复复杂先心病（先心病（TGA）的基因）的基因组学及学及其网其网络调控机制研究控机制研究钟诗龙钟诗龙 博士博士 副研究员副研究员广东省人民医院医学研究中心、广东省心血管病研究所广东省人民医院医学研究中心、广东省心血管病研究所病因与致病机制不明确：包括遗传与环境因素病因与致病机制不明确：包括遗传与环境因素先天性心脏病先天性心脏病在活产婴儿中的发病率为8-14.6严重影响威胁人口素质，给社会和家庭带来极大负担尽管介入与手尽管介入与手术能有效治能有效治疗先心病，但先心先心病，但先心病的几个关病的几个关键问题还没有解决没有解决1.确定病因，有效预防2.实现早期诊断疾病、明确疾病分类3.预测预后，进行个体化干预4.阐明发病机制，发现治疗靶标5.5.随着理论与技术的发展，基因组学研究在先心病研随着理论与技术的发展，基因组学研究在先心病研究中扮有重要作用。究中扮有重要作用。提纲提纲基因组学的分子生物学基础；基因组学的分子生物学基础；先心病的基因组学：先心病的基因组学：1.1.染色体变异染色体变异2.2.单基因突变；单基因突变；3.3.多基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介的基因组学及其网络调控机制研究简介提纲提纲基因组学的分子生物学基础；基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：常见先心病的基因组学：1.1.染色体变异染色体变异2.2.单基因突变；单基因突变；3.3.多基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介的基因组学及其网络调控机制研究简介DNAmRNA(messenger)ncRNAProteinRibosometranscriptiontranscriptiontranslationEpigenetics先心病的分子生物学基先心病的分子生物学基础：中心法中心法则序列变异序列变异 单核苷酸（突变、单核苷酸（突变、SNP和和indel）结构变异结构变异1.微星、拷贝数变异（CNV）2.亚染色体组3.整个染色体组或基因组提纲提纲基因组学的分子生物学基础；基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：常见先心病的基因组学：1.1.染色体变异染色体变异2.2.单基因突变；单基因突变；3.3.多基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介的基因组学及其网络调控机制研究简介先心病的遗传学先心病的遗传学染色体异常引起的合并先心病的综合症染色体异常引起的合并先心病的综合症13 三体三体 1:15,00018 三体三体 1:5,00021 三体三体 (Down syndrome)1:80022q11缺失：法洛四联症、缺失：法洛四联症、DiGeorge 综合征综合征其他较少见的染色体缺失包括：其他较少见的染色体缺失包括：9q34, 1q21.1, 16p11.2 and 17p11.2.Page 85321 三体三体-唐氏唐氏综合症合症产前诊断产前诊断绒毛膜绒毛活检绒毛膜绒毛活检10/40Miscarriage 1%Results :1 week羊膜腔穿刺羊膜腔穿刺14/40Miscarriage 0.5%Results :3 weeks 用高通量测序法检用高通量测序法检测胎儿非整倍体测胎儿非整倍体Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 23;105(51):20458-63BMJ. 2011 Jan 11;342:c7401怀孕年龄怀孕年龄35.4岁，取血样时怀孕时间岁，取血样时怀孕时间13周又周又1天天提纲提纲基因组学的分子生物学基础；基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：常见先心病的基因组学：1.1.染色体变异染色体变异2.2.单基因突变；单基因突变；3.3.多基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介的基因组学及其网络调控机制研究简介先心病的先心病的遗传学学基因突变引起的先心病基因突变引起的先心病基因基因综合征综合征心脏畸形心脏畸形TBX1TBX1基因基因DiGeorgeDiGeorge综合征综合征主动脉离断、永存动脉干（主动脉离断、永存动脉干（PTAPTA）、）、法洛四联症（法洛四联症（TOFTOF）、右室双出口）、右室双出口和大动脉换位和大动脉换位TBX5TBX5基因基因Holt-OramHolt-Oram综合征综合征心脏畸形包括房间隔缺损（心脏畸形包括房间隔缺损（ASDASD）、）、TOFTOF和房室传导阻滞等和房室传导阻滞等TFAP2TFAP2基因基因CharChar综合征综合征动脉导管未闭动脉导管未闭PTPN11PTPN11基因基因NoonanNoonan综合征综合征胸部畸形和肺动脉狭窄（胸部畸形和肺动脉狭窄（PSPS）NOTCHNOTCH通路通路JAG1JAG1、NOTCH2NOTCH2基因突变基因突变AlagilleAlagille综合征综合征动脉动脉- -肝脏发育不良、肺动脉流出肝脏发育不良、肺动脉流出道或外周肺动脉的狭窄道或外周肺动脉的狭窄HOLT-ORAM综合征和TBX5基因uHolt-Oram综合征主要表现为肢体和心脏畸形，故又称综合征主要表现为肢体和心脏畸形，故又称为心为心-手综合征手综合征u单倍体单倍体TBX5基因可导致基因可导致Holt-Oram综合征，综合征，TBX5基因基因突变也是人类首个在心脏间隔缺损畸形中找到的单基因突突变也是人类首个在心脏间隔缺损畸形中找到的单基因突变。变。uTBX5基因的错义突变导致心脏或肢体的畸形则取决于基因的错义突变导致心脏或肢体的畸形则取决于其突变的位点其突变的位点单基因先心病的遗传模式单基因先心病的遗传模式有一些显示出明显的孟德尔遗传模型；有一些显示出明显的孟德尔遗传模型；有的显性遗传、有的隐性遗传、有的伴性遗传；有的显性遗传、有的隐性遗传、有的伴性遗传；有一些是为一个基因的结构或功能的改变，即有一些是为一个基因的结构或功能的改变，即“单基因单基因突变突变”；估计这种遗传缺陷占估计这种遗传缺陷占 8% ；但是大部分的先心病是多基因突变的结果。但是大部分的先心病是多基因突变的结果。提纲提纲基因组学的分子生物学基础；基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：常见先心病的基因组学：1.1.染色体变异染色体变异2.2.单基因突变单基因突变3.3.多基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介的基因组学及其网络调控机制研究简介与与遗传性心性心脏疾病相关的致病基因突疾病相关的致病基因突变肥厚性心肌病肥厚性心肌病扩张性心肌病扩张性心肌病致心律失常性右致心律失常性右室心肌病室心肌病长长QT综合症综合症Brugada综合征综合征基因基因发生发生% 基因基因发生发生% 基因基因发生发生% 基因基因发生发生% 基因基因发生发生% MYH71220%LMNA26%PKP21143%KCNQ13035%SCN5A2025%MYBPC32028%MYH747%DSG2726%KCNH22530%GPD1LTNNT225%MYBPC337%DSP616%SCN5A510%CACNA1CTNNI313%TNNT214%DSC2KCNE11%CACNB2TPM113%SCN5A23%JUPKCNE21%SCN1BMYL213%LDB313%RYR2ANK2KCNE3ACTC11%PLN13%TGFB3KCNJ2SCN3BMYL31%ACTN24%TMEM43CACNA1CGLA1%VCL3%DESCAV3LAMP21%SGCD3%SCN4BPRKAG21%CSRP32%AKAP9TNNC1DES2%SNTA1MYH6TNNI31%MYO6TPM11%TTNACTC11%CSRP3TCAP1%MYOZ2ABCC91%VCLCTF11%TCAPTNNC1ACTN2MYH6LDB3TTNPLNTAZJPH2EMDTTRLAMP2MYLK2PSEN1CAV3PSEN2MTTIEYA4致病基因突变的发现有助于基因诊断致病基因突变的发现有助于基因诊断如对有肥厚性心肌病的母亲进行基因检测，可以预测如对有肥厚性心肌病的母亲进行基因检测，可以预测其子女的风险。其子女的风险。但是如何决策但是如何决策?基因突变用于诊断与预测基因突变用于诊断与预测对遗传对遗传性心血管病家庭性心血管病家庭进进行行遗传遗传学学检测检测的决策的决策树树Caleshu C et al. Heart 2010;96:1669-1675检测先心病患者检测先心病患者致病突变致病突变可能致病突变可能致病突变未知功能突变未知功能突变阴性或良性突变阴性或良性突变检测没有发病家族成员检测没有发病家族成员阳性结果阳性结果遗传咨询遗传咨询临床监护临床监护阴性结果阴性结果无危险无危险无需进一步无需进一步检测检测基因基因诊断断检测：益：益处与与风险益益处风险基因诊断检测可以基因诊断检测可以:确定胎儿或个体是否确定胎儿或个体是否处于于遗传疾病的疾病的风险当胎儿当胎儿处于于风险是，可以是父是，可以是父母和医生考母和医生考虑尽早作出尽早作出产前前诊断性断性选择。 。检测结果也可以检测结果也可以:使个人和家人使个人和家人难于决断；于决断；可能可能负面影响家庭面影响家庭稳定性和个定性和个人关系人关系基因突变用于预测预后：基因突变用于预测预后：双双基因突基因突变对对肥厚性心肌病模型小鼠肥厚性心肌病模型小鼠生存的影响生存的影响有有2个致病基因突变的个体比只含个致病基因突变的个体比只含1个突变个突变的家族性的家族性肥厚性心肌病病人肥厚性心肌病病人更易发生严更易发生严重的心衰重的心衰Circulation. 2008;117:1820-1831肥厚性心肌病模型小鼠肥厚性心肌病模型小鼠目前已知的基因突变仅能部分解释先心病发病率：目前已知的基因突变仅能部分解释先心病发病率：以肥厚性心肌病为例以肥厚性心肌病为例对80个不相关的先症者进行7个HCM 基因 (b-MHC, MyBP-C, cTnT, cTnI, ACTC, MYL2, and MYL3) 作基因突变检测在23个先症者中检测到26个基因突变，发生率为 (29%)以往的研究主要集中在候选的信号通路或基因以往的研究主要集中在候选的信号通路或基因在全基因组范围全面发现新的先心病的致病基因突变，阐在全基因组范围全面发现新的先心病的致病基因突变，阐明其遗传传递规律，并系统地揭示其致病机制成为目前全明其遗传传递规律，并系统地揭示其致病机制成为目前全世界研究重点世界研究重点。J Med Genet 2005;42:e59提纲提纲基因组学的分子生物学基础；基因组学的分子生物学基础；常见先心病的基因组学：常见先心病的基因组学：1.1.染色体变异染色体变异2.2.单基因突变单基因突变3.3.多基因突变多基因突变TGA的基因组学及其网络调控机制研究简介的基因组学及其网络调控机制研究简介外显子组测序发现完全性大动脉转位（外显子组测序发现完全性大动脉转位（TGATGA）的）的致病基因突变及其致病机制研究致病基因突变及其致病机制研究TGA流行病学流行病学TGA是新生儿期最常见的紫绀型先天性心脏病，发是新生儿期最常见的紫绀型先天性心脏病，发病率为病率为0.2-0.3，约占先天性心脏病总数的，约占先天性心脏病总数的5-7，男女患病之比为，男女患病之比为2-4：1。若不治疗，约。若不治疗，约90的的患者在患者在1岁内死亡。岁内死亡。TGA严重影响威胁人口素质，给社会和家庭带来极严重影响威胁人口素质，给社会和家庭带来极大负担。大负担。TGA解剖与功能分类解剖与功能分类TGA + IVSTGA + IVSTGA + VSDTGA + VSDTGA + AoCoaTGA + AoCoa(RVOTO)(RVOTO)TGA + PS TGA + PS (LVOTO)(LVOTO)在病理上：在病理上：大动脉转位时，主动脉瓣下圆锥发达，未被吸收，主动脉位大动脉转位时，主动脉瓣下圆锥发达，未被吸收，主动脉位于左前上方；于左前上方；肺动脉瓣下圆锥萎缩，肺动脉位于作后下方。肺动脉瓣下圆锥萎缩，肺动脉位于作后下方。发病原因及其发病机制目前还不清楚。发病原因及其发病机制目前还不清楚。以往的研究主要集中在与体轴形成有关的信号通路或以往的研究主要集中在与体轴形成有关的信号通路或基因基因发现了一些发现了一些TGA致病基因变异：致病基因变异：CFC1、GDF1、NODAL等等NODAL信号通路与左右体信号通路与左右体轴形成有关形成有关TGA的致病基因突的致病基因突变基因基因位置位置突变类型突变类型CFC1exon 4 splice donor siteIVS4DS DUPGDF1exon 3CYS227TERFOXH1exon 1Pro21SerNODALexon 29-BP INSERTION/24-BP DELETION, NT700Donor splice site of intron 2 IVS2DS, G-A, +1exon 3IVS2-1GCMED13Lexon 6752A-GGLU251GLYexon 255615G-A、ARG1872HISexon 286068A-GASP2023GLYZIC3exon 21741A-T, LYS-TERexon 1763T-G,TRP255GLYexon 1GLY17CYSNKX2.5exon 2VAL150ILE这些突变不足以解释这些突变不足以解释TGA的高发病率；的高发病率；尤其在中国人中：尤其在中国人中：我们在我们在28个个TGA患者及患者及10个家系成员中没有检测到这个家系成员中没有检测到这些突变些突变科学科学问题1.1.能否在全外显子组范围找到引起能否在全外显子组范围找到引起TGA的致病基因突的致病基因突变？变？2.2.它们在父代与子代之间的传递规律如何？它们在父代与子代之间的传递规律如何？明确其传递规律将为早期诊断提供TGA分子预警的标记。3.3.通过系统生物学的方法识别基因组中关键节点基因通过系统生物学的方法识别基因组中关键节点基因及其网络，对于致病基因突变的机制研究具有方向及其网络，对于致病基因突变的机制研究具有方向性指导作用。性指导作用。4.4.高糖对致病基因突变有没有协同作用？高糖对致病基因突变有没有协同作用？全基因全基因组外外显子子测序（序（EXOME SEQUENCING）外显子组测序是一种新型的基因组分析技术，只需针对外显子区域的DNA即可，能够发现位于编码区的SNPs和小的InDels。因此与全基因组重测序相比，外显子组测序更加简便、经济、高效，已成为现阶段基因测序工作的重心权重基因共表达网重基因共表达网络分析分析权重基因共表达网络分析是一种用于解析分子作用机制和网络关系的系统生物学方法。它充分利用基因表达的内在信息，把高度关联的转录子聚类成一族，称作一个模块(module)，然后识别与临床相关的模块，最后用模块内连通性（intramodular connectivity）和基因重要性（gene significance）识别信号通路上关键调控基因（Hub genes）。网络构建网络构建Tools: Pearson correlation, Soft thresholdingRationale: make use of interaction patterns between genes模块识别模块识别Tools: TOM, Hierarchical clusteringRationale: module- (pathway-) based analysis找到模块代表性基因找到模块代表性基因Tools: eigengene (1st Principal Component)Rationale: Condense each module into one profile进一步分析进一步分析模块相关性，模块重要性、析因分析等.第一部分：全基因组外显子测序寻找第一部分：全基因组外显子测序寻找TGA的致病错义基因突变的致病错义基因突变1.筛选阶段筛选阶段完全性大动脉转位患者完全性大动脉转位患者(12例例)Agilent 全外显子捕获全外显子捕获Solexa测序测序 生物信息学分析生物信息学分析注释和统计分析、排除非基因、内含子、同注释和统计分析、排除非基因、内含子、同义突变、已知义突变、已知SNP 潜在致病突变潜在致病突变Sanger测序测序排除没有验证的潜在致病突变排除没有验证的潜在致病突变 TGA患者患者150例例包括核心家系包括核心家系50个个健康志愿者健康志愿者500例例基因型与表型是否基因型与表型是否发生共分离发生共分离 验证潜在致病验证潜在致病突变突变 2. 验证阶段验证阶段TGA主动脉瓣下圆主动脉瓣下圆锥组织锥组织权重基因共表达网络分析权重基因共表达网络分析TGA肺动脉瓣下圆肺动脉瓣下圆锥组织锥组织TGA肺肺动脉瓣下脉瓣下圆锥与干下型与干下型肺肺动脉瓣下脉瓣下圆锥的差异模的差异模块干下型患者的肺动脉干下型患者的肺动脉瓣下圆锥组织瓣下圆锥组织TGA的关键信号通路及关键节的关键信号通路及关键节点基因点基因TGA主主动脉瓣下脉瓣下圆锥与干下型与干下型肺肺动脉瓣下脉瓣下圆锥的差异模的差异模块TGA的的差异模差异模块1. 权重基因共表达网络分析识别权重基因共表达网络分析识别TGA的关键信号通路及关键节点的关键信号通路及关键节点基因，基因，第二部分：致病错义基因突变第二部分：致病错义基因突变的分子机制的分子机制野生型野生型致病基因致病基因P19细胞功能细胞功能Nodal信号应答信号应答突变型突变型致病基因致病基因基因突变的功能及其基因突变的功能及其分子机制分子机制致病基因与致病基因与NODAL信号通路基因细胞定位信号通路基因细胞定位与表达与表达高糖高糖2. 致病错义基因突变通过致病错义基因突变通过TGA关键节点对关键节点对NODAL信号通路的信号通路的调控机制调控机制预期期结果果1.在全基因组外显子组范围发现在全基因组外显子组范围发现TGA致病错义基因突致病错义基因突变发现发现；变发现发现；2.阐明致病错义基因突变在父母代与子代之间的传递阐明致病错义基因突变在父母代与子代之间的传递规律，为早期诊断提供分子遗传预警的标记。规律，为早期诊断提供分子遗传预警的标记。3.3.通过权重基因共表达网络分析识别通过权重基因共表达网络分析识别TGA的关键信号的关键信号通路及关键节点基因。通路及关键节点基因。4.4.阐明致病错义基因突变对细胞功能的影响，揭示致阐明致病错义基因突变对细胞功能的影响，揭示致病基因通过病基因通过TGA关键节点对关键节点对NODAL信号通路作用信号通路作用的分子机制，并阐明阐明环境因素如高糖对致病错的分子机制，并阐明阐明环境因素如高糖对致病错义基因突变作用效果的协同作用。义基因突变作用效果的协同作用。谢谢谢谢