类兰四氮唑（NBTNBT）还原试验）还原试验( (中性粒细胞中性粒细胞) )（四）（四）NKNK细胞活性检测细胞活性检测,LDH,LDH法法二、影响体液免疫功能的实验方法二、影响体液免疫功能的实验方法（一）血清溶血素测定法（一）血清溶血素测定法（二）抗体形成细胞测定法（二）抗体形成细胞测定法（PFCPFC）（三）抗体水平的检测（三）抗体水平的检测三、影响细胞免疫功能的实验方法三、影响细胞免疫功能的实验方法（一）淋巴细胞转化试验（一）淋巴细胞转化试验（二）（二）DTHDTH反应反应（三）细胞因子测定（三）细胞因子测定（四）细胞亚群检测（四）细胞亚群检测78常用免疫学技术常用免疫学技术1.免疫沉淀免疫沉淀 利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白的蛋白结合后，再与蛋白 A AG G（Protein AProtein AG G）或二抗偶联的）或二抗偶联的agaoseagaose或或SepharoseSepharose珠子孵育，珠子孵育，通过离心得到珠子蛋白通过离心得到珠子蛋白A AG G或二抗抗体目或二抗抗体目的蛋白复合物，沉淀经洗涤后，在高温及还原剂的蛋白复合物，沉淀经洗涤后，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。 792.免疫转印免疫转印技术技术基本原理是将蛋白质先行电泳分带，然后将其转印基本原理是将蛋白质先行电泳分带，然后将其转印到硝酸纤维素膜上，用标记信号分子（到硝酸纤维素膜上，用标记信号分子（同位素、酶、同位素、酶、荧光荧光）的抗体进行结果判定。）的抗体进行结果判定。 Western blotWestern blot813.免疫组织化学免疫组织化学技术技术 应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 834.细胞因子细胞因子的测定的测定1）mRNA的表达水平 RT-PCR，real-time PCR2）生物活性测定法 IL-2，CTLL-2细胞株3）酶联免疫测定法 ELISA4）细胞内细胞因子测定 流式细胞术 5）蛋白质芯片技术 84 ELISA ELISA （Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay） 基础基础: :抗原或抗体的固相化抗原或抗体的固相化及及抗原或抗体的酶标记抗原或抗体的酶标记。加。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。定量分析。ELISA的原理的原理85ELISAELISA的类型的类型 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：方法中有三个必要的试剂：（1 1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即 免疫吸附剂免疫吸附剂 immunosorbentimmunosorbent；（2 2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为 结合物结合物 （conjugateconjugate）；（3 3）酶反应的底物。）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。 Example TGF-189流式细胞术(flow cytometry，FCM)是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。该技术是一项集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学、免疫荧光细胞化学技术及单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。概括地说，流式细胞技术是通过流式细胞仪(flowcytometer)对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速和准确地定量分析和分选。流式细胞术在生物医学领域中应用十分广泛。凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用于流式细胞仪检测。91CD3+CD4+ cellsanti-CD3-FITC，anti-CD4-Percp-cy5925.淋巴淋巴细胞亚群细胞亚群的检测、分选的检测、分选 细胞表面标志细胞表面标志 1）流式细胞仪 2）磁珠分选MD0651.01MACS 磁性分选示意图磁性分选示意图MACS微珠进微珠进行磁性标记行磁性标记未标记的细胞未标记的细胞先行流出先行流出洗脱阳性洗脱阳性分选的细分选的细胞胞The end95