DNA甲基化及其检测方法武汉大学中南医院基因诊断中心郑 芳纲纲 要要表观遗传学表观遗传学DNA甲基化甲基化DNA甲基化检测方法甲基化检测方法研究进展研究进展一、表观遗传学一、表观遗传学基因型相同基因型相同现象现象1 1：一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同表达模式迥异表达模式迥异现象现象2：同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但他们往往在长大成人后在性格他们往往在长大成人后在性格、健康方面往往健康方面往往存在很大差异。存在很大差异。 现象现象3 3： 肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因的而基因的DNADNA序列并不发生变化。序列并不发生变化。 现象现象4 4：橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味道，大小，外观可能相差很远。道，大小，外观可能相差很远。Basket ball player？Singer？President？TV host？如果他们出生在不同如果他们出生在不同的地方的地方基因环境表型表观遗传学相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型 ? ? 什么是表观遗传学？什么是表观遗传学？ 表观遗传学：表观遗传学： 基因序列无变化基因序列无变化 基因功能发生变化基因功能发生变化 可遗传并且是可逆的可遗传并且是可逆的 表观遗传学机制：表观遗传学机制： DNADNA甲基化甲基化 组蛋白修饰组蛋白修饰 RNA RNA调控（调控（RNARNA干扰，干扰，microRNAmicroRNA, long non-coding , long non-coding RNARNA等等) )表观遗传学表观遗传学/ /Epigenetics 基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的现象，称为表观遗传或后生遗传。现象，称为表观遗传或后生遗传。表观遗传学研究的是在基因组表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的序列不变的情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜或潜在的可遗传性在的可遗传性)的变化。的变化。 定义定义定义定义 EpiEpigeneticsgenetics - On or over the genetic information encoded in the - On or over the genetic information encoded in the DNADNA在细胞基因组上存在两类信息：在细胞基因组上存在两类信息： A- 遗传学信息遗传学信息 B- 表观遗传学信息表观遗传学信息前者前者维持细胞活性功能工厂的所有物质材料维持细胞活性功能工厂的所有物质材料后者后者怎么建、何怎么建、何时时建、在哪建的附加信息建、在哪建的附加信息基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以记载遗传信息。记载遗传信息。记载遗传信息。记载遗传信息。DNA sequence codingEpigenetic programming表观遗传的特点：表观遗传的特点：广泛，多样，广泛，多样，复杂复杂DNA甲基化甲基化 染色质重塑染色质重塑 RNARNA调控（调控（RNARNA干扰，干扰， 非编码非编码RNA:microRNARNA:microRNA, , long non-coding RNA long non-coding RNA等等) )表观遗传学目前的主要研究发现表观遗传学目前的主要研究发现 二、二、 DNA甲基化甲基化DNA甲基化甲基化组蛋白翻译后修饰组蛋白翻译后修饰RNA机制机制DNA 甲基化的概念及机理1950年，年，Wyatt在在Nature上首次指出测序结果表明上首次指出测序结果表明DNA可能存在第可能存在第5碱基。碱基。DNA甲基转移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH高等生物基因组甲基化特点高等生物基因组甲基化特点 1）广泛性广泛性 2）可遗传性可遗传性 3）可逆性可逆性 4）组织特异性组织特异性CpG岛岛(CpG islands) 在结构基因在结构基因5端附近的调控区段，端附近的调控区段， CG二联二联核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于50%。 预测软件预测软件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/广泛性广泛性可遗传性DNA的甲基化如何调节基因表达？A: A: 未甲基化或低度甲未甲基化或低度甲基化的启动子能够允基化的启动子能够允许转录正常进行。许转录正常进行。B: B: 甲基化的甲基化的CpGsCpGs阻阻止转录因子的结合，止转录因子的结合，因此阻止转录。因此阻止转录。C: MBP ( Me-C: MBP ( Me-CpGCpG binding protein ) binding protein ) 也也阻止转录因子和启动阻止转录因子和启动子区的结合。子区的结合。其他，如改变染色质结构，其他，如改变染色质结构，启动子高甲基化使基因表达受抑制DNA 修复修复基因表达的调节基因表达的调节癌基因代谢癌基因代谢 凋亡凋亡分化分化细胞周期细胞周期DNA甲基化甲基化DNADNA甲基化的功能甲基化的功能 三、三、DNA甲基化检测手段甲基化检测手段 DNA甲基化检测方法总览 主要检测途径主要检测途径3-1 基于重亚硫酸盐转化的方法基于重亚硫酸盐转化的方法3-2 不基于重亚硫酸盐转化的方法不基于重亚硫酸盐转化的方法 3-1基于重亚硫酸盐转化的方法基于重亚硫酸盐转化的方法质谱分析质谱分析水解核苷酸质谱分析基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2应用一应用一:直接测序法（Direct sequencing)直接测序法图图6 PMVK基因扩增产物反向测序结果基因扩增产物反向测序结果图图7 TRIB3基因扩增产物正向测序结果基因扩增产物正向测序结果应用二：应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequence PCR，BSP) 注： A：癌组织；B：癌旁组织；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆测序结果BSP克隆测序甲基化率三维图形应用三：应用三：甲基化特异性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR)甲基化特异性甲基化特异性PCRPCR U M U M U M ladder100150200250MSP法检测抑癌基因法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化启动子区的甲基化图图 MSP检测组织切片检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化状态电泳图片甲基化特异性甲基化特异性PCR（MSP）结果，）结果，U为非甲基化，为非甲基化，M为甲基化。为甲基化。基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室 MSP扩增产物凝胶电泳图研究结果注：注：M表示表示 甲基化，甲基化，U表示未甲基化表示未甲基化 B1-B6B1-B6为为高脂血症高脂血症组组六例六例标标本，本，D1-D5D1-D5为为正常正常对对照照组组五例五例标标本；本； H H2 2O O为为阴性阴性对对照；照；m m为为50bpMarker50bpMarker。SREBP-1SREBP-1基因启动子区基因启动子区CpGCpG岛甲基化状态岛甲基化状态基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室甲基化特异性PCR优点：优点：操作简便；敏感性高。缺点缺点：引物设计要求高；只能作定性研究；存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；只能了解部分位点的甲基化状态。应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法基于限制性内切酶的工具酶基于限制性内切酶的工具酶甲基化甲基化特异性特异性的限制性内切酶：的限制性内切酶：可以识别甲基化的胞嘧啶可以识别甲基化的胞嘧啶甲基化甲基化敏感性敏感性的限制性内切酶：的限制性内切酶：可以识别甲基化的胞嘧啶可以识别甲基化的胞嘧啶基于限制性内切酶的甲基化分析方法基于限制性内切酶的甲基化分析方法基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室MSRE-PCR原理原理图图 1-1 MSRE-PCR1-1 MSRE-PCR原理图原理图注：左图DNA无甲基化, DNA被切断, 无法得到PCR产物; 右图DNA有甲基化, DNA保持完整,可以获得PCR产物.基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室本课题组应用举例二：本课题组应用举例二：采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图M21AE 17B 17BE 17A 17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白基因诊断中心郑芳实验室基因诊断中心郑芳实验室结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法优优点点：方法相对简单；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少。缺点缺点：只能获得特殊酶切位点甲基化情况。优点优点： 可同时检测基因组内多个CpG位点。实验结果易解释，成本低廉。缺点缺点：由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略；只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意；需要样本量大；存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；不适用于混合样本。 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法应用五：甲基化敏感性单链构象分析（methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）甲基化敏感性单链构象分析甲基化敏感性单链构象分析甲基化敏感性单链构象分析优优点点：能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析；能够对甲基化的等位基因进行半定量； 可以提示甲基化状态分布的不均匀性。缺点缺点： 只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低； 检测片段不宜过长。应用六：基于亲和纯化的甲基应用六：基于亲和纯化的甲基化分析方法化分析方法基于亲和纯化的甲基化分析方法基于亲和纯化的甲基化分析方法应用七：应用七：ChIP-Seq技术技术 ChIP-Seq应用八：芯片技术在甲基化应用八：芯片技术在甲基化检测中的应用检测中的应用启启动动子区甲基化芯片技子区甲基化芯片技术术基因芯片杂交信号图基因芯片杂交信号图应用九：HRM高分辨熔解曲线分析高分辨熔解曲线分析 HRMHRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpGCpG位点 鉴定感兴趣的CpGCpG 岛 。HRM技术原理技术原理 HRMHRM技术原理技术原理 HRM特点 高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于大样本多位点甲基化扫描。高重复性：重复性100%。使用范围广：不受碱基位点局限。 操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探针，无需测序。 标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。 应用十：焦磷酸测序法 是由4种酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应 每一轮测序反应体系中只加入一种dNTP。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的ATP硫酸化酶催化PPi与5-磷酰硫酸（APS）结合形成ATP，然后在荧光素酶的催化作用下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。CCD感应器检测到光信号后，Pyrogram转化为检测峰，每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目呈正比Apyrase不断降解未掺入的核苷酸和ATP，淬灭光信号，再生反应体系焦磷酸测序法（Pyrosequencing）焦磷酸测序焦磷酸测序 焦磷酸测序焦磷酸测序 焦磷酸测序焦磷酸测序 焦磷酸测序的优势：焦磷酸测序的优势：灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域。除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。 对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。焦磷酸测序法的局限性利用该方法测定在人类基因组中大量存在且DNA甲基化高发的重复元件Alu和LINE-1(long-interpread nucleotide element)的甲基化率，以它们的甲基化水平代表人类基因组DNA甲基化的总体水平。但是该方法的得到的不是严格意义上的全基因组DNA甲基化率，并不能精确的反映全基因组DNA甲基化水平的实际情况。 总结：基于重亚硫酸盐转化的方法总结：基于重亚硫酸盐转化的方法MSP, methylation-specific PCR; Ms-SnuPE, methylation-sensitive single nucleotide primer extension；Ms-SSCP, methylation-sensitive single-stranded conformational polymorphism; MS-REs, methylation-sensitive restriction endonucleasessample throughput versus genome coverage. sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage for various DNA methylation techniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment. Daniel Zilberman et al. Development 134, 3959-3965 (2007)不同甲基化检测方法的检测通量 3-2 整体甲基化水平的检测方法整体甲基化水平的检测方法 全基因组整体甲基化水平的分析全基因组整体甲基化水平的分析应用一：高效液相色谱法（HPLC)高效毛细管电泳（HPCE）高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC)HPLC)高效毛细管电泳（高效毛细管电泳（HPCEHPCE）先将DNA样品经过盐酸或氢氟酸裂解为单个碱基（A, T, 5C, G, 5mC), 水解产物通过色谱柱或毛细管，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。相比HPLC, HPCE方法更加简便，快速，经济。两种方法测定基因组DNA甲基化水平的敏感性均较高。高效毛细管电泳（高效毛细管电泳（HPCEHPCE法）法）Resolution of nucleosides obtained from enzymatic hydrolysis of genomic DNA from human cancer cell line HT29 by HPCE.mC, 5-methylcytidine; A, adenosine;C, cytidine;G, guanosine; T, thymidine.总体甲基化总体甲基化=100%5mC/(5mC+5C）生物质谱技术检测生物质谱技术检测DNADNA总体总体甲基化水平甲基化水平应用二：生物质谱技术应用二：生物质谱技术质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质量图谱，通过样品的质量图谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。质谱技术原理质谱技术原理质谱仪的示意图(A), Nucleoside standards obtained under the optimized conditions. (B),Nucleosides from 2 ng genomic DNA of HCC tissues.Shown in the inset is the expanded chromatogram to reveal better the separation of 5-mdC, dC, C, dG, and 5-hmdC. Chen ML, Fan S, et al. Clinical Chemistry (2013)59:5;全基因组全基因组DNADNA甲基化率甲基化率=100=100C C5-mdC5-mdC(C(C5-dC5-dC+C+C5-mdC5-mdC) ) 质谱法检测的优势：需要DNA样本量多，12g。灵敏度准确性高。操作较简便。局限性： DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干扰作用。需用质谱仪。Past and predicted methylome analysis milestones for current and potential future approaches. Beck S, et al. Trends Genet. 2008;24(5):231-7.DNA甲基化研究展望致 谢