抗生素抗生素发酵工酵工艺一、概述一、概述 利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。 绪论二、抗生素的发展史u 我国早在宋朝真宗（我国早在宋朝真宗（998-1022）年代就开始）年代就开始利用接种人痘的免疫技术预防天花病。利用接种人痘的免疫技术预防天花病。u 1796年英国医生年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。花并获得成功。 u1929：Fleming在葡萄在葡萄球菌培养皿中，污染的球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑霉菌周围出现透明的抑菌圈。菌圈。u杀菌物质，断言太不稳杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药定，无法分离并用作药物。物。u1939：牛津病理家：牛津病理家Howard Florey，化学，化学家家Ernst Chain，Norman Heatley.发酵发酵瓶培养霉菌，培养里提瓶培养霉菌，培养里提取测活性，青霉素结晶。取测活性，青霉素结晶。u1940:8只注射链球菌，只注射链球菌，提取物对提取物对4只治疗。未经只治疗。未经治疗鼠在治疗鼠在24小时内死亡，小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。治疗鼠存活数天至数周。u1941年年2月开始治疗第一月开始治疗第一批人类病人。批人类病人。u1943：威斯康辛大学小：威斯康辛大学小组，取得突破组，取得突破u生产菌表面培养：几十生产菌表面培养：几十个单位个单位u深层培养产黄青霉：深层培养产黄青霉：100U/mluX、UV诱变育种：诱变育种：1000-1500U/mlu不产色素变种：不产色素变种：66000-70000U/mlu1941年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空气并进行搅拌的深层发酵法。这种方法给发酵工业带气并进行搅拌的深层发酵法。这种方法给发酵工业带来了革命性的变化。自此以后制药业走进了抗生素时来了革命性的变化。自此以后制药业走进了抗生素时代代u我国微生物发酵制药工业起步较晚，我国微生物发酵制药工业起步较晚，1953年，我国第年，我国第一家青霉素生产厂一家青霉素生产厂上海第三制药厂才建成投产。上海第三制药厂才建成投产。u1958年，我国最大的抗生素制药企业年，我国最大的抗生素制药企业华北制药厂在华北制药厂在石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等。素和红霉素等。三、抗生素药物的分类抗细菌：青霉素、红霉素、四环素抗细菌：青霉素、红霉素、四环素抗真菌：两性霉素抗真菌：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素、制霉菌素、灰黄霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺四、微生物发酵研究范围 微生物发酵制药是利用微生物进行药物研微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯括微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。化工艺等。 主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的确定、药物发酵过程的优化控制、质艺与主要参数的确定、药物发酵过程的优化控制、质量控制等。量控制等。 第一章 微生物药物的产生菌常见的制药用微生物常见的制药用微生物 细菌细菌 放线菌放线菌 真菌真菌细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)放线菌 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora) 多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes） 典型代表： 济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964)真菌之曲霉属(Aspergillus) 生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum) 产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C 第二节 制药微生物的育种菌种选育菌种选育菌种筛选菌种筛选菌种保藏菌种保藏菌种的退化和复壮菌种的退化和复壮一、发酵菌种的选育要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素发酵菌种的选育方法从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程（1）从自然界中获得新菌种u土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等u基本程序： 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株（2）诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等u杂交育种杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换u原生质体融合育种原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换u基因工程育种基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广二、菌种筛选（1） 随机筛选随机筛选 摇瓶筛选法、琼脂块筛选法摇瓶筛选法、琼脂块筛选法（2）理性化筛选）理性化筛选 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选营养缺陷型突变株筛选营养缺陷型突变株三、菌种保藏(Culture conservation) 目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。 原理：根据微生物的生理、生化特性，人工创造原理：根据微生物的生理、生化特性，人工创造条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子。进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子。通过保藏可以减少微生物的新陈代谢，降低菌种变异通过保藏可以减少微生物的新陈代谢，降低菌种变异的几率。的几率。菌种保藏三要素典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。菌种保藏的常用方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4保藏各种微生物的中短期保藏，不适用某些能分解烃类的菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4保藏产孢子微生物和芽孢细菌的长期保藏，不适用对干燥敏感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4保藏产孢子霉菌和某些放线菌，工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/10年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196），需超低温液氮设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保存专性活细胞寄生微生物（如病毒）u菌种保藏机构ATCC（美国典型菌种保藏中心）CMCC (中国医学微生物菌种保藏管理中心)NBRC (日本技术评价研究所生物资源中心)四、菌种的退化和复壮退化：退化： 基因突变基因突变 连续传代连续传代 环境不良或污染环境不良或污染了杂菌了杂菌生产能力下降生产能力下降抵抗不良环境条件抵抗不良环境条件能力减弱能力减弱复壮纯种分离纯种分离 粗放、精细粗放、精细寄主复壮寄主复壮选择合适的培养条件选择合适的培养条件 改变营养成分、酸碱度、培养温度改变营养成分、酸碱度、培养温度第二章 培养基第一节第一节 培养基的成分培养基的成分 原则：原则： 根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产物的需求。物的需求。 一、碳源 工业常用： 糖蜜（营养丰富，物美价廉） 玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代谢过快的弊病） 油脂（消除泡沫） 糊精第一节第一节 培养基的成分培养基的成分二、氮源有机氮源：有机氮源： 黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉鱼粉无机氮源：无机氮源： 铵盐、硝酸盐、氨水铵盐、硝酸盐、氨水三、无机盐和微量元素磷（链霉素、四环素）硫（青霉素、头孢菌素）铁（青霉素、四环素、麦迪霉素）镁（卡那霉素、新生霉素、链霉素）锌（链霉素、青霉素）氯（金霉素、灰黄霉素）四、前体 前体是指加入到发酵培养基中的能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去而自身结构没有显著变化的一类小分子物质。 注意：少量多次注意：少量多次 五、促进剂和抑制剂 促进剂是指那些既不是营养物质又不是前促进剂是指那些既不是营养物质又不是前体却能提高产物产量的添加剂。体却能提高产物产量的添加剂。 抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累起来。起来。六、生长因子 那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物。衍生物。第二节 培养基的类型类别：按组成成分分类别：按组成成分分 合成培养基：成分明确、稳定，多用于研究和育合成培养基：成分明确、稳定，多用于研究和育种，不适合大规模生产。种，不适合大规模生产。 天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格低廉、适于工业生产。低廉、适于工业生产。按培养基的物理状态分固体培养基：适合菌种的培养和保存固体培养基：适合菌种的培养和保存半固体培养基半固体培养基液体培养基：适合发酵工业大规模使用液体培养基：适合发酵工业大规模使用按培养基的生产用途分孢子培养基孢子培养基 供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。 条件：培养基营养不要太丰富条件：培养基营养不要太丰富 无机盐浓度适当无机盐浓度适当 培养基的培养基的PH值要适中值要适中 常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基玉米培养基二、种子培养基 种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培养基，营养成分要比较丰富、完全、易被菌体利用。养基，营养成分要比较丰富、完全、易被菌体利用。 营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵等。母粉、硫酸铵等。三、发酵培养基 发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的培养基。培养基。 注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效营养，多加迟效营养，比例适宜。营养，多加迟效营养，比例适宜。第三节 培养基的设计与选择一、培养基的设计一、培养基的设计 遵循的原则：遵循的原则： 1、营养物质满足微生物生命活动的需要、营养物质满足微生物生命活动的需要 2、营养物质的浓度及配比适当、营养物质的浓度及配比适当 3、PH值适宜值适宜 4、符合培养的目标、符合培养的目标 5、原料来源广泛，价格合理、原料来源广泛，价格合理二、培养基的选择1、液体培养基和固体培养基的选择、液体培养基和固体培养基的选择 液体培养基：液体培养基：种子培养及大规模发酵生产。种子培养及大规模发酵生产。 固体培养基：固体培养基：微生物菌种的分离、纯化及保存、微生物菌种的分离、纯化及保存、菌落特征鉴定、活细胞数目测定菌落特征鉴定、活细胞数目测定2、根据微生物的营养特点选择培养基、根据微生物的营养特点选择培养基3、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基4、考虑培养基的成本、考虑培养基的成本 选择原则：选择原则： 产物或菌体得率大的产物或菌体得率大的 降低产品的分离提纯成本降低产品的分离提纯成本 生产能力最高的生产能力最高的 副产品生成最少副产品生成最少 原料质量稳定，供应充足原料质量稳定，供应充足 工艺过程较易进行工艺过程较易进行第四节 影响培养基质量的因素一、培养基组成配比的影响一、培养基组成配比的影响二、培养基原材料质量的影响二、培养基原材料质量的影响三、水质的影响三、水质的影响四、灭菌的影响四、灭菌的影响五、其他因素的影响五、其他因素的影响一、培养基组成配比的影响氮源过多：菌体生长旺盛，氮源过多：菌体生长旺盛，PH值偏高，不利于代谢值偏高，不利于代谢产物积累。产物积累。氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。碳源过多：碳源过多：PH值偏低。值偏低。碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。二、培养基原材料质量的影响 有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白胨）、碳源（油脂）胨）、碳源（油脂） 消除原则：在工业生产中必须严加控制，按质量标准消除原则：在工业生产中必须严加控制，按质量标准进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。三、水质影响 孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。四、灭菌的影响 严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减少营严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减少营养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组分应单独灭菌。分应单独灭菌。五、其他因素影响1、培养基的、培养基的PH值值 培养基培养基PH值的调节应主要通过改变培养基营养物值的调节应主要通过改变培养基营养物质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完成。少量培养基的成。少量培养基的PH值可用缓冲液加以缓冲。值可用缓冲液加以缓冲。2、培养基的黏度、培养基的黏度 黏度适宜黏度适宜第三章 灭菌第一节第一节 灭菌的原理和方法灭菌的原理和方法 灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命有机体的过程。及设备中所有生命有机体的过程。一、常用的灭菌方法一、常用的灭菌方法 化学物质灭菌化学物质灭菌 辐射灭菌辐射灭菌 过滤介质灭菌过滤介质灭菌 加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）1、化学物质灭菌、化学物质灭菌 试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、过氧乙酸、漂白粉等。过氧乙酸、漂白粉等。 适用范围：生产环境或小型器具。不适用于培养基适用范围：生产环境或小型器具。不适用于培养基的灭菌。的灭菌。2、辐射灭菌、辐射灭菌 用于灭菌的射线包括紫外线、用于灭菌的射线包括紫外线、X射线、射线、射线，其中射线，其中以紫外线最常用。以紫外线最常用。 紫外线主要用于无菌室、培养间等空间的灭菌。紫外线主要用于无菌室、培养间等空间的灭菌。 3、过滤介质除菌、过滤介质除菌 主要用于澄清液体及气体的除菌主要用于澄清液体及气体的除菌4、加热灭菌、加热灭菌 （1）干热灭菌）干热灭菌 火焰灭菌：火焰灭菌： 主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部及无用的污染物或实验动物的尸种移液管和滴管外部及无用的污染物或实验动物的尸体等灭菌。体等灭菌。 金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片灭菌时，应先将其浸泡在灭菌时，应先将其浸泡在75%酒精溶液中，使用时从酒精溶液中，使用时从酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。 热空气灭菌热空气灭菌 生产上常用的灭菌条件为生产上常用的灭菌条件为160-170、1-1.5h。 （2）湿热灭菌）湿热灭菌 利用饱和蒸汽灭菌。广泛用于工业生产中大量培利用饱和蒸汽灭菌。广泛用于工业生产中大量培养基、设备、管路及阀门的灭菌。养基、设备、管路及阀门的灭菌。二、湿热灭菌原理 热阻热阻:指某一微生物在某一种特定条件（主要是温指某一微生物在某一种特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。第二节 培养基和发酵设备的灭菌 过程一、灭菌前的准备工作一、灭菌前的准备工作 设备检查设备检查二、培养基及发酵设备的灭菌（一）空罐灭菌（一）空罐灭菌 空罐灭菌又称空消，是指将饱和蒸汽通入空罐灭菌又称空消，是指将饱和蒸汽通入未加培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的未加培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。过程。 优点：罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。优点：罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。 适用范围：没有使用的发酵罐、染菌罐、发酵罐适用范围：没有使用的发酵罐、染菌罐、发酵罐更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及附属设备。更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及附属设备。（二）实罐灭菌 实罐灭菌又称为分批灭菌，是将饱和蒸汽直接通实罐灭菌又称为分批灭菌，是将饱和蒸汽直接通入装有配制好的培养基的发酵设备中进行灭菌的一种入装有配制好的培养基的发酵设备中进行灭菌的一种方法，简称实消。方法，简称实消。 优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，操作简优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，操作简单，灭菌效果可靠。单，灭菌效果可靠。 缺点：设备利用率较低；灭菌过程需要时间较长，缺点：设备利用率较低；灭菌过程需要时间较长，培养基营养成分破坏较多。培养基营养成分破坏较多。 该法多用于中小型发酵罐和种子罐的灭菌。该法多用于中小型发酵罐和种子罐的灭菌。注意：1、原料切忌结块，配料时应开动搅拌器，将各种粉饼块、原料切忌结块，配料时应开动搅拌器，将各种粉饼块打碎、搅拌均匀。打碎、搅拌均匀。2、凡进口在培养基液面下的管道应不断通入蒸汽，在、凡进口在培养基液面下的管道应不断通入蒸汽，在液面上的其余各管应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻液面上的其余各管应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。底，不留死角。3、灭菌工程中要不时地搅拌，以利于泡沫破裂。、灭菌工程中要不时地搅拌，以利于泡沫破裂。（三）连续灭菌 连续灭菌是将培养基在发酵罐外，通过专用灭菌连续灭菌是将培养基在发酵罐外，通过专用灭菌装置，连续不断加热，维持保温和冷却后，送入已灭装置，连续不断加热，维持保温和冷却后，送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，又称连消。菌的发酵罐内的工艺过程，又称连消。 优点：发酵罐利用率高；热能利用较合理，适于优点：发酵罐利用率高；热能利用较合理，适于自动化控制。自动化控制。 缺点：设备多，投资大，中小型发酵生产企业应缺点：设备多，投资大，中小型发酵生产企业应用较少。用较少。根据灭菌过程中使用的设备及工艺，将连消分为三种形式：1、由连消塔、维持罐和冷却器组成的灭菌系统、由连消塔、维持罐和冷却器组成的灭菌系统 该灭菌系统使用的设备包括：配料罐、连消塔、维该灭菌系统使用的设备包括：配料罐、连消塔、维持罐、冷却器。持罐、冷却器。2、蒸汽喷射连续灭菌系统、蒸汽喷射连续灭菌系统 喷射式加热器在国内大多数发酵工厂采用的培养基喷射式加热器在国内大多数发酵工厂采用的培养基加热装置。加热装置。3、由热交换器组成的灭菌系统、由热交换器组成的灭菌系统 板式热交换器传热系数大，流程利用合理，节省大板式热交换器传热系数大，流程利用合理，节省大量的蒸汽和冷却水，因而广泛利用。量的蒸汽和冷却水，因而广泛利用。 三、发酵罐附属设备、空气过滤器及管路等的灭菌（一）发酵罐附属设备的灭菌（一）发酵罐附属设备的灭菌 包括补料罐、计量罐和油罐等。包括补料罐、计量罐和油罐等。 空罐灭菌使罐内蒸汽压力达到空罐灭菌使罐内蒸汽压力达到1.5105Pa，保温，保温45min。 补料罐的实罐灭菌条件应视物料性质而定。补料罐的实罐灭菌条件应视物料性质而定。（二）空气过滤器的灭菌 灭菌时，总蒸汽压力为（灭菌时，总蒸汽压力为（3-3.5）105Pa，总过滤器，总过滤器保温灭菌时间为保温灭菌时间为1.5-2h，吹干时间为，吹干时间为2-4h；中小型过；中小型过滤器一般保温滤器一般保温45-60min，吹干需，吹干需1-2h。（三）管路的灭菌 管路灭菌所用的蒸汽压力一般为（管路灭菌所用的蒸汽压力一般为（3-3.5）105Pa，灭菌保温时间为灭菌保温时间为1h二、培养基及发酵设备的灭菌（一）空罐灭菌（一）空罐灭菌 定义：又称空消。是指将饱和蒸汽通入未加入培养定义：又称空消。是指将饱和蒸汽通入未加入培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。 优点：空罐灭菌时，罐内死角少，蒸汽传热效率高，优点：空罐灭菌时，罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。灭菌效果好。 第三节 常见灭菌问题的分析及处理一、影响培养基灭菌的因素一、影响培养基灭菌的因素 培养基成分培养基成分 油脂、糖类、蛋白质、有机物需要灭菌温度高；油脂、糖类、蛋白质、有机物需要灭菌温度高；盐类、色素有利于灭菌的进行。盐类、色素有利于灭菌的进行。 PH值值 培养积极的培养积极的PH值愈低，灭菌所需的时间愈短。值愈低，灭菌所需的时间愈短。 培养基中的颗粒大小培养基中的颗粒大小 1mm的颗粒影响不大。的颗粒影响不大。 泡沫泡沫 加入少量消泡剂加入少量消泡剂 二、灭菌过程中常见的问题及处理方法灭菌后培养基质量差灭菌后培养基质量差 控制好灭菌温度及灭菌时间、调整好原料的灭菌顺序控制好灭菌温度及灭菌时间、调整好原料的灭菌顺序空气突然中断空气突然中断 关闭个空气进气阀。处理顺序：发酵罐关闭个空气进气阀。处理顺序：发酵罐种子罐种子罐补料罐补料罐消沫剂罐消沫剂罐计量罐。计量罐。 蒸汽压力变化蒸汽压力变化 空气过滤器压差过大空气过滤器压差过大 饱和蒸汽温度与压力不对应饱和蒸汽温度与压力不对应 消后培养基带菌：设备损坏、密封不严以及空气过滤消后培养基带菌：设备损坏、密封不严以及空气过滤系统带菌等系统带菌等 第四章 种子的扩大培养 种子的制备是指由保藏的菌种开始，经过不断的种子的制备是指由保藏的菌种开始，经过不断的扩大培养，使菌体数量达到能够满足生产中发酵罐或扩大培养，使菌体数量达到能够满足生产中发酵罐或者实验室摇瓶发酵接种量的需要所涉及的菌种培养的者实验室摇瓶发酵接种量的需要所涉及的菌种培养的过程。过程。适合于工业化发酵生产的种子必须满足以下条件：适合于工业化发酵生产的种子必须满足以下条件：1、生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。、生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。2、菌体的生理特性及生产能力稳定。、菌体的生理特性及生产能力稳定。3、菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求。、菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求。4、无杂菌污染。、无杂菌污染。 以抗生素发酵生产的种子制备过程为例：以抗生素发酵生产的种子制备过程为例： 其种子的制备一般包括在固体培养基上生产大量其种子的制备一般包括在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中培养大量菌丝的种孢子的制备过程和在液体培养基中培养大量菌丝的种子制备工程。子制备工程。第一节 固体孢子制备 一般繁殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子一般繁殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子进罐。进罐。一、孢子制备的过程一、孢子制备的过程1、霉菌孢子制备、霉菌孢子制备 多数采用大米、小米、麦麸之类的自然培养基。多数采用大米、小米、麦麸之类的自然培养基。 优点：培养基简单易得、成本低、培养基比表面积优点：培养基简单易得、成本低、培养基比表面积大，获得孢子数量比营养琼脂斜面多。大，获得孢子数量比营养琼脂斜面多。e.g 产黄青霉菌产黄青霉菌(P.chrysogonum) 原始菌种原始菌种 斜面试管斜面试管 获得孢子获得孢子 250ml 茄茄子瓶（大米或小米）子瓶（大米或小米） 25 28 ，414天天 成熟（在成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于以下，于4 冰冰箱保存）。箱保存）。 对于不产孢子的赤霉素生产菌对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。 产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（如产链霉素的灰色链霉菌（Sgriseus ），产卡），产卡那霉素的卡那链霉菌那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可），可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（杆菌（Corynebacterium）、短杆菌）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。悬液再接种。2、放线菌孢子制备、放线菌孢子制备 放线菌的孢子多数采用琼脂斜面培养基来制备，放线菌的孢子多数采用琼脂斜面培养基来制备，培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、蛋白培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、蛋白胨和一些无机盐类物质等。胨和一些无机盐类物质等。 放线菌的发酵生产工艺流程：放线菌的发酵生产工艺流程：沙土管沙土管母斜面母斜面子斜面子斜面种子罐种子罐发酵罐发酵罐沙土管沙土管母斜面母斜面摇瓶菌丝摇瓶菌丝种子罐种子罐发酵罐发酵罐3、细菌孢子制备、细菌孢子制备 发酵生产的工艺流程：发酵生产的工艺流程： 安剖管安剖管斜面斜面F1（第一代）（第一代）斜面斜面F2（第二代）（第二代）种子罐种子罐发酵罐发酵罐 细菌的培养温度多为细菌的培养温度多为37，培养时间一般为，培养时间一般为1-2天。天。二、孢子制备的技术要点1、霉菌类、霉菌类 菌落分散、挑选菌落中央的孢子、孢子悬液浓度菌落分散、挑选菌落中央的孢子、孢子悬液浓度适当、混合均匀。适当、混合均匀。2、放线菌类、细菌类、放线菌类、细菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面。灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面。待斜面凝固后置待斜面凝固后置37培养培养2-3天，经检查无杂菌和无冷天，经检查无杂菌和无冷凝水后备用。凝水后备用。 第二节 液体种子制备 液体种子的制备是将固体培养基上培养好的孢子液体种子的制备是将固体培养基上培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。丝或菌体的过程。 生产种子的制备包括：摇瓶种子制备和种子罐种生产种子的制备包括：摇瓶种子制备和种子罐种子制备。子制备。一、摇瓶种子制备 将斜面种子或米孢子接种入装在锥形瓶内的液体将斜面种子或米孢子接种入装在锥形瓶内的液体营养培养基中，在摇床上进行振荡培养所获得的液体营养培养基中，在摇床上进行振荡培养所获得的液体种子，称作摇瓶种子。种子，称作摇瓶种子。1、工艺流程、工艺流程 培养基配制培养基配制分装分装灭菌灭菌接种接种恒温振荡培养恒温振荡培养摇摇瓶种子瓶种子 斜面种子或米孢子斜面种子或米孢子2、培养基配制、培养基配制 培养基的配方和培养条件与种子罐相似，要求氮培养基的配方和培养条件与种子罐相似，要求氮源丰富，利于菌丝生长。源丰富，利于菌丝生长。3、接种、接种 采用菌悬液接种法，即用无菌蒸馏水将斜面种子采用菌悬液接种法，即用无菌蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或孢子悬或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或孢子悬液，按一定题解或者一定细胞数接种至摇瓶种子培养液，按一定题解或者一定细胞数接种至摇瓶种子培养基中。基中。4、培养、培养 摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式，抗生素工厂一般采用的是旋转式。和往复式，抗生素工厂一般采用的是旋转式。5、保存、保存 摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果不使用，摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果不使用，可置可置4冰箱中保存，保存期最好不要超过冰箱中保存，保存期最好不要超过3天。天。二、种子罐种子制备 种子罐的作用是使接入种子罐内数量有限的孢子发芽、种子罐的作用是使接入种子罐内数量有限的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐的需要。生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐的需要。 孢子或者摇瓶菌丝接入到体积较小的种子罐中，经孢子或者摇瓶菌丝接入到体积较小的种子罐中，经过培养后形成大量的菌丝，该种子称为一级种子。过培养后形成大量的菌丝，该种子称为一级种子。 把一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。把一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。 种子罐级数越少越好，原因：种子罐级数越少越好，原因： 1、简化生产工艺和控制、简化生产工艺和控制2、减少接种带来的染菌机会、减少接种带来的染菌机会 接种量接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比培养液的体积比。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。 采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。峰的时间，使产物形成提前。原因：原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用质的利用、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。 但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。度增加，溶氧降低，产物合成受影响。 e.g. 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 接种接种1%，酶活最高；，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于影响不大；大于4%，酶产量明，酶产量明显下降。显下降。第三节 种子质量的控制与分析 发酵生产水平发酵生产水平 种子质量种子质量 菌体本身的遗传特性和培养条件菌体本身的遗传特性和培养条件一、影响孢子质量的因素及其控制1、培养基、培养基原材料的产地、品种、加工方法以及用量原材料的产地、品种、加工方法以及用量水质（地区、季节和水源污染）水质（地区、季节和水源污染）菌种不同菌种不同氮源品种氮源品种2、培养条件 温度温度 培养温度控制低一些，有利于孢子的形成。培养温度控制低一些，有利于孢子的形成。 湿度湿度 在北方相对湿度控制在在北方相对湿度控制在40%-45%，而南方相对湿度，而南方相对湿度控制在控制在35%-42%，所得孢子质量较好。，所得孢子质量较好。 真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。 培养时间培养时间 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。接种量接种量 一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。二、影响种子质量的因素及其控制1、培养基、培养基 要求要求 氮源和维生素含量较高；营养成分尽可能与发氮源和维生素含量较高；营养成分尽可能与发酵培养基接近。酵培养基接近。2、培养条件、培养条件 选择最适温度；前期需氧量较少，后期需氧量较多，选择最适温度；前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量；补料工艺应适当增大供氧量；补料工艺3、种龄、种龄 在工业发酵生产中，一般都选在生命力最旺盛的对在工业发酵生产中，一般都选在生命力最旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。4、接种量、接种量 多数抗生素发酵的接种量为多数抗生素发酵的接种量为7%-15%，有时可加大到，有时可加大到20%-25%。三、种子质量标准1、种子的生长状况、种子的生长状况 菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。量的重要指标。2、营养物质含量与、营养物质含量与PH值变化值变化3、产物生产量、产物生产量4、特殊酶活力、特殊酶活力四、种子异常分析1、菌种生长发育缓慢或过快、菌种生长发育缓慢或过快 通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。2、菌丝结团、菌丝结团 菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。3、菌丝黏壁、菌丝黏壁 菌丝黏壁主要原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过菌丝黏壁主要原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过多，以及种子罐的装料系数过小等。多，以及种子罐的装料系数过小等。第四节 青霉素生产的种子制备制备过程制备过程 安剖管安剖管斜面孢子斜面孢子大米孢子大米孢子一级种子一级种子二级种二级种子子发酵发酵一、斜面孢子 培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等 培养条件：培养条件：25、7天、湿度天、湿度50% 培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细二、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养条件：培养条件：25、7天、控制湿度天、控制湿度培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和养的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于和养的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。孢子的生长。3、一级种子、一级种子 培养基培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：培养条件：27，40小时小时 接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨 目的：长菌体目的：长菌体4、二级种子、二级种子 培养基：同上培养基：同上 培养条件：培养条件：27、10-14小时小时 接种量：接种量：10%种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于于3-4期。期。 青霉素发酵菌丝体的生长期共分青霉素发酵菌丝体的生长期共分6期，期，1-4期为年青期为年青期，期，4-6期合成青霉素的能力最强。期合成青霉素的能力最强。第五章 无菌空气的制备第一节第一节 过滤除菌的基本原理过滤除菌的基本原理一、基本概念一、基本概念 无菌空气：指不含有微生物菌体的空气。无菌空气：指不含有微生物菌体的空气。 深层过滤：利用介质纤维的层层阻隔，迫使空气在深层过滤：利用介质纤维的层层阻隔，迫使空气在流动过程中出现无数次改变汽速大小和方向的绕流运流动过程中出现无数次改变汽速大小和方向的绕流运动，导致微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩动，导致微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微粒截留、捕集散、重力及静电引力等作用，从而把微粒截留、捕集在纤维表面上，实现了过滤除菌的目的。在纤维表面上，实现了过滤除菌的目的。二、深层介质过滤除菌原理二、深层介质过滤除菌原理 扩散截留效应扩散截留效应 重力沉降截留效应重力沉降截留效应 惯性冲击截留效应惯性冲击截留效应 拦截截留效应拦截截留效应 吸附截留效应吸附截留效应第二节 常见的过滤介质一、纤维过滤介质1、棉花 要求新鲜，纤维长二疏松，填充均匀，最后压紧，不得使用脱脂棉。2、玻璃纤维 阻力小二、颗粒活性炭过滤介质二、颗粒活性炭过滤介质 该介质过滤强度高，表面积大，空隙大，阻力小，该介质过滤强度高，表面积大，空隙大，阻力小，过滤效率低，只有棉花阻力的过滤效率低，只有棉花阻力的1/12，常与棉花配合使，常与棉花配合使用用。 三、纸过滤介质1、超细玻璃纤维过滤、超细玻璃纤维过滤 用无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，属高气速过滤，气用无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，属高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但是其强度高，易断，多用流速度越高，效率越高。但是其强度高，易断，多用于分过滤器。可采取的措施：于分过滤器。可采取的措施：环氧树脂；环氧树脂；多层复多层复合使用。合使用。2、聚丙烯纤维滤纸、聚丙烯纤维滤纸 结构强度好，不易被水汽浸润。结构强度好，不易被水汽浸润。四、板过滤介质1、石棉滤板、石棉滤板 对人体危害较大，目前使用已经较少。对人体危害较大，目前使用已经较少。2、烧结金属板、烧结金属板 金属粉末颗粒经烧结形成的多孔固体材料金属粉末颗粒经烧结形成的多孔固体材料。五、膜过滤介质 膜过滤是接近于绝对过滤原理的过滤方式，可完全膜过滤是接近于绝对过滤原理的过滤方式，可完全截留病毒、噬菌体、微生物孢子等微小生物体。耐截留病毒、噬菌体、微生物孢子等微小生物体。耐121反复蒸汽灭菌，公认的最安全，保险。反复蒸汽灭菌，公认的最安全，保险。1、PVDF2、HFGF3、PTFEMilipore公司：孔径公司：孔径0.1-0.22，小于细菌直径。，小于细菌直径。Domnick-Huntev公司：公司：0.01，小于噬菌体。，小于噬菌体。第三节 无菌空气的制备过程1、空气除菌流程：、空气除菌流程： 空气空气高空取气管高空取气管除尘器除尘器空气压缩机空气压缩机贮气罐贮气罐一级冷却器一级冷却器油水分离器油水分离器二级分离器二级分离器除雾气除雾气加加热器热器总过滤器总过滤器分过滤器分过滤器无菌空气进发酵罐无菌空气进发酵罐一、空气的预处理过程1、空气的采集和压缩、空气的采集和压缩 采集：空气采集口一般设置距离地面至少采集：空气采集口一般设置距离地面至少10-15m，远离尘埃集中位置，尽量设置于上风口方向；空气自远离尘埃集中位置，尽量设置于上风口方向；空气自采集口进入空气压缩机前先通过粗过滤装置去除大的采集口进入空气压缩机前先通过粗过滤装置去除大的尘埃颗粒。尘埃颗粒。 压缩：涡轮空压机和往复式空压机压缩：涡轮空压机和往复式空压机2、压缩空气除油水 气液分离器：旋风分离器和丝网过滤器，一般联合气液分离器：旋风分离器和丝网过滤器，一般联合使用使用。3、空气再加热 热交换器或空压机输送的高温压缩空气与冷却空热交换器或空压机输送的高温压缩空气与冷却空气进行热量交换气进行热量交换二、空气过滤除菌 1、发酵车间设置总过滤器一组，对预处理后压缩、发酵车间设置总过滤器一组，对预处理后压缩空气进行粗过滤，总过滤器主要使用膜过滤装置。空气进行粗过滤，总过滤器主要使用膜过滤装置。 2、进入发酵罐之前设置分过滤器，一般由预过滤、进入发酵罐之前设置分过滤器，一般由预过滤器和精过滤器组成。预过滤器目的保护精过滤器；精器和精过滤器组成。预过滤器目的保护精过滤器；精过滤器目的完全滤除空气可能含有的为生物体，确保过滤器目的完全滤除空气可能含有的为生物体，确保进罐空气达到工艺无菌要求。进罐空气达到工艺无菌要求。 第四节 无菌空气的微生物检测 空气微生物检测方法有平皿沉降法和采样培养法空气微生物检测方法有平皿沉降法和采样培养法 两大类型。两大类型。 平皿沉降法依靠空气中的微生物体自然沉降于琼平皿沉降法依靠空气中的微生物体自然沉降于琼脂平板上，用过一定时间的收集后培养计数。脂平板上，用过一定时间的收集后培养计数。 采样培养法则通过采集装置主动采集空气中微生采样培养法则通过采集装置主动采集空气中微生物离子，通过培养检测空气中微生物含量水平。物离子，通过培养检测空气中微生物含量水平。 实际操作中，考虑到无菌压缩空气的特殊性，一般实际操作中，考虑到无菌压缩空气的特殊性，一般不采用普通空气微生物的采集方法。采用的方法主要不采用普通空气微生物的采集方法。采用的方法主要有液体吹气培养法和液体吹气有液体吹气培养法和液体吹气-平皿培养法。平皿培养法。第六章 微生物药物的生物合成第一节第一节 微生物的代谢微生物的代谢代谢代谢初级代谢：微生物用于自身生长繁殖的营养物质的分解初级代谢：微生物用于自身生长繁殖的营养物质的分解合成。合成。次级代谢：某些微生物生长到稳定期后以结构简单、代次级代谢：某些微生物生长到稳定期后以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初级代谢产物为前体，通过谢途径明确、产量较大的初级代谢产物为前体，通过复杂的次生代谢途径所合成各种结构复杂的化合物。复杂的次生代谢途径所合成各种结构复杂的化合物。二、微生物的初级代谢和次级代谢的关系项目项目初级代谢初级代谢次级代谢次级代谢功能功能代谢产物主要针对生长必代谢产物主要针对生长必须的小分子化合物如：氨须的小分子化合物如：氨基酸、核苷酸、维生素等，基酸、核苷酸、维生素等，是合成生物大分子的材料是合成生物大分子的材料或辅酶；在各种生物中相或辅酶；在各种生物中相近或相同近或相同代谢产物非生长必需，但代谢产物非生长必需，但功能对产生菌在自然环境功能对产生菌在自然环境中的生存有益，化学结构中的生存有益，化学结构往往比较复杂，且种类繁往往比较复杂，且种类繁多；具种属甚至菌株的特多；具种属甚至菌株的特异性。异性。合成过程合成过程包括主要的碳氮代谢途径，包括主要的碳氮代谢途径，在各类生物中基本相同在各类生物中基本相同是初级代谢途径的延伸，是初级代谢途径的延伸，合成途径复杂，具特异性合成途径复杂，具特异性初级代谢和次级代谢途径密切相关，所涉及的酶系和初级代谢和次级代谢途径密切相关，所涉及的酶系和调控机制也是相互交错，彼此影响。调控机制也是相互交错，彼此影响。项目项目初级代谢初级代谢次级代谢次级代谢合成时期合成时期主要在生长期合成主要在生长期合成往往在生长停止后开始往往在生长停止后开始从初级代谢向次级代谢转换某些环境条件调控，主要从初级代谢向次级代谢转换某些环境条件调控，主要是营养限制或代谢产物累积限制是营养限制或代谢产物累积限制合成专一性合成专一性普遍存在，各种生物都能普遍存在，各种生物都能合成，只是速率不同，酶合成，只是速率不同，酶反应具有高度的专一性反应具有高度的专一性产物合成具有明显的种属产物合成具有明显的种属特异性，产物往往以一族特异性，产物往往以一族化合物的形式出现。化合物的形式出现。合成条件合成条件一般只需简单的营养条件，一般只需简单的营养条件，在各种可生长环境中代谢在各种可生长环境中代谢物均能形成物均能形成常需要复杂的营养条件，常需要复杂的营养条件，甚至需供给复杂的天然物甚至需供给复杂的天然物质，产物只能在某些特定质，产物只能在某些特定培养条件下合成培养条件下合成遗传控制遗传控制主要受染色体主要受染色体DNA控制控制受染色体受染色体DNA和质粒和质粒DNA的控制的控制第二节 微生物药物生物合成的基本途径一、微生物次级代谢产物生物合成的基本特征一、微生物次级代谢产物生物合成的基本特征合成滞后性合成滞后性受初级代谢的调节性受初级代谢的调节性菌种与产物的不对应性菌种与产物的不对应性代谢产物的不确定性代谢产物的不确定性代谢产物合成的不稳定性代谢产物合成的不稳定性二、次级代谢产物的生源1、聚酮体、聚酮体2、糖类、糖类3、肽类抗生素中的不常见氨基酸、肽类抗生素中的不常见氨基酸4、非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱、非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱5、吩恶嗪酮、吩恶嗪酮6、莽草酸、莽草酸7、甲羟戊酸、甲羟戊酸1、聚酮体聚酮体即含多个羰基的聚合物聚酮体即含多个羰基的聚合物聚酮体的组成单位聚酮体的组成单位 乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸l 聚酮体的起始单位聚酮体的起始单位 乙酰辅酶乙酰辅酶A、丙酰辅酶、丙酰辅酶A、丙二酰胺辅酶、丙二酰胺辅酶A和丁酰辅酶和丁酰辅酶A等等聚酮体的延伸单位聚酮体的延伸单位 丙二酰辅酶丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶、乙基丙二酰辅酶A等等3、肽类抗生素中不常见的氨基酸二、次级代谢产物生物合成的基本途径1、前体聚合2、修饰3、不同组分的装配第三节 微生物次级代谢产物生物合成的调节机制1、初级代谢对次级代谢的调节、初级代谢对次级代谢的调节2、碳代谢物的调节、碳代谢物的调节3、氮代谢物的调节、氮代谢物的调节4、磷酸盐的调节、磷酸盐的调节5、ATP调节调节6、酶的诱导调节、酶的诱导调节7、反馈调节、反馈调节8、细胞膜通透性调节、细胞膜通透性调节9、金属离子和溶解氧的调节、金属离子和溶解氧的调节初级代谢的调控机制1、酶活力调节、酶活力调节 酶的激活和抑制酶的激活和抑制2、酶合成调节、酶合成调节 酶的诱导和阻遏酶的诱导和阻遏1、初级代谢对次级代谢的调节当初级代谢与次级代谢具有共同的途径，而初级代谢当初级代谢与次级代谢具有共同的途径，而初级代谢产物过量时，往往会抑制次级代谢产物的合成。产物过量时，往往会抑制次级代谢产物的合成。2、碳代谢物的调节速效碳源速效碳源葡萄糖效应，一般情况下，凡能被微生物葡萄糖效应，一般情况下，凡能被微生物快速利用、促进菌体快速生长的碳源，对次级代谢产快速利用、促进菌体快速生长的碳源，对次级代谢产物合成都表现出抑制作用。是葡萄糖的降解产物抑制物合成都表现出抑制作用。是葡萄糖的降解产物抑制了包括几乎所有的微生物药物的次级代谢产物的合成。了包括几乎所有的微生物药物的次级代谢产物的合成。调节方式：少量多次流加；菌体生长和产物发酵其采调节方式：少量多次流加；菌体生长和产物发酵其采用不同的碳源。用不同的碳源。3、氮代谢物的调节研究发现：高浓度的铵离子抑制次级代谢产物的合成研究发现：高浓度的铵离子抑制次级代谢产物的合成是一个普遍的特征；无机氮源或简单的有机氮源能促是一个普遍的特征；无机氮源或简单的有机氮源能促进菌体生长，却不利于次级代谢产物合成；而利用较进菌体生长，却不利于次级代谢产物合成；而利用较慢的氮源可以防止和减缓但代谢物的阻遏作用，从而慢的氮源可以防止和减缓但代谢物的阻遏作用，从而有利于次级代谢产物合成。有利于次级代谢产物合成。其调节应针对不同氮源区别对待。菌体生长期可以添其调节应针对不同氮源区别对待。菌体生长期可以添加无机铵盐，而产物合成期采用复杂氮源。加无机铵盐，而产物合成期采用复杂氮源。4、磷酸盐调节促进初级代谢，抑制次级代谢促进初级代谢，抑制次级代谢抑制次级代谢产物前体的形成抑制次级代谢产物前体的形成阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成抑制碱性磷酸酯酶的合成抑制碱性磷酸酯酶的合成增加菌体能荷状态以促进初级代谢增加菌体能荷状态以促进初级代谢5、ATP调节ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。以四环素的合成为例：活性。以四环素的合成为例：6、酶的诱导调节在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，需要有诱导物存在时才能合成。诱导物一为诱导酶，需要有诱导物存在时才能合成。诱导物一般为酶的底物或底物类似物。有些需外源加入，有些般为酶的底物或底物类似物。有些需外源加入，有些可以内源产生。可以内源产生。7、反馈调节与初级代谢产物的调节机理类似，诱导调节通过底物与初级代谢产物的调节机理类似，诱导调节通过底物（诱导剂）诱导后，特异性酶才会被诱导产生；反馈（诱导剂）诱导后，特异性酶才会被诱导产生；反馈调节则是由于产物的过量积累导致的。调节则是由于产物的过量积累导致的。8、细胞膜通透性调节通过调节膜的通透性，影响摄入前体或排出产物而加通过调节膜的通透性，影响摄入前体或排出产物而加速次级代谢产物的合成，提高其产量。速次级代谢产物的合成，提高其产量。9、金属离子及溶解氧的调节金属离子，特别是二价阳离子，如金属离子，特别是二价阳离子，如Ca2+ 、Mg2+ 可以可以解除产生菌对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生解除产生菌对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。第七章 微生物发酵及工艺控制第一节第一节 发酵过程原理发酵过程原理一、发酵的基本概念一、发酵的基本概念1、微生物发酵、微生物发酵 利用微生物体来制得产物的需氧或厌氧的任何过程。利用微生物体来制得产物的需氧或厌氧的任何过程。2、初级代谢产物、初级代谢产物 关系到微生物新陈代谢过程中的能量代谢、细胞生关系到微生物新陈代谢过程中的能量代谢、细胞生长和细胞结构的代谢产物。长和细胞结构的代谢产物。3、次级代谢产物、次级代谢产物 微生物菌体在生长期不能合成的、一般在菌体生长微生物菌体在生长期不能合成的、一般在菌体生长静止期中合成的与菌体成长繁殖无明显关系的产物。静止期中合成的与菌体成长繁殖无明显关系的产物。二、发酵的基本类型1、生长关联型、生长关联型 特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰。的时间出现高峰。2、生长部分关联型、生长部分关联型 特点：发酵的第一时期菌体迅速增长，而产物的形成特点：发酵的第一时期菌体迅速增长，而产物的形成很少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长很少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长也可能出现第二个高峰。也可能出现第二个高峰。3、非生长关联型、非生长关联型 特点：产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长特点：产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期，即稳定期时期，即稳定期三、发酵方法微生物发酵有三种方式：微生物发酵有三种方式： 分批发酵（分批发酵（batch fermentation） 补料分批发酵（补料分批发酵（fed-batch fermentation） 连续发酵（连续发酵（continuous fermentation） 工业上防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大工业上防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。三、发酵方法1、分批式发酵（、分批式发酵（batch fermentation） 理论基础理论基础 把培养液一次性装入发酵罐，灭菌后接入一把培养液一次性装入发酵罐，灭菌后接入一定量的种子液，在最佳条件下进行发酵培养。定量的种子液，在最佳条件下进行发酵培养。 操作过程操作过程 大型发酵罐，一般不在罐内对培养基灭菌，大型发酵罐，一般不在罐内对培养基灭菌，而是利用专门的灭菌装置对培养基进行连续灭菌。而是利用专门的灭菌装置对培养基进行连续灭菌。 优缺点：优缺点： 发酵周期短，产品质量易控制，不易发生杂发酵周期短，产品质量易控制，不易发生杂菌污染，对原料组成要求较粗放。菌污染，对原料组成要求较粗放。 发酵体系中开始时基质浓度很高，到中后期发酵体系中开始时基质浓度很高，到中后期营养物质浓度很低，这对发酵反应不利。营养物质浓度很低，这对发酵反应不利。 2、流加式发酵理论基础理论基础 在分批式操作的基础上，开始时投入一定量的基础在分批式操作的基础上，开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程适当时期，开始连续补加碳源或培养基，到发酵过程适当时期，开始连续补加碳源或氮源或其他必需物质，但不取出培养液，直到发酵终氮源或其他必需物质，但不取出培养液，直到发酵终点，产率达最大化，停止补料，最后将发酵液一次全点，产率达最大化，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。部放出。操作过程操作过程 操作形式有两种：反馈控制和无反馈控制。操作形式有两种：反馈控制和无反馈控制。 无反馈控制包括定流量和定时间流加。无反馈控制包括定流量和定时间流加。 反馈控制根据反映体系中酸性物质的浓度来调节流反馈控制根据反映体系中酸性物质的浓度来调节流加速率。加速率。优缺点：优缺点： 优点：在发酵过程中慢慢地加入培养基，使其在发优点：在发酵过程中慢慢地加入培养基，使其在发酵液中保持适宜水平，同时又稀释了生成的产物浓度，酵液中保持适宜水平，同时又稀释了生成的产物浓度，避免了高浓度产物和底物的抑制作用，也防止了后期避免了高浓度产物和底物的抑制作用，也防止了后期养分不足而限制菌体生长。养分不足而限制菌体生长。 缺点：受发酵罐操作容积的限制缺点：受发酵罐操作容积的限制 3、半连续式发酵 概念概念 菌体和培养液一起装入发酵罐，在菌体生菌体和培养液一起装入发酵罐，在菌体生长过程中，每隔一定时间取出部分发酵培养物，同时长过程中，每隔一定时间取出部分发酵培养物，同时补充同等数量的新培养基，然后继续培养，直到发酵补充同等数量的新培养基，然后继续培养，直到发酵结束，取出全部发酵液。结束，取出全部发酵液。 优点：优点： 保持培养液总体积不变，同时可起到解除高浓保持培养液总体积不变，同时可起到解除高浓度基质和产物对发酵的抑制作用。度基质和产物对发酵的抑制作用。4、连续式发酵 菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中不断补充新培养基，同时取出包括培养液和养过程中不断补充新培养基，同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态的发酵条件，促进菌体的生长和产菌体处于恒定状态的发酵条件，促进菌体的生长和产物的积累。物的积累。连续发酵的控制方式：连续发酵的控制方式： 恒浊法：利用浊度来检测细胞的生长状况，通过自恒浊法：利用浊度来检测细胞的生长状况，通过自控仪表调节输入料液流量，以控制培养液中菌体浓度控仪表调节输入料液流量，以控制培养液中菌体浓度达到恒定值。达到恒定值。 恒化器法：通过恒定输入的养料中某一种生长限制恒化器法：通过恒定输入的养料中某一种生长限制基质的浓度来控制。基质的浓度来控制。单级连续发酵 连续发酵达到稳态时放掉发酵液中的细胞量等于生成连续发酵达到稳态时放掉发酵液中的细胞量等于生成细胞量。细胞量。 多级连续发酵 增加罐的级数和将菌体送回罐内增加罐的级数和将菌体送回罐内 连续式发酵优缺点优点：产率、生产质量、生产能力、生产稳定性、设优点：产率、生产质量、生产能力、生产稳定性、设备利用率和易于实现自动化方面比分批式发酵优越；备利用率和易于实现自动化方面比分批式发酵优越；还可以不断收获产物，提高菌体密度。还可以不断收获产物，提高菌体密度。缺点：杂菌污染机会增多，细胞易发生变异和退化。缺点：杂菌污染机会增多，细胞易发生变异和退化。适用范围生产能力大，微生物变异小，酶活稳定，产品需连续生产能力大，微生物变异小，酶活稳定，产品需连续处理的工业体系，仅限用于纯培养要求不高的情况。处理的工业体系，仅限用于纯培养要求不高的情况。第二节 发酵条件的影响及其工艺控制常规发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、常规发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体等的设定和控制。罐压、液位、补料、加糖、油或前体等的设定和控制。能表征过程性质状态的参数：能表征过程性质状态的参数：PH值、溶氧、溶解值、溶氧、溶解CO2、氧化还原电位、尾气、氧化还原电位、尾气O2和和CO2含量、基质或产物浓度、含量、基质或产物浓度、代谢中间体或前体浓度、菌体浓度代谢中间体或前体浓度、菌体浓度一、温度的影响和控制1、温度对发酵的影响、温度对发酵的影响 温度影响微生物发酵化学反应速度温度影响微生物发酵化学反应速度 温度影响发酵液的物理性质温度影响发酵液的物理性质 温度改变产物合成方向、稳定性温度改变产物合成方向、稳定性 温度选择还应参考其他发酵条件，灵活掌握温度选择还应参考其他发酵条件，灵活掌握2、温度的控制、温度的控制 工业生产上，大发酵罐在发酵过程中一般不需加工业生产上，大发酵罐在发酵过程中一般不需加热，因发酵过程释放了大量发酵热，需冷却的情况较热，因发酵过程释放了大量发酵热，需冷却的情况较多。多。二、PH值的影响和控制1、PH值对发酵的影响值对发酵的影响 PH值影响细胞内各种酶的催化活力产生影响。值影响细胞内各种酶的催化活力产生影响。 PH值影响膜电位和细胞跨膜运输值影响膜电位和细胞跨膜运输 PH值变化导致发酵产物稳定性变化，影响其积累值变化导致发酵产物稳定性变化，影响其积累 PH值影响细胞表面电荷，关系到细胞结团或絮凝值影响细胞表面电荷，关系到细胞结团或絮凝2、PH值的控制值的控制 发酵过程中的发酵过程中的PH值可通过直接补加生理酸性物质值可通过直接补加生理酸性物质或生理碱性物质和补料的方式来控制。或生理碱性物质和补料的方式来控制。 补料方法可以实现补充营养、延长发酵周期、调补料方法可以实现补充营养、延长发酵周期、调节节PH值和培养液的特性。值和培养液的特性。三、溶氧的影响和控制1、溶氧的影响、溶氧的影响 溶氧直接影响菌体生长溶氧直接影响菌体生长 溶氧对产物形成的影响是多样性的溶氧对产物形成的影响是多样性的 2、溶氧的控制、溶氧的控制 发酵的溶氧浓度是由供氧和需氧两方面决定的。发酵的溶氧浓度是由供氧和需氧两方面决定的。一般通过搅拌转速或通气量来控制供氧。发酵液的需一般通过搅拌转速或通气量来控制供氧。发酵液的需氧量受菌体浓度、基质的种类和浓度以及培养条件等氧量受菌体浓度、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响。因素的影响。四、二氧化碳的影响与控制1、二氧化碳的影响、二氧化碳的影响 二氧化碳直接影响菌体生长二氧化碳直接影响菌体生长 二氧化碳影响产物形成二氧化碳影响产物形成2、二氧化碳的控制、二氧化碳的控制 生产上一般采取调节搅拌速率及通气量的方法控制生产上一般采取调节搅拌速率及通气量的方法控制调节液相中二氧化碳的浓度调节液相中二氧化碳的浓度五、加料方式的影响和控制1、加料、加料 方式的影响方式的影响 加料方式有三种：一次性加料、一次性投入主料中间加料方式有三种：一次性加料、一次性投入主料中间补料、连续加料。一般普遍使用的是一次性投入主料补料、连续加料。一般普遍使用的是一次性投入主料中间补料。中间补料。2、加料方式的控制、加料方式的控制 补料操作控制系统分为反馈控制和无反馈控制。补料操作控制系统分为反馈控制和无反馈控制。 利用排气中二氧化碳含量作为反馈控制参数中较常利用排气中二氧化碳含量作为反馈控制参数中较常用的间接方法用的间接方法六、泡沫的影响和控制1、泡沫对发酵的影响、泡沫对发酵的影响 增加氧在发酵液中的传递增加氧在发酵液中的传递 不利于菌体生长不利于菌体生长 降低了发酵罐的装料系数降低了发酵罐的装料系数 增加染菌的机会增加染菌的机会 降低发酵物产量降低发酵物产量2、泡沫的控制、泡沫的控制 菌体特性、机械消泡、消泡剂消泡菌体特性、机械消泡、消泡剂消泡对微生物、人无毒性对微生物、人无毒性对产物提取不产生任何影响对产物提取不产生任何影响能耐高温灭菌能耐高温灭菌来源方便、成本低来源方便、成本低对氧传质不产生影响对氧传质不产生影响使用、运输过程中无任何危害使用、运输过程中无任何危害低浓度是具有消泡活性低浓度是具有消泡活性 迅速、持久消泡迅速、持久消泡七、罐压的控制和影响1、罐压的控制、罐压的控制 罐压影响二氧化碳和氧气的溶解度罐压影响二氧化碳和氧气的溶解度 影响微生物的生长影响微生物的生长2、罐压的控制、罐压的控制 控制罐压方法一般为调节空气进口阀门或排气出控制罐压方法一般为调节空气进口阀门或排气出口阀门的开启度，改变进入或排出气体的流量、维持口阀门的开启度，改变进入或排出气体的流量、维持工艺所需的压力。工艺所需的压力。八、搅拌的影响和控制搅拌影响气体的传递速度和发酵液混合均匀程度。搅拌影响气体的传递速度和发酵液混合均匀程度。反应搅拌的指标有搅拌转速和搅拌功率。反应搅拌的指标有搅拌转速和搅拌功率。第三节发酵过程的中间分析代谢参数按性质分：代谢参数按性质分： 物理参数：物理参数：温度、搅拌速度、空气压力、空气流量、温度、搅拌速度、空气压力、空气流量、溶氧浓度、表观黏度、排气氧（二氧化碳）浓度。溶氧浓度、表观黏度、排气氧（二氧化碳）浓度。 化学参数：化学参数：基质浓度、（糖、氮、磷）、基质浓度、（糖、氮、磷）、PH值、产值、产物浓度、核酸量。物浓度、核酸量。 生物参数：生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力吸强度、基质消耗速率、关键酶活力按检测手段分：按检测手段分： 直接参数：温度、直接参数：温度、PH值值 间接参数：间接参数：KL、摄氧率摄氧率直接参数：直接参数： 在线检测参数：温度、在线检测参数：温度、PH值、搅拌转速值、搅拌转速 离线检测参数：残糖、氨基氮、菌体浓度离线检测参数：残糖、氨基氮、菌体浓度一、发酵过程的主要分析项目1、PH值值 影响酶催化活性、基质代谢、产物合成、细胞状态、影响酶催化活性、基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供养状况营养状况、供养状况 测定方法：离线精密测定方法：离线精密PH试纸法、试纸法、PH计法、计法、PH在线在线电极测定法电极测定法 2、排气氧、排气二氧化碳和呼吸熵、排气氧、排气二氧化碳和呼吸熵 排气氧反映菌生长的活性；排气氧反映菌生长的活性； 排气二氧化碳反映微生物代谢的情况；排气二氧化碳反映微生物代谢的情况； 呼吸熵反映氧的利用状况。呼吸熵反映氧的利用状况。3、糖含量、糖含量 糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况，反映产物糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况，反映产物合成的活力。糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，合成的活力。糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节可控制补糖来调节PH值，促进产物合成，不至于盲目值，促进产物合成，不至于盲目补糖，造成发酵不正常。补糖，造成发酵不正常。 糖含量测定包括总糖和还原糖。糖含量测定包括总糖和还原糖。 4、氨基氮和氨态氮、氨基氮和氨态氮 通过氨基氮和氨态氮的分析可控制发酵过程，适时通过氨基氮和氨态氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。否则影响提取过程。5、磷含量、磷含量 磷是核酸的组成部分，是高能化合物磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，的组成部分，磷还能促进糖代谢。磷还能促进糖代谢。6、菌浓度和菌形态、菌浓度和菌形态 菌浓度和菌形态直接反映菌生长的情况，菌浓度和菌形态直接反映菌生长的情况， 菌浓度测定通过有测黏度法、压缩体积法、静置菌浓度测定通过有测黏度法、压缩体积法、静置沉降体积法、光密度测定法（分光光度计、光电比色沉降体积法、光密度测定法（分光光度计、光电比色计）计）7、产物浓度、产物浓度 产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况，是的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况，是发酵控制的重要参数。发酵控制的重要参数。二、产物量的测定（一）产物量的特殊表示法（一）产物量的特殊表示法1、抗生素效价、抗生素效价 抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（用单位（U）来表示。）来表示。2、酶活力、酶活力 在在25下，在最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强下，在最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的度以及最适的PH值条件下，每分钟能转化值条件下，每分钟能转化1mol分子分子底物的酶量为一个活力单位。底物的酶量为一个活力单位。（二）产物量的测定方法1、化学法、化学法 滴定法滴定法 比色法比色法 压差法压差法2、物理法、物理法 旋光度旋光度3、生物法、生物法 适用于抗生素效价测定，常用于发酵终了产品效价适用于抗生素效价测定，常用于发酵终了产品效价的测定。的测定。第四节 发酵染菌的防止和处理一、染菌的途径分析一、染菌的途径分析 染菌途径：染菌途径： 种子包括进罐前菌种室阶段出问题种子包括进罐前菌种室阶段出问题 培养基的配制和灭菌不彻底培养基的配制和灭菌不彻底 设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏。疏漏。种子带菌的检查可从菌种室保藏的菌种、斜面、摇瓶种子带菌的检查可从菌种室保藏的菌种、斜面、摇瓶直到种子罐。直到种子罐。培养基带菌原因如蒸汽压力或灭菌时间不够，培养基培养基带菌原因如蒸汽压力或灭菌时间不够，培养基配料未混合均匀，存在结块现象，设备未清洗干净，配料未混合均匀，存在结块现象，设备未清洗干净，特别是罐冲洗不到的死角处，有结痂而未铲除干净。特别是罐冲洗不到的死角处，有结痂而未铲除干净。设备方面特别是老设备带菌，原因主要是夹层或盘管、设备方面特别是老设备带菌，原因主要是夹层或盘管、轴封和管道渗漏、空气除菌效果差，管道安装不合理，轴封和管道渗漏、空气除菌效果差，管道安装不合理，存在死角等。存在死角等。二、染菌的判断镜检或无菌试验镜检或无菌试验状态参数（溶氧变化规律）状态参数（溶氧变化规律）发酵液观察发酵液观察三、防止和处理染菌的方法 防止染菌的关键是加强技术管理、细化各种预防防止染菌的关键是加强技术管理、细化各种预防措施、并做到日常化、制度化、规范化。措施、并做到日常化、制度化、规范化。（一）重视日常工作（一）重视日常工作检查空气冷却器、空气夹套加热器、分预过滤器的运检查空气冷却器、空气夹套加热器、分预过滤器的运行情况。行情况。空气除菌过滤器定期灭菌。空气除菌过滤器定期灭菌。观察总蒸汽温度和压力是否对应，保证蒸汽为饱和蒸观察总蒸汽温度和压力是否对应，保证蒸汽为饱和蒸汽。汽。定期拆检连消塔、维持罐，检查内件坚固情况，及时定期拆检连消塔、维持罐，检查内件坚固情况，及时清理内垢。检查喷淋冷却管路及无聊管路上相关阀门清理内垢。检查喷淋冷却管路及无聊管路上相关阀门的泄露情况。的泄露情况。强化菌种保藏管理，严格执行无菌室管理制度。强化菌种保藏管理，严格执行无菌室管理制度。认真做好罐的清理、冲洗工作，清除死角。认真做好罐的清理、冲洗工作，清除死角。定期进行碱水煮罐。定期进行碱水煮罐。根据培养基情况选择正确的灭菌形式。根据培养基情况选择正确的灭菌形式。严格按标准操作规程进行灭菌操作，合理控制灭菌指严格按标准操作规程进行灭菌操作，合理控制灭菌指标在规定范围，避免超标。标在规定范围，避免超标。对发酵辅助设备仪表进行定期保养和检修。对发酵辅助设备仪表进行定期保养和检修。（二）异常情况处理（1）对染菌罐放罐后的处理）对染菌罐放罐后的处理 对各阀门打压试漏并拆检相关设备对各阀门打压试漏并拆检相关设备（2）种子培养期染菌的处理）种子培养期染菌的处理 种子灭菌弃之并对种子罐及管道进行检查灭菌种子灭菌弃之并对种子罐及管道进行检查灭菌（3）发酵早期染菌处理）发酵早期染菌处理 适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌的生长；依情况而定，重新进行灭菌，再接种。菌的生长；依情况而定，重新进行灭菌，再接种。 （4）发酵中后期染菌处理）发酵中后期染菌处理 加入抗生素或杀菌剂加入抗生素或杀菌剂 （5）噬菌体污染的防止及处理并罐法并罐法轮换使用菌种或使用抗性菌株轮换使用菌种或使用抗性菌株放罐重消放罐重消罐内灭噬菌体法罐内灭噬菌体法第八章 几种重要微生物药物的发酵工艺 一、青霉素的发酵工艺一、青霉素的发酵工艺 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉素培养液中青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉素培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。内酰胺类中一大类抗生素的总称。理化性质溶解性溶解性吸湿性吸湿性稳定性稳定性聚合反应聚合反应过敏反应过敏反应降解反应降解反应抗菌活性抗菌活性1、溶解性、溶解性 青霉素是一种有机酸，易溶于醇、酸、醚、酯类，青霉素是一种有机酸，易溶于醇、酸、醚、酯类，在水中的溶解度很小，且会迅速丧失其抗菌能力。青在水中的溶解度很小，且会迅速丧失其抗菌能力。青霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿等霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。有机溶剂。2、吸湿性、吸湿性 结晶的内在质量、晶形和品种均影响吸湿性。青结晶的内在质量、晶形和品种均影响吸湿性。青霉素钠盐、胺盐、钾盐的吸湿性依次减小。由于钠盐霉素钠盐、胺盐、钾盐的吸湿性依次减小。由于钠盐比钾盐更不易保存，要求包装严密，以免吸湿变质。比钾盐更不易保存，要求包装严密，以免吸湿变质。3、稳定性、稳定性 一般青霉素越纯、越干燥、稳定性越强。一般规一般青霉素越纯、越干燥、稳定性越强。一般规定有效期为定有效期为4年。因为青霉素的水溶液很不稳定，一般年。因为青霉素的水溶液很不稳定，一般都用固体保存。都用固体保存。4、降解反应、降解反应 青霉素分子中最不稳定的部位是青霉素分子中最不稳定的部位是-内酰胺环，而内酰胺环，而其抗菌作用恰恰决定于其抗菌作用恰恰决定于-内酰胺环的完整。内酰胺环的完整。5、聚合反应、聚合反应 青霉素的水溶液很容易形成聚合物。它们是青霉青霉素的水溶液很容易形成聚合物。它们是青霉素过敏反应的主要过敏原之一。素过敏反应的主要过敏原之一。6、过敏反应、过敏反应 青霉素过敏的原因可能是由于蛋白质或多肽等大青霉素过敏的原因可能是由于蛋白质或多肽等大分子物质与青霉素或其降解产物结合，引起机体的免分子物质与青霉素或其降解产物结合，引起机体的免疫变态反应。包括过敏性休克、药疹、血清病型反应疫变态反应。包括过敏性休克、药疹、血清病型反应等。若发生过敏反应，应紧急抢救，用人工呼吸、肾等。若发生过敏反应，应紧急抢救，用人工呼吸、肾上腺素药物。上腺素药物。应用青霉素不可与同类抗生素连用青霉素不可与同类抗生素连用青霉素不可与磺胺和四环素联合用药青霉素不可与磺胺和四环素联合用药青霉素不可与氨基糖苷类混合输液青霉素不可与氨基糖苷类混合输液生产工艺生产孢子制备生产孢子制备发酵发酵提炼提炼生产孢子制备将砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨培养基培养将砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨培养基培养再移植到大米或小米固体培养基上，再移植到大米或小米固体培养基上，25培养培养7d干燥、低温保存干燥、低温保存发酵产黄青霉素产黄青霉素 斜面孢子斜面孢子 米孢子米孢子 种子罐种子罐 发酵罐发酵罐 发酵液发酵液 发酵滤液发酵滤液真空冷冻干燥或液氮保藏孢子真空冷冻干燥或液氮保藏孢子 琼脂斜面培养基上琼脂斜面培养基上25培养培养7-9d用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上25培养培养6-7d用孢子米粒或孢子悬浮液接种，用孢子米粒或孢子悬浮液接种，26通气、搅拌培养通气、搅拌培养60-68h用种子罐按照用种子罐按照10%-15%体积接种，在体积接种，在25通气，搅拌补料分批培养通气，搅拌补料分批培养200-240h冷却至冷却至5左右、絮凝、过滤左右、絮凝、过滤提炼发酵滤液发酵滤液一次萃取一次萃取一次水提取一次水提取二次萃取二次萃取脱色液脱色液结晶混悬液结晶混悬液湿晶体湿晶体青霉素工业盐青霉素工业盐工艺要点1、发酵温度控制、发酵温度控制 产黄青霉素生长的最适温度为产黄青霉素生长的最适温度为27-30，而分泌青，而分泌青霉素的适宜温度是霉素的适宜温度是20-24，实际生产中采用，实际生产中采用26-27。为使温度适合于不同发酵阶段的需要，一般采。为使温度适合于不同发酵阶段的需要，一般采用变温控制。用变温控制。2、发酵、发酵PH控制控制 青霉素发酵的最适青霉素发酵的最适PH值一般控制在值一般控制在PH6.5-7.0，当，当PH较高时可通过加糖或天然油脂进行控制；当较高时可通过加糖或天然油脂进行控制；当PH较较低时可加入碳酸钙；或氨水进行调节。低时可加入碳酸钙；或氨水进行调节。3、溶氧浓度的控制、溶氧浓度的控制 青霉素发酵属好氧发酵，故溶氧浓度是影响青霉素青霉素发酵属好氧发酵，故溶氧浓度是影响青霉素产率的一个重要因素。当溶氧浓度低于产率的一个重要因素。当溶氧浓度低于30%时，青霉时，青霉素产率急剧下降。素产率急剧下降。第二节 红霉素的发酵工艺一、概述一、概述（一）红霉素及其理化性质（一）红霉素及其理化性质 红霉素是大环内酯类抗生素。红霉素是大环内酯类抗生素。（二）药理作用及应用范围（二）药理作用及应用范围 红霉素是广谱抗生素，对红霉素是广谱抗生素，对G+菌作用强，用于治疗菌作用强，用于治疗腹泻、菌痢、胆结石、胆囊炎、疟疾、绿脓杆菌继发腹泻、菌痢、胆结石、胆囊炎、疟疾、绿脓杆菌继发感染、支气管炎、哮喘和脓毒性心内膜炎皆有效。还感染、支气管炎、哮喘和脓毒性心内膜炎皆有效。还起到防治心脏病作用。起到防治心脏病作用。二、红霉素的发酵工艺过程（一）菌种（一）菌种 红霉素的产生菌是红色糖多孢菌红霉素的产生菌是红色糖多孢菌（二）发酵工艺流程沙土孢子沙土孢子斜面母瓶斜面母瓶斜面子瓶斜面子瓶一级种子罐一级种子罐二级种子罐（繁殖罐）二级种子罐（繁殖罐）发酵罐发酵罐放罐放罐孢子培养孢子培养37，7-10天天孢子培养孢子培养37，7-10天天种子培养种子培养35，60-70h 种子培养种子培养33-35，35-40h 发酵培养发酵培养31，150-160h(三)发酵工艺过程1、生产孢子制备工艺、生产孢子制备工艺 斜面孢子培养基组分为淀粉、硫酸铵、氯化钠、玉斜面孢子培养基组分为淀粉、硫酸铵、氯化钠、玉米浆、碳酸钙、琼脂。米浆、碳酸钙、琼脂。2、发酵工艺、发酵工艺 红霉素大规模生产一般是将其孢子悬液接入种子罐，红霉素大规模生产一般是将其孢子悬液接入种子罐，种子扩大培养种子扩大培养2次后移入发酵罐进行发酵。次后移入发酵罐进行发酵。（四）发酵工艺控制要点1、种子质量的控制、种子质量的控制 成熟的斜面孢子呈深米色，色泽新鲜、均匀、无黑成熟的斜面孢子呈深米色，色泽新鲜、均匀、无黑点，背面产生红色或红棕色色素。点，背面产生红色或红棕色色素。2、培养基的控制、培养基的控制 碳源碳源 主要以葡萄糖为主，其次为淀粉。生产上主要以葡萄糖为主，其次为淀粉。生产上一般用母液糖一般用母液糖 氮源氮源 以黄豆饼粉为主，其次为玉米浆和硫酸以黄豆饼粉为主，其次为玉米浆和硫酸铵铵 前体前体 生产上采用发酵过程加入丙酸或丙醇作生产上采用发酵过程加入丙酸或丙醇作为前体以提高红霉素为前体以提高红霉素A的产量。的产量。3、培养条件的控制、培养条件的控制 通气和搅拌通气和搅拌 1：（：（0.8-1.2）v/v/m 温度温度 一般采用全程一般采用全程31培养培养 PH值值 6.6-7.2 中间补料中间补料 还原糖控制在还原糖控制在1.2-1.5%范围内；有机氮源范围内；有机氮源补加根据发酵液黏度大小决定补入量；前体在补加根据发酵液黏度大小决定补入量；前体在24-39h，发酵液变浓、，发酵液变浓、PH值高于值高于6.5时开始补入。时开始补入。 通氨通氨 发酵后期发酵后期 发酵液黏度的控制发酵液黏度的控制 适当提高发酵液黏度，可通过适当提高发酵液黏度，可通过减慢搅拌转速，改变搅拌叶型式、降低罐温、增加有减慢搅拌转速，改变搅拌叶型式、降低罐温、增加有机氮源补量，滴加氨水等实现。机氮源补量，滴加氨水等实现。 泡沫与消沫泡沫与消沫 植物油做消沫剂植物油做消沫剂4、异常情况及处理（1）停电影响）停电影响 2h影响发酵单位水平，影响发酵单位水平，100h影响发酵液以及成品影响发酵液以及成品质量质量 （2）染菌处理）染菌处理 降温至降温至28培养，并加入洁尔灭培养，并加入洁尔灭 （3）发酵液浓度特别低）发酵液浓度特别低 加入酵母粉和蛋白胨加入酵母粉和蛋白胨第三节 螺旋霉素的发酵工艺一、概述一、概述1、螺旋霉素及其理化性质、螺旋霉素及其理化性质 螺旋霉素易溶于有机溶媒，化学性质稳定，是典型螺旋霉素易溶于有机溶媒，化学性质稳定，是典型的大环内酯类抗生素，产生菌为链霉菌属。的大环内酯类抗生素，产生菌为链霉菌属。2、药理作用、药理作用 螺旋霉素经酰化反应合成乙酰螺旋霉素，组织浓度螺旋霉素经酰化反应合成乙酰螺旋霉素，组织浓度高，毒性低，体内疗效长，具有较强的抗生素后续作高，毒性低，体内疗效长，具有较强的抗生素后续作用（用（PAE）对革兰氏阳性菌与奈瑟氏球菌有较好的抗）对革兰氏阳性菌与奈瑟氏球菌有较好的抗菌作用，口服吸收良好。菌作用，口服吸收良好。二、工艺流程发酵工艺流程发酵工艺流程 菌种甘油冷冻管 解冻 一级摇瓶培养26-28，培养24h 二级摇瓶培养26-28，培养24h 一级种子罐培养26-28，培养24h 二级种子罐培养26-28，培养24h 发酵罐发酵生产25-27，培养100h 发酵液放罐发酵设备流程 菌种甘油冷冻管菌种甘油冷冻管 一级摇瓶（一级摇瓶（500mL） 二级摇瓶（二级摇瓶（500mL） 一级种子罐（一级种子罐（500L） 二级种子罐（二级种子罐（4000L） 发酵罐（发酵罐（30m3）三、生产过程1、菌种、菌种 一般选用螺旋霉素链霉菌经多次诱变（紫外光照一般选用螺旋霉素链霉菌经多次诱变（紫外光照&光光修复）后获得的高产菌种。修复）后获得的高产菌种。2、种子和发酵培养基、种子和发酵培养基3、一级摇瓶菌丝的制备、一级摇瓶菌丝的制备 将保存的冷冻管取出，放置室温或将保存的冷冻管取出，放置室温或37恒温室化冻后，恒温室化冻后，在无菌条件下吸在无菌条件下吸3.5mL冷冻液接入有冷冻液接入有75mL培养基的一培养基的一级摇瓶，级摇瓶，27振荡培养振荡培养24h。4、二级摇瓶菌丝的制备、二级摇瓶菌丝的制备 将长好的一级摇瓶菌丝在无菌条件下吸将长好的一级摇瓶菌丝在无菌条件下吸3.5mL接入有接入有75mL培养基的二级摇瓶中，培养基的二级摇瓶中，27振荡培养振荡培养24h，得二，得二级摇瓶菌丝。级摇瓶菌丝。5、一级种子罐的菌种培养、一级种子罐的菌种培养6、二级种子罐的菌种培养、二级种子罐的菌种培养7、三级种子罐的菌种培养、三级种子罐的菌种培养发酵工艺研究提高生产水平提高生产水平1、提高菌种生产能力、提高菌种生产能力2、对生产过程中主要生理参数进行检测、对生产过程中主要生理参数进行检测3、提高发酵的设计水平、提高发酵的设计水平4、对工艺实行自动化控制、对工艺实行自动化控制四、发酵工艺控制1、碳源、碳源 以葡萄糖和淀粉为混合碳源时，淀粉比例较大，发以葡萄糖和淀粉为混合碳源时，淀粉比例较大，发酵单位较高。酵单位较高。2、氮源、氮源 以鱼粉和黄豆饼粉混合氮源为主。铵盐对螺旋霉素以鱼粉和黄豆饼粉混合氮源为主。铵盐对螺旋霉素有抑制作用。有抑制作用。3、无机盐、无机盐 磷酸盐对螺旋霉素发酵过程中起着重要作用。磷酸盐对螺旋霉素发酵过程中起着重要作用。4、氨基酸、氨基酸 甲硫氨酸对螺旋霉素合成的促进作用最大甲硫氨酸对螺旋霉素合成的促进作用最大提炼 利用游离碱或盐在不同利用游离碱或盐在不同PH值下能溶在不容溶剂中的值下能溶在不容溶剂中的特性，以醋酸乙酯和酸性水溶液进行萃取，最后转入特性，以醋酸乙酯和酸性水溶液进行萃取，最后转入水相，调水相，调PH值至碱性，析出螺旋霉素游离碱，经洗涤值至碱性，析出螺旋霉素游离碱，经洗涤干燥后即得成品。干燥后即得成品。 注意：注意：PH值过高或过低均能形成螺旋霉素的降解产值过高或过低均能形成螺旋霉素的降解产物，导致抗菌活性的下降。物，导致抗菌活性的下降。第九章 微生物药物的分离与精制第一节第一节 概述概述一、概念一、概念 从发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产从发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程，这个过程利用产物和杂质的物理化学性质品的过程，这个过程利用产物和杂质的物理化学性质的不同，提取产物或者从系统中去除杂质的操作。的不同，提取产物或者从系统中去除杂质的操作。二、微生物工程下游加工过程的特点1、起始浓度较低而杂质又较多，最后成品要求达到的纯、起始浓度较低而杂质又较多，最后成品要求达到的纯度又较高，因此常需多步纯化操作。度又较高，因此常需多步纯化操作。2、欲提取的生物物质通常不稳定，遇热、极端、欲提取的生物物质通常不稳定，遇热、极端PH值、值、有机溶剂会引起失活或分解。有机溶剂会引起失活或分解。3、发酵或培养都是分批操作，且微生物总有一定的变、发酵或培养都是分批操作，且微生物总有一定的变异性，故各批发酵液不尽相同。异性，故各批发酵液不尽相同。三、微生物工程下游加工的一般过程和单元操作1、发酵液的预处理和固液分离（凝聚和絮凝）、发酵液的预处理和固液分离（凝聚和絮凝）2、初步纯化（提取：沉淀、吸附、萃取）、初步纯化（提取：沉淀、吸附、萃取）3、高度纯化（精制：层析、离子交换）、高度纯化（精制：层析、离子交换）4、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）第二节 发酵液的预处理及固液分离 目的：达到固液分离目的：达到固液分离根据活性物质的许可范围，可以采取酸化、加热、过滤、根据活性物质的许可范围，可以采取酸化、加热、过滤、絮凝、离心等方法絮凝、离心等方法一、发酵液的预处理1、高价无机离子的去除、高价无机离子的去除Ca2+ 草酸草酸Mg2+ 三聚磷酸钠三聚磷酸钠Fe3+ 黄血盐黄血盐 普鲁氏蓝沉淀普鲁氏蓝沉淀2、杂蛋白的去除、杂蛋白的去除沉淀法沉淀法 等电点法：在某一等电点法：在某一PH下，净电荷为零，溶解度最小下，净电荷为零，溶解度最小 化合沉淀法（如酸性溶液中，蛋白质与三氯乙酸化合沉淀法（如酸性溶液中，蛋白质与三氯乙酸盐、水杨酸盐、过氯酸盐形成沉淀；碱性溶液中，与盐、水杨酸盐、过氯酸盐形成沉淀；碱性溶液中，与Ag+、Cu2+、Zn2+形成沉淀）形成沉淀）变性法变性法 热变性：适于热稳定物质热变性：适于热稳定物质 大幅度调节大幅度调节PH：根据产物特性反向调节：根据产物特性反向调节 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等 缺点：缺点： 加热法只适合于对热较稳定的目的产物。加热法只适合于对热较稳定的目的产物。 极端极端PH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱。量酸碱。 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。合。吸附法吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而除去加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而除去 如：在四环素抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同如：在四环素抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质。作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质。 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钠和磷酸氢二钙在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钠和磷酸氢二钙钠，两者生产庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不钠，两者生产庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3、色素及其他物质的去除、色素及其他物质的去除 脱色方法：离子交换剂、离子交换纤维、活性炭脱色方法：离子交换剂、离子交换纤维、活性炭二、离心过滤与固液分离菌体分离方法：离心分离、过滤菌体分离方法：离心分离、过滤离心分离：在离心力场的作用下，将悬浮液中的固相与离心分离：在离心力场的作用下，将悬浮液中的固相与液相加以分离，多用于颗粒较小的悬浮液和乳浊液的液相加以分离，多用于颗粒较小的悬浮液和乳浊液的分离。分离。常用的离心方法：差级离心法、密度梯度离心、等密度常用的离心方法：差级离心法、密度梯度离心、等密度离心、平衡等密度离心。离心、平衡等密度离心。过滤：悬浮液通过过滤介质时固态颗粒与溶液分离。分过滤：悬浮液通过过滤介质时固态颗粒与溶液分离。分为澄清过滤和滤饼过滤。为澄清过滤和滤饼过滤。1、影响发酵液过滤的因素、影响发酵液过滤的因素 菌体细胞体积、各种发酵条件、未利用完的培养基菌体细胞体积、各种发酵条件、未利用完的培养基浓度、消泡剂、发酵周期浓度、消泡剂、发酵周期2、改善发酵液过滤性能的方法、改善发酵液过滤性能的方法 调调PH值值 除蛋白质；减少堵塞和污染除蛋白质；减少堵塞和污染 凝聚和絮凝凝聚和絮凝 吸附剂法吸附剂法 吸附细菌细胞吸附细菌细胞 助滤剂法助滤剂法 加速过滤速度加速过滤速度 反应剂法反应剂法 防止菌丝体黏结，又可作为助滤剂防止菌丝体黏结，又可作为助滤剂三、细胞破碎与分离1、常用的细胞破碎方法、常用的细胞破碎方法 （1）机械法）机械法球磨法球磨法高压匀浆法高压匀浆法超声波法超声波法（2）非机械法）非机械法酶解法酶解法渗透压法渗透压法反复冻融法反复冻融法干燥法干燥法3、细胞碎片的分离、细胞碎片的分离 离心分离法离心分离法第三节 微生物药物的分离和精制一、沉淀法一、沉淀法 通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。 优点：设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓优点：设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单缩倍数高和操作简单 缺点：过滤困难、产品质量较低、需要重新精制缺点：过滤困难、产品质量较低、需要重新精制1、等电点沉淀法 利用两性电解质（氨基酸、核苷酸、蛋白质、酶、利用两性电解质（氨基酸、核苷酸、蛋白质、酶、核酸等）在电中性时溶解度最低的原理进行分离纯化。核酸等）在电中性时溶解度最低的原理进行分离纯化。 优点：操作简便，实际消耗量少，引入的外来物优点：操作简便，实际消耗量少，引入的外来物少。少。 缺点：蛋白质对低缺点：蛋白质对低PH值较敏感，酸化时可引起蛋值较敏感，酸化时可引起蛋白质失活。白质失活。2、盐析法 中性盐使蛋白质发生水化，同时中和蛋白质表面所带中性盐使蛋白质发生水化，同时中和蛋白质表面所带电荷，从而形成沉淀。电荷，从而形成沉淀。 盐析用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠盐析用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等。等。 优点：成本低、操作简单、安全和对许多生物活性物优点：成本低、操作简单、安全和对许多生物活性物质具有稳定作用。质具有稳定作用。3、有机溶剂沉淀法 利用和水互溶的有机溶剂（丙酮、乙醇）使溶于水的利用和水互溶的有机溶剂（丙酮、乙醇）使溶于水的小分子物质以核酸、蛋白质等生物大分子沉淀。原理小分子物质以核酸、蛋白质等生物大分子沉淀。原理是蛋白质分子脱水而相互聚集析出。是蛋白质分子脱水而相互聚集析出。优点：有机溶剂易蒸发除去，密度差大容易离心分离，优点：有机溶剂易蒸发除去，密度差大容易离心分离，不需要脱盐。不需要脱盐。缺点：容易使蛋白质变性失活，安全要求高。在操作过缺点：容易使蛋白质变性失活，安全要求高。在操作过程中需冷却。程中需冷却。4、非离子型聚合物沉淀法 PEG6000和和PEG20000应用最多，选择性沉淀以纯化应用最多，选择性沉淀以纯化蛋白质。原理是降低水化度，或者形成复合物。蛋白质。原理是降低水化度，或者形成复合物。 优点：操作条件温和，不易引起变性，沉淀效果好，优点：操作条件温和，不易引起变性，沉淀效果好，沉淀后的聚合物容易除去。沉淀后的聚合物容易除去。二、膜分离技术 膜分离过程的实质是物质通过膜的传递膜分离过程的实质是物质通过膜的传递速度不同而得到分离。速度不同而得到分离。 优点：过程一般较简单，操作方便，费用优点：过程一般较简单，操作方便，费用较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能较低，效率较高，无相变，可在常温下操作，既节能又特别适用于热敏性物质的分离。又特别适用于热敏性物质的分离。1、膜分离技术分类透析透析 利用膜两侧浓度差，使溶质从浓度高的一侧通过膜孔扩散到浓度低的一侧，从而实现分离的过程。电渗析电渗析 以电位差电位差为推动力，利用离子交换膜选择性地使阴离子或阳离子通过的性质。微滤微滤 利用孔径0.025-0.14m的多孔膜，过滤含有微滤的溶液，将微粒从溶液中除去，达到净化、分离和浓缩的目的。推动力为压力差压力差。超滤超滤 滤膜孔径为1-20nm，用于过滤含有微粒和大分子的溶液。反渗透反渗透 用反渗透膜（孔径0.1-1nm）对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜从溶液中分离的操作。反渗透膜只能选择性地透过溶剂而不使溶质透过，截留所有可溶物。反渗透以压力差为推动力。纳米过滤纳米过滤 以压力差为推动力，用纳米过滤膜从溶液中分离出相对分子质量300-1000的物质的膜分离过程。 特点：在过滤分离过程中能截留小分子有机物，同时透析出盐，达到浓缩和透析目的；操作压力低，节约动力。2、离子交换膜电渗析法 利用可解离基团，在外加电场作用下，经有选择利用可解离基团，在外加电场作用下，经有选择透过性的高分子膜，使各种带电性物质分离的技术。透过性的高分子膜，使各种带电性物质分离的技术。 工业用离子交换膜应具备离子透过性高，导电性工业用离子交换膜应具备离子透过性高，导电性好，电解质扩散量小，水迁移量小，有一定机械强度，好，电解质扩散量小，水迁移量小，有一定机械强度，化学稳定性好，膜结构均匀一致，表面光洁，膨胀性化学稳定性好，膜结构均匀一致，表面光洁，膨胀性消，价格便宜。消，价格便宜。三、萃取法 萃取是将某种溶剂加入到液体混合物中，根据混合物萃取是将某种溶剂加入到液体混合物中，根据混合物中不同组分在溶剂中溶解度的不同，将所需要的组分中不同组分在溶剂中溶解度的不同，将所需要的组分分离出来。分离出来。 萃取不仅可以提取和浓缩产物，还可以去除掉部分其萃取不仅可以提取和浓缩产物，还可以去除掉部分其他类似物质，是产物得到初步纯化。他类似物质，是产物得到初步纯化。1、溶剂萃取 利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不利用萃取目标物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。同，使其从一种溶剂转入另一种溶剂从而实现分离。2、溶剂的选择萃取能力高萃取能力高分离程度高分离程度高溶剂与被萃取的液相互溶度要小，黏度低，界面张力溶剂与被萃取的液相互溶度要小，黏度低，界面张力适中，使相的分散和两相分离有利适中，使相的分散和两相分离有利溶剂的回和再生容易，化学稳定性好溶剂的回和再生容易，化学稳定性好溶剂的安全性好溶剂的安全性好3、水相条件的影响PH值值 酸性物质在酸性条件下萃取，碱性物质在碱性条件下萃取。温度温度 萃取应维持在室温或较低温度下进行。盐析盐析 加入盐析剂可使产物在水中溶解度降低而易于转入溶剂中去；另一方面也能减少有机溶剂在水中的溶解度。带溶剂带溶剂 对象：欲提取的生物物质水溶性很强，在有机溶剂中溶解度很小。 带溶剂：能和欲提取的生物物质形成复合物而易溶于溶剂中，且此复合物在一定条件下又要容易分解。4、乳化和去乳化乳化即一种液体分散在另一种不相混溶的液体中的现象。破乳的方法离心分离、过滤、加热、稀释法、吸附法、加电解质5、工业萃取的方式混合分离回收溶剂萃取的操作流程：单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取2、超临界流体萃取将超临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某些高沸点或热敏性成分，达到分离和提纯的目的。原理：溶剂密度的大幅度增加，导致溶剂对溶质的作用力增大，从而形成了溶解物质的能力。方法：等温法、等压法、吸附法3、双水相萃取利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法，可用于分离和纯化酶、核酸、生长素、病毒、干扰素等四、树脂法离子交换技术是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异予以分离的技术。优点：成本低、操作方便、设备简单、提炼效率高、节约大量有机溶剂1、离子交换原理具有孔隙度酸碱功能基团2、离子交换树脂的结构与分类结构：骨架和活性基团分类：阳离子交换树脂 阴离子交换树脂 选择性离子交换树脂 两性离子交换树脂 吸附树脂 电子交换树脂3、树脂和操作条件的选择选择原则：选择原则：强碱性离子一般选用弱酸性树脂；弱碱性离子宜用强酸性树脂；大分子离子，选择交联度较低的树脂。操作条件：操作条件： PH值：值：产物稳定的前体下产物离子化以及树脂解离 树脂类型：树脂类型：弱酸性和弱碱性树脂采用钠型或氯型 产物浓度：产物浓度：低价离子浓度有利于交换树脂，高价离子稀释时易被吸附。 洗脱条件：洗脱条件：碱性条件下吸附，解吸应在酸性条件下进行。五、吸附法 利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质（热源）、抗生素之间的分子引力，使他们吸附在吸附剂上。 优点：操作简便、安全、设备简单；不用或少用有机溶剂；PH值在生产过程中变化小，适用于稳定性较差的生化物质。 缺点：选择性差、吸附性能不稳定、收率不高、不能连续操作、劳动强度大。1、吸附剂的种类疏水或非极性吸附剂：活性炭亲水或极性吸附剂：氧化铝、硅胶各种离子交换树脂吸附剂：大孔树脂2、吸附剂的应用活性炭吸附抗生素 注意：调节适当的PH值 保持一定温度 活性炭的用量 吸附时间 洗脱剂离子交换树脂脱色 利用树脂的多孔隙表面对色素进行吸附。六、凝胶层析法 混合物岁流动相流经装有凝胶（固定相）的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而得到分离的技术。 优点：操作方便、设备简单、不需要使用有机溶剂、对高分子物质分离效果好。1、凝胶层析法原理利用物质分子大小不同进行分离2、凝胶层析法常用凝胶天然凝胶：马铃薯淀粉凝胶、琼脂和琼脂糖凝胶人工合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶3、凝胶层析法的应用脱盐纯化青霉素去热原物质浓缩高分子溶液分析测定高分子物质的相对分子质量第四节 微生物药物的成品加工一、浓缩1、蒸发浓缩法 蒸发讲稀溶液加热沸腾，使溶液中部分溶剂汽化后除去，从而将溶液浓缩的过程。 目的：缩小被处理料液体积，节约能源和操作费用，提高得率。2、冰冻浓缩法 常用于工业发酵中生物大分子和具有生理活性的发酵产品的浓缩。3、吸收浓缩法 通过吸收剂直接吸收除去溶液中溶剂分子，使溶液浓缩。 吸附剂的选择：不与溶液起化学反应、对生物大分子和发酵产品无吸附作用、易与溶液分开。 常用的吸附剂：聚乙二醇、蔗糖、凝胶4、超滤浓缩法 利用特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤，适用于生物大分子的发酵产品。二、结晶 结晶是过饱和溶液缓慢冷却（或蒸发）使溶质呈晶体析出的过程1、起晶方法1、自然起晶法2、刺激起晶法3、晶种起晶法三、成品干燥 干燥是利用热能使湿物料中的湿分汽化而除去。1、常用干燥方法对流加热干燥法接触加热干燥法红外线干燥法冷冻升华干燥法2、工业发酵中常用的干燥过程1、气流干燥 把呈泥状、粉粒状或块状的湿物料，经过适当方法分散于热气流中，在与热气流并流输送的同时进行干燥而得到粉粒状干燥制品的过程。 优点：干燥强度大、干燥时间短、热效率高、处理量大、设备简单、应用范围广。 缺点：气流速度较高，粒子有一定磨损和粉碎，不适用于对成品外形有一定要求的物料或非常黏稠的液体物料，热利用效率较低。2、沸腾干燥利用热的空气流体使孔板上的粒状物料呈流化沸腾状态，使水分迅速汽化达到干燥的目的。优点：传热传质速率高、干燥湿度均匀，容易控制，对无严重凝聚现象的湿物料一般都能适用。缺点：在使颗粒流化范围内，要求较高的热风压强使物料流态化；由于摩擦作用较强，对易碎物料或对表面形状、光泽有所要求的不宜采用。3、喷雾干燥 利用不同的喷雾器，将溶液、乳浊液、悬浊液或浆料喷成雾状，使其再干燥室中与热空气接触，水分被蒸发而成为粉末状或颗粒状的产品。4、冷冻干燥冷冻干燥可以有效地干燥热敏性物料，不致影响其生物活性或效价。第十章 微生物产生的生物活性物质