一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座一、微生物的实验室培养一、微生物的实验室培养（一一）培养基培养基 人们按照微生物对营养物质的不同需求，人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质称配制出供其生长繁殖的营养基质称培养基培养基 一般的培养基均需要一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和碳源、氮源、无机盐和水水等（具体见教材等（具体见教材1515页页“100mL100mL牛肉蛋白胨培养基牛肉蛋白胨培养基的营养构成的营养构成”）。）。培养基的基本成分培养基的基本成分一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座培养基的种类培养基的种类（1 1）按物理状态来分：培养基可分）按物理状态来分：培养基可分为为固体培养基固体培养基和和液体培养基液体培养基。其中。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。落等。（2 2）按功能来分，可分为）按功能来分，可分为选择培养选择培养基基和和鉴别培养基鉴别培养基。（3 3）按成分来分，可分为）按成分来分，可分为天然培养天然培养基基和和合成培养基合成培养基。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座（二二）无菌技术无菌技术 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。所有防止杂菌污染的方法技术。 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座消毒消毒 无菌技术的种类无菌技术的种类灭菌灭菌 使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。死部分对人体有害的微生物。 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；清洁消毒； 将培养皿、接种用具进行灭菌；将培养皿、接种用具进行灭菌； 接种的过程要在酒精灯附近进行。接种的过程要在酒精灯附近进行。使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。有微生物（包括芽孢和孢子）。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法: :用用75%75%酒精、新洁酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒尔灭等进行皮肤消毒; ;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(1)消毒的方法：消毒的方法：一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座1.1.灼烧灭菌：灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口或瓶口接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的放在酒精灯火焰的充分燃烧层充分燃烧层中进行灼烧灭菌（如教中进行灼烧灭菌（如教材材1616页图页图2-22-2所示）。所示）。（2 2）常用的灭菌方法）常用的灭菌方法2.2.干热灭菌：干热灭菌：将将玻璃器皿、金属用具玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160160170170OC C中加中加热热1 12h2h即可。即可。3.3.高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水的高压将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内（见教材灭菌锅内（见教材1616页图页图2-42-4）煮沸，待冷空气排尽后，）煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到密闭继续加热至锅内压力到100kPa100kPa，温度到，温度到121121OC C后，后，维持维持151530min30min即可。即可。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 二、实二、实 验验 操操 作作（一一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏蛋白胨固体培养基配方物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定容至定容至1000mL1000mL2.2.称量称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。迅速，称后及时盖上瓶盖。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 3. 3.溶化：溶化：先将先将牛肉膏连同称量纸牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶至至100mL100mL。 4. 4.灭菌灭菌( (先调先调PH)PH)将配制好的培养基放到锥形瓶中将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌。养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌。 5. 5.倒平板：倒平板：待培养基冷却到待培养基冷却到5050OC C左右时倒平板（如教左右时倒平板（如教材材1717图示）。图示）。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座倒平板操作的讨论倒平板操作的讨论 1. 1.培养基灭菌后要冷却到培养基灭菌后要冷却到5050OC C时倒平板。用时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？什么办法来估计培养基的温度？ 2. 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 用手触摸锥形瓶，温度下降到用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手刚刚不烫手时即可时即可开始倒平板。开始倒平板。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。上的水珠落入培养基，造成污染。 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此上滋生，因此最好不要最好不要用这个平板培养微生物。用这个平板培养微生物。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座（二二）纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌 微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。法。1.1.平板划线法平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教材材1818页图示）。页图示）。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称眼可见的子细胞群体称菌落菌落。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 操作的操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。操作者。 1 1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？环？一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？行划线？ 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？是从上一次划线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。 划线后，线条划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。繁殖而来的菌落。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 2. 2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。作和涂布平板操作。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座系列稀释操作系列稀释操作10101 110102 210103 310104 410105 510106 6 (1) (1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。 (2) (2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。 (3) (3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三支试稀释液，注入第三支试管中，重复步骤管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)将涂布器浸在盛有将涂布器浸在盛有7070的酒精的酒精的烧杯中。的烧杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培养基表），滴加到培养基表面。面。(3)(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃引燃，火熄后，火熄后冷冷却却8 810s10s。(4)(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座涂布平板操作讨论涂布平板操作讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2 2步应如何步应如何进行无菌操作？进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 三、结果分析与评价三、结果分析与评价 1.1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？落生长，说明了什么？ 2.2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？菌落？它们的大小、形状、颜色相似？ 未接种的培养基在恒温箱中保温未接种的培养基在恒温箱中保温1 12 d2 d后无菌落生长，后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。状、颜色相似的菌落。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 3.3.培养培养12h12h和和24h24h后，观察到的实验结果相同吗？如后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？果不同，请分析产生差异的原因？ 4.4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。其可能的原因。 培养培养12 h12 h与与24 h24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。 无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。污染。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座四、课题延伸四、课题延伸菌种的保存菌种的保存 1.1.试管低温试管低温临时保存临时保存 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于后，置于4 4O OC C的冰箱中保存（每隔的冰箱中保存（每隔3 36 6个月要重新接种培个月要重新接种培养后再保存）。养后再保存）。 2.2.甘油管甘油管长期保存长期保存 在在3mL3mL的甘油瓶中加入的甘油瓶中加入1mL1mL的甘油，高压灭菌。将的甘油，高压灭菌。将1mL1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于2020O OC C的的冷冻箱中保存。冷冻箱中保存。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一一） 筛筛 选选 菌菌 株株原理原理 人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温度、度、pHpH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养选择培养基。基。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 1.1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？氮源的分别是是什么物质？ 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。碳源是葡萄糖，氮源是尿素。 2.2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？如果有，又是如何进行筛选的？能分解尿素的细菌的筛选能分解尿素的细菌的筛选 有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。解尿素的脲酶的细菌才能生长。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座（二二） 统计菌落数目统计菌落数目原理原理 运用运用稀释涂布平板法稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。来统计样品中的活菌数。 统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30 30 300300的平板进的平板进行计数。行计数。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座（三三） 设设 置置 对对 照照 A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有其它氮源。究竟是哪土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮接种其它菌种，看是否有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种方案是将源。另一种方案是将A A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有说服力。所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有说服力。 阅读教材阅读教材22222323页页“（三）设置对照（三）设置对照”一段，并讨论一段，并讨论教材中提出的问题。教材中提出的问题。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座1.1.实验名称实验名称 土壤中某样品细菌的分离与计数土壤中某样品细菌的分离与计数2.2.实验目的（略）实验目的（略）3.3.材料用具（略）材料用具（略）4.4.操作步骤操作步骤 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土毒处理）表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先灭菌左右，再取样，将样品装入事先灭菌过的信封中。过的信封中。（1 1）土壤取样）土壤取样一、实一、实 验验 设设 计计 一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座将菌液稀释（见教材将菌液稀释（见教材2323页页“样品稀释流程示意图样品稀释流程示意图”）。）。稀释倍数为稀释倍数为 10101 1 10106 6。每个稀释度均用。每个稀释度均用3 3个选择培养基。个选择培养基。（2 2）样品稀释涂布）样品稀释涂布一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座（3 3）微生物的培养与观察）微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在3030温度下培养。随着培养时温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生，做好记录。间的延长，会有不同的菌落产生，做好记录。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座（4 4）细菌的计数）细菌的计数 选取菌落数在选取菌落数在3030300300的平板进行计数。在同一稀释度的平板进行计数。在同一稀释度下，下，至少对至少对3 3个平板进行重复计数个平板进行重复计数，然后求出平均值，并，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座二、结果分析与评价 1. 1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。已筛选出一些菌落。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 2. 2.样品的稀释操作是否成功样品的稀释操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。的计数。 3. 3.重复组的结果是否一致重复组的结果是否一致 如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因。作过程中去分析、寻找可能的原因。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座三、课 题 延 伸 能分解尿素的细菌的鉴定能分解尿素的细菌的鉴定鉴定的原理：鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pHpH升高。升高。鉴定方法：鉴定方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，利，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离（一一）纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶纤维素纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。纤维素酶纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括由微生物分泌的一种复合酶，包括C C C C1 1 1 1酶、酶、C C C Cx x x x酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。解成葡萄糖。纤维素纤维素C C C C1 1 1 1酶酶C C C Cx x x x酶酶纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖苷苷 酶酶葡萄糖葡萄糖一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座刚果红染色法刚果红染色法 刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二二）纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选 用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈透明圈时，时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚 果红果红 染成红色的纤维素分解了。染成红色的纤维素分解了。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座一、实一、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作操作提示提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。实验方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座土壤中纤维素分解菌的分离土壤中纤维素分解菌的分离 1.1.土样采集土样采集：土样采集的方法与本专题课题土样采集的方法与本专题课题 2 2类似。类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。二、实二、实 验验 案案 例例一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 2.2.选择培养选择培养： 选择培养的操作：称取土样选择培养的操作：称取土样20 g20 g，在，在无菌条件下加入装有无菌条件下加入装有30 mL30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在摇床上，在30 30 下振荡培养下振荡培养1 12 d2 d，至培养基变混浊，至培养基变混浊，重复上述方法再培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平重复上述方法再培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。板。目的：增加纤维素分解菌的浓度目的：增加纤维素分解菌的浓度一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座阅读与思考阅读与思考阅读教材阅读教材28282929页页“资料一资料一”“资料三资料三”，并思考相关问题。，并思考相关问题。问题一问题一：是液体培养基，因为没有添加琼脂。是液体培养基，因为没有添加琼脂。问题二问题二：具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。问题三：问题三：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，或者将纤维素粉换成葡萄糖；选择培养基具有筛选、纯化微生物的作素粉换成葡萄糖；选择培养基具有筛选、纯化微生物的作用。用。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座 3.3.刚果红染色法分离：常用的刚果红染色法有两种，刚果红染色法分离：常用的刚果红染色法有两种，一种是一种是先培养微生物先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在种是在倒平板时就加入刚果红倒平板时就加入刚果红。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座优点与不足优点与不足染色法染色法染色法染色法优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生混杂混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈产生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。明培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。得了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。同的分离结果。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座课题延伸课题延伸本课题对分解纤维素的微生物进行了初步本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选。但是，这只是分离纯化的第一步。的筛选。但是，这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。行发酵产纤维素酶的实验。一机医院一机医院 . . 检验科检验科科内学习讲座科内学习讲座分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结