ITRAQITRAQ定量蛋白质组学定量蛋白质组学主要内容主要内容iTRAQ技术简介技术简介iTRAQ试剂标记原理试剂标记原理iTRAQ技术优势技术优势iTRAQ实验流程实验流程iTRAQ实验结果示例实验结果示例iTRAQ实验详细步骤实验详细步骤ITRAQ技术简介 iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同重标签标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。 iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰； 在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。4NCBI截止现在为1773篇5相关杂志对重复性要求相关杂志对重复性要求首选首选2-3次生物重复，最好次生物重复，最好3次或以上次或以上组内样品个体差异大的材料需要更多的生物重复组内样品个体差异大的材料需要更多的生物重复生物学重复样品较多时，可以适当混合以减少样品数目生物学重复样品较多时，可以适当混合以减少样品数目 无任何重复，可以结合其他技术进行验证无任何重复，可以结合其他技术进行验证 6建议ITRAQ试剂标记原理 报告部分共有8种：质量数分别为114121Da，因此iTRAQ最多可同时标记8组样品（客户可按需选择标记个数）。 肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。 平衡部分：质量数分别为3124Da，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。图1 iTRAQ技术原理图ITRAQ技术优势灵敏度高：灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；分离能力强分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；适用范围广：适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；结果可靠：结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；自动化程度高：自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。ITRAQ实验流程iTRAQ实验流程。 1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质； 2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切； 3：各组样本的肽段混合物分别用不同的iTRAQ试剂标记； 4：等量混合各样本中的标记肽段； 5：MS/MS质谱检测及分析。 ITRAQ实验结果示例1: 提取各组蛋白质、定量并用胰酶酶切；2. 各组肽段分别用4种iTRAQ试剂标记 (例如对照组用iTRAQ 117标记，其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)；3. 标记好的各组样本等量混合，液相分离和质谱分析. 4: 不同样本中蛋白质的差异表达可通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面积确定，如图所示：与对照组相比，该蛋白在3个处理组(114-116)中的相对表达量较高。5. 根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性信息。案例1：人脑脊液（客户文章未发表，资料仅供内部参考）实验设计：1.客户用ELISA方法检测正常人与病患脑脊液中几个细胞因子存在稳定差异2.客户提供4种不同患者脑脊液样本进行iTRAQ检测分析。3.首先对其中一例样本进行SDS分析，可见脑脊液中存在高峰度蛋白。4.除去高峰度部分蛋白，其他条带切胶合并酶切提取。（也可以使用商品化去除高峰度试剂盒，成本较高，效果也因人而异。）结果4列样本共鉴定到861个蛋白，其中ELISA检测到的细胞因子也得到验证4组结果两两比较，筛选1.2倍以上差异，数据分析数据交盖图数据分析GO 富集分析通过生物信息学分析工具DAVID对鉴定蛋白进行GO（Gene Ontology，详细信息见网站：http:/www.geneontology.org）功能注释、功能富集分析及定位分析。（可按照客户要求绘制饼图等）数据分析数据分析Pathway通路富集分析在生物体内，存在着大量的代谢、调控和信号转导过程，这些过程往往形成一条条不同的通路（pathway），基于Pathway的分析有助于了解发生差异变化蛋白质所的生物学进程位置。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库（Kanehisa，2008），通过Pathway分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。通路富集结果：案例2。蜂王浆提取物对肿瘤细胞的影响实验背景：客户把从蜂王浆中提取到的一种化合物与人的肿瘤细胞共同培养，观察到其抑制了肿瘤细胞的迁移侵袭能力。由此猜想，此化合物有抑制肿瘤生长的作用。实验设计：对照组（2重复），模型组（3重复），给药组（3重复）实验过程：8组样本分别提取总蛋白定量，酶切后标记混合。之后进行液相粗分离，最后QE质谱检测。实验结果：蛋白序列数据库来源: 人类UniProt数据库。质谱数据搜索采用PD搜索引擎共鉴定到蛋白4565个。差异蛋白分组进行比较。（判断实验成功与否的标准为鉴定到的总蛋白数是否达到文献水平，差异蛋白数与实验设计相关，无法承诺。）标记标记样品组样品组113实验组1（对照）114实验组1（对照）115实验组2116实验组2117实验组2118实验组3119实验组3121实验组3数据分析采用DAVID在线工具对显著差异表达蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。（PAHTWAY无显著富集）客户关注的信号通路（PATHWAY）差异表达蛋白相互作用网络分析利用MetaCore软件，对所有显著差异表达蛋白进行相互作用网络分析，。相互作用网络分析显示，差异表达蛋白富集到30条经典子网络，右为包含“SP1, TRAP230, Neprilysin, MIF, SLC38A2”等关键节点的子网。总结总结：iTRAQ技术及后期分析可以帮助客户很好地验证试验猜想，以及为揭示蛋白表达变化原因提供可靠的方向指引。高阶（客制化）信息分析详见信息分析PDFITRAQ详细实验步骤ABI试剂盒ITRAQ详细实验步骤1 1：蛋白质提取：蛋白质提取 可以选择提取蛋白质常用的各种溶液，裂解液里最好不要包括下面试剂，因为这些试剂会干扰iTRAQ试剂的标记反应。ITRAQ详细实验步骤2 2：蛋白质定量：蛋白质定量 (1) 可以采用Bradford方法及其他方法定量初步 (2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS-APGE电泳，银染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。ITRAQ详细实验步骤3 3：酶切，标记：酶切，标记(1)每组样本（各100g）分别加入-20预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20沉淀30min4h（根据样品所需沉淀量选择时间，一般开始时可选1小时）；(2)12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer（20L） 和1% SDS(1L)充分混悬溶解样品；(3)加入还原试剂2L，混匀，60 反应1h；(4)加入半胱氨酸封闭试剂（cystine blocking regent）1L,室温处理10分钟；(5)按照酶：蛋白质=1：20的比例加入trypsin酶,37酶解过夜（16h）；(6)113,114,115,116,117,118,119,121各管标记试剂中加入50L异丙醇(试剂盒中自带），混匀，分别加入各管样品中，室温反应1h，之后各加入3倍体积的水，使标记试剂分解。标记和样品对应关系如下:4R117,未知118，BOO6119,11R121；(7)合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。ITRAQ详细实验步骤4 4： 除盐，此步操作是将标记过程中的标记试剂和相关除盐，此步操作是将标记过程中的标记试剂和相关bufferbuffer的盐除的盐除去，以便于后续分析。去，以便于后续分析。 （1）100%乙腈冲洗柱子3次 （2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次 （3）用400uL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上 （4）0.1%TFA 冲洗柱子35次 （5）用50%乙腈 0.1%TFA 400L洗脱下样品 （6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。ITRAQ详细实验步骤5 5: : 第一维强阳离子柱第一维强阳离子柱(SCX)(SCX)分离分离（1 1）仪器及试剂：）仪器及试剂： 色谱仪20AD(岛津) 真空离心浓缩机(Christ RVC 2-25，Christ，Germany) 磷酸二氢钾(国药集团) 氯化钾(国药集团) 乙腈ACN(Fisher)（2 2）具体操作参数）具体操作参数 柱子信息：Polysulfoethyl column,2.1mm*100mm,5u,200A, The Nest Group,Inc.MA A相：10mM KH2PO4，25% CAN，PH 2.6 B相：10mM KH2PO4，350mM KCl，25%ACN，PH 2.6 紫外检测波长：214nm/280nm 流速：200L/min 梯度：60min B% B%从从5 5分钟分钟5%5%到到4040分钟上升至分钟上升至25%25% Time(min) B% 0 0 5 5 40 25 45 80 50 80 51 0 60 stop 根据峰型和时间共收取20个梯度,真空离心浓缩后，用50L RPLC A相5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)溶解，进行第二维分析。ITRAQ详细实验步骤6 6: : 第二维反相液质联用第二维反相液质联用RPLC-MSRPLC-MS（1 1）仪器及试剂）仪器及试剂 色谱仪20AD(岛津) 质谱仪 QSTAR XL（Applied Biosystem,USA） 乙腈ACN(Fisher) 甲酸（TEDIA）（2 2）具体操作参数）具体操作参数 反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 m, 300A, 0.1 x 150mm ，microm ,USA) 色谱分离90min，梯度B%从5分钟5%到70分钟上升至35%。 A相：5%ACN,0.1%甲酸 B相：95%ACN,0.1%甲酸 流速： 300nL/min Time(min) B% 5 5% 90 35% 95 80% 100 80% 105 5% 120 stop质谱鉴定：MS扫描范围400-1800 MS/MS扫描范围100-2000 IDA 采集模式 一个图谱选择四个最强的母离子进行串级扫描。ITRAQ详细实验步骤7 7: : 数据检索数据检索iTRAQ的质谱分析是由Thermo Q-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件采用Thermo公司的配套商用软件Proteome Discoverer1.3处理。 THANKS!THANKS!