第三十四章第三十四章 DNA复制复制Watson & Crick:Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种 功能，即自我复制和对细胞的高 度特异性的影响遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的自我复制 基因基因的突变的突变 控制控制性状的表达性状的表达DNA复制复制 亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别聚合酶的作用下，分别以每条单链以每条单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的以互补配对的游离的dNTP, dNTP, 合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完全相同的子代分子完全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。 DNA复制的一般特征复制的一般特征以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为前体，还需要Mg2作为模板的DNA需要解链半保留复制需要引物主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是53 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性和进行性 一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制 ( semiconservative replication ) DNA复制可能的三种方式复制可能的三种方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验Testing Models for DNA replicationMeselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程（1958） Meselson 和和Stahl的的实验结果果Meselson与与Stalh在在42年以后在年以后在最初他们相最初他们相遇的一颗树遇的一颗树下重逢时的下重逢时的合影合影Matthew Meselson and Franklin Stahl more recentlyFaculty member at HarvardMechanisms of Molecular EvolutionFaculty member at U. of OregonMeiotic RecombinationTaylor以蚕豆根尖以蚕豆根尖细胞胞为材料、使用放射性同位素材料、使用放射性同位素证明真核明真核细胞胞DNA也是半保留复制的也是半保留复制的实验。二、复制起点与方向二、复制起点与方向（origin & direction ） DNA链延伸的方向：链延伸的方向：从从53证明明DNA复制的方向始复制的方向始终是是53的末端的末端终止止实验 实验证明实验证明 复制从复制从DNA分子的特定位置开始。分子的特定位置开始。复制起点（复制原点）复制起点（复制原点） Origin, O - DNA分子上开始复制的特定位置。分子上开始复制的特定位置。复制子复制子Replicon - 能够独立进行复制的基因组单位。能够独立进行复制的基因组单位。 A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator 一个复制子只含有一个复制起点一个复制子只含有一个复制起点。DNA复制起始区的特征复制起始区的特征DNA复制起始区的特征复制起始区的特征由多个短的重复序列组成；能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别；通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。 “呼吸呼吸现象现象” DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，复制原点处氢键迅速断裂与再生， 导致两条导致两条DNA链不断解链与聚合，链不断解链与聚合， 形成瞬间的单泡状结构的过程。形成瞬间的单泡状结构的过程。 在富含在富含AT的区域内尤为明显的区域内尤为明显单单起点、起点、单单向向多多起点、起点、单单向向单单起点、起点、双双向向多多起点、起点、双双向向原核生物（染色体、质粒）、真核生物细胞器：原核生物（染色体、质粒）、真核生物细胞器： 双链环状双链环状DNA，双向为主、对称为主，双向为主、对称为主真核生物染色体：真核生物染色体： 双链线状双链线状DNA，双向对称，双向对称 电镜下真核生物下真核生物DNA的多个复制叉的多个复制叉结构构复制叉的复制叉的结构构当当DNA复制复制从起始区起从起始区起动的时候，动的时候，起始区的起始区的DNA双链因双链因发生解链而发生解链而形成叉状结形成叉状结构，这样的构，这样的结构被称为结构被称为复制叉复制叉 真核生物真核生物DNA复制子复制子Cairns的的实验复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的3H-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的3H-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。Grow cells for several generationsSmall amounts of 3H thymidineare incorporated into new DNAGrow for brief period of timeAdd a high concentration of 3H- thymidinein media with lowconcentration of 3H- thymidineBacterial culture*T*T*T*TDense label at the replication forkwhere new DNA is being made*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*TAll DNA is lightlylabeled with radioactivity*T*T*TCairns then isolated the chromosomes by lysing the cells very very gently and placed them on an electron micrograph (EM) grid which he exposed to X-ray film for two months.实验证明实验证明Cairns证明大明大肠杆菌杆菌DNA双向复制的双向复制的实验三、三、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制 （semi-discontinuous semi-discontinuous replicationreplication） 5353DirectionofunwindingContinuous replication53PrimerPrimer53Primer53Discontinuous replicationDNA replication is semi-discontinuous先导链先导链后随链后随链How to prove it ?DNA 的半不的半不连续复制：复制：semi-discontinuousOkazakis (1968)；Reiji Okazaki was born near Hiroshima, Japan, in 1930. He was a teenager there at the time of the explosion of the first of two nuclear bombs that the US dropped at the end of World War II. His scientific career was cut short by his untimely death from cancer in 1975 at the age of 44, perhaps related to his exposure to the fallout of that blast.a. If the replication of DNA is semidiscontinuous, one ought to be able to label and catch these short pieces before they are ligated together by pulses of labeling.b. If the enzyme (DNA ligase) is absent, these short pieces of DNA ought to be detectable even after relatively long time of pulses. Evidence for Semi-Discontinuous Replication(pulse-chase experiment) Bacteria arereplicatingBacterial cultureAdd 3H ThymidineFor a SHORT time(i.e. seconds)Flood with non-radioactive TAllow replicationTo continue Harvest the bacteriaat different timesafter the chaseIsolate their DNASeparate the strands(using alkali conditions)Run on a sizing gradientRadioactivity will onlybe in the DNA that was made during the pulsesmallestlargestResults of pulse-chase experiment Pulse5353Directionofunwinding35PrimerPrimer53Primer53*ChaseLigase mutant DNA semi-discontinuous replicationDNA semi-discontinuous replication leading strand , lagging strand 均有均有 dUMP dUMP 的掺入的掺入 Okazaki Okazaki 片段在某种意义上为片段在某种意义上为 dUMP dUMP 片段片段 先导链按先导链按 dUMP dUMP 片段连续复制片段连续复制后随链按后随链按Okazaki 片段不连续复制片段不连续复制( Prok. 1-2kb, Euk. 0.1-0.2kb )冈崎片段的崎片段的连接接DNA pol IDNA ligaseReiji Okazaki的的实验脉冲标记目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。脉冲追踪目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。 Okazaki的脉冲的脉冲标记和脉冲追踪的和脉冲追踪的实验Okazaki的脉冲的脉冲标记和脉冲追踪的和脉冲追踪的实验结果分析果分析在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。 J. Huberman and A. Tsai performed the same kind of experiment in a eukaryote: the fruit fly Drosophila melanogaster.复制的特殊方式复制的特殊方式质粒粒ColE1：完全：完全单向；向；噬菌体噬菌体x174：滚环复制；复制；“滚环复制复制”某些噬菌体（如M13和X174）DNA和一些小的质粒（如枯草杆菌内的pIM13质粒）在宿主细胞内通过滚环复制方式扩增DNA。 真核细胞的某些基因，如某些两栖动物卵母细胞内的rRNA基因和哺乳动物细胞内的二氢叶酸还原酶基因，在特定的情况下会通过滚环复制在较短的时间内迅速增加目标基因的拷贝数。 cycling amplificationcycling amplification5333Some phages (e.g.,):滚环复制滚环复制 D-环复制复制线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒，如腺病毒，也进行D-环复制 。催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。 两条子链的合成在时间上的不同步。 线粒体粒体DNA；D-环复制复制 In mit. DNA In mit. DNA also in chl. DNA also in chl. DNA D环复制环复制 四、复制的速度与时间四、复制的速度与时间 （speed & time） 原核生物：原核生物：5X104bp/min E.coli 5X106bp, 双向等速，双向等速，单复制子复制子 一般情况需一般情况需40mins, 丰富培养基中形成多复制叉，丰富培养基中形成多复制叉，20mins真核生物：真核生物：2000bp/min human 3X109bp, 双向、多复制子双向、多复制子 需需6-8hrsDNA复制的速度复制的速度染色体染色体DNA：S期期细胞器细胞器DNA：整个细胞周期整个细胞周期质粒质粒DNA：随染色体复制或单独复制随染色体复制或单独复制病毒病毒DNA：立即复制或整合到宿主染色体中立即复制或整合到宿主染色体中DNA复制的时间复制的时间DNA replication at phase S of cell cycleDNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs 2000 bp/min G112hs五、五、与与DNADNA复制有关的酶、蛋白质复制有关的酶、蛋白质 （enzymes & proteins ） 参与参与DNA复制的主要复制的主要酶和蛋白和蛋白质的的结构与功能构与功能DNA聚合酶DNA解链酶单链结合蛋白DNA引发酶DNA拓扑异构酶DNA连接酶端聚酶（真核生物特有） DNA聚合聚合酶DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA合成的聚合酶。DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶，该酶的许多性质直接决定了DNA复制的一些基本特征。DNA聚合聚合酶反应通式： 原核生物DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V 真核生物DNA 聚合酶 DNA pol ,和以及更多随后的随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行迅速水解驱动反应的进行模板；模板；引物；引物；dNTP；合成方向；合成方向；反应可逆；反应可逆；Mg2+；ArthurKornberg(1957)大肠杆菌细胞蛋白质提取物大肠杆菌细胞蛋白质提取物+DNA模板模板有无有无DNA合成合成?- dNTPs- Mg2+ (辅助因子辅助因子)- ATP (能源能源)- 游离的游离的3OH端端 (引物引物)体外测定体外测定DNA复制复制纯化得到纯化得到DNA聚合酶聚合酶I 目前是目前是Standford大大 学医学院的终身教授学医学院的终身教授不可思议!l53外切核酸酶l 35外切核酸酶l 53DNA聚合酶DNA聚合酶聚合酶I一条单一肽链至少具有三种不同的酶活性！一条单一肽链至少具有三种不同的酶活性！DNA聚合酶折叠成几个不同的结构域聚合酶折叠成几个不同的结构域HansKlenowHansKlenow使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理理DNADNA聚合酶聚合酶I I，结果得到大小两个片段，其中大，结果得到大小两个片段，其中大片段被称为片段被称为KlenowKlenow片段或片段或KlenowKlenow酶，它含有大小酶，它含有大小两个结构域，其中小结构域具有两个结构域，其中小结构域具有3535外切酶活性，外切酶活性，大结构域具有大结构域具有5353聚合酶活性，小片段只有聚合酶活性，小片段只有5353外切酶活性。外切酶活性。TomSteitzTomSteitz等得到了等得到了KlenowKlenow酶的晶体结构酶的晶体结构 大片段：大片段：大片段：大片段：75kd75kd 聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性 3 3 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性 小片段：小片段：小片段：小片段：36kd36kd 5 5 3 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性Klenow fragmentThe protein is folded into discrete domainsThe protein is folded into discrete domainsHans KlenowHans Klenow 用蛋白水解酶水解用蛋白水解酶水解用蛋白水解酶水解用蛋白水解酶水解DNA pol I DNA pol I 的的的的323-323-324324位，得到两个片段；位，得到两个片段；位，得到两个片段；位，得到两个片段；Klenow fragment 具有校对作用具有校对作用Proofreading functionKlenow酶的晶体结构模型酶的晶体结构模型 Conceptual model for proofreading based on kinetic considerationsstalling transient melting exonuclease site occupancy对DNA聚合酶I更多的认识为什么具有35外切核酸酶?l l充当校对的功能l l去除复制中错配的核苷酸，然聚合酶有机会重新合成正确配对的核苷酸DNA聚合酶的聚合和校对聚合酶的聚合和校对 53核酸外切酶活性核酸外切酶活性切口（缺刻）平移切口（缺刻）平移nick translation* gap fill-inDNA pol I DNA pol I 3 3 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性与与与与5 5 3 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性的比较的比较的比较的比较A A；作用于单链；作用于单链；作用于单链；作用于单链；B B；作用于双链；作用于双链；作用于双链；作用于双链；A A；作用方向，；作用方向，；作用方向，；作用方向，3 3 5 5 B B；作用方向，；作用方向，；作用方向，；作用方向， 5 5 3 3 A A；与聚合酶活性紧密结合，相互影响；与聚合酶活性紧密结合，相互影响；与聚合酶活性紧密结合，相互影响；与聚合酶活性紧密结合，相互影响；B B；与聚合酶活性无关，可同时进行；与聚合酶活性无关，可同时进行；与聚合酶活性无关，可同时进行；与聚合酶活性无关，可同时进行；DNA聚合酶I所具有的53聚合酶和53外切酶活性的联合使用可导致一个具有切口的DNA分子发生切口平移。如果在切口平移反应中加入放射性标记的dNTP，则放射性标记的核苷酸会参入到重新合成的DNA链上，从而使DNA的一条链带上同位素标记。 1969年，John Cairns和 Paula deLucial l分离到一种大肠杆菌突变株，其DNA聚合酶I活性只有野生型的1%(polA基因突变)-突变体对UV辐射极为敏感-其他一切正常- -细胞能够分裂结论结论:DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶DNA 聚合酶I是不错，然而.JJ速度太慢速度太慢JJ酶量太多酶量太多JJ进行性不够高进行性不够高聚合酶的进行性是指一种聚合酶从与聚合酶的进行性是指一种聚合酶从与DNADNA模板结合到与模板解离的这段时间内催化参入到模板结合到与模板解离的这段时间内催化参入到DNADNA链上的核苷酸数目。显然，链上的核苷酸数目。显然，DNADNA聚合酶的进行性越聚合酶的进行性越高，催化复制的效率就越高。聚合酶高，催化复制的效率就越高。聚合酶I I的进行性平均值为的进行性平均值为20nt50nt20nt50nt，远远低于实际值。，远远低于实际值。结论：一定有其他结论：一定有其他DNA聚合酶。生化学家很快从polA突变体纯化到新的DNA聚合酶其他线索.-在多种需要短DNA合成的过程中起作用- -在DNA修复中起主要作用- -在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留下的空缺。DNA聚合酶I的功能究竟是什么？已在大肠杆菌中发现5种不同的DNA聚合酶l lDNAPI:DNAPI:占聚合酶总活性的占聚合酶总活性的90%90%l lDNAPII:DNAPII: 在在DNADNA修复中起作用修复中起作用(1999(1999年得到证明年得到证明) )l lDNAPIII:DNAPIII: 主要的主要的DNADNA复制酶复制酶l lDNAPIV:在DNA修复中起作用（在（在19991999年发现）年发现）l lDNAPV:在DNA修复中起作用（在（在19991999年发现）年发现）DNA聚合酶家族DNA pol IIl l19701970年分离得到；年分离得到；年分离得到；年分离得到；l l聚合酶活性：聚合酶活性：聚合酶活性：聚合酶活性：2400base/min2400base/min；l l100100分子分子分子分子/cell/cell；l l有有有有3 3 5 5 核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，核酸外切酶活性， 没有没有没有没有5 5 3 3 核酸外切酶活性；核酸外切酶活性；核酸外切酶活性；核酸外切酶活性；l l在在在在DNA repair DNA repair 中起作用；中起作用；中起作用；中起作用；“ “真正真正” ”的大肠杆菌的大肠杆菌DNADNA复制酶复制酶快：快：1000nt/1000nt/秒秒/ /酶酶 进行性高：进行性高：500000nt500000nt酶量合适酶量合适精确精确温度敏感型突变体温度敏感型突变体只能生存在允许温度（只能生存在允许温度（3030）下，当）下，当温度上升到限制温度（温度上升到限制温度（4545）时，大肠杆菌难以生存。究其）时，大肠杆菌难以生存。究其原因，是因为编码聚合酶原因，是因为编码聚合酶IIIIII亚基的亚基的polCpolC基因发生了突变，致基因发生了突变，致使该酶对温度变化极为敏感。当环境温度超过使该酶对温度变化极为敏感。当环境温度超过3030以后，就以后，就很容易变性而丧失活性，这时很容易变性而丧失活性，这时DNADNA复制不能正常进行；而在复制不能正常进行；而在允许温度下，该酶的活性是正常的，允许温度下，该酶的活性是正常的，DNADNA复制也很正常。复制也很正常。 DNA聚合酶III其结构十分复杂!DNA聚合酶聚合酶III全酶的滑动钳夹住双螺旋全酶的滑动钳夹住双螺旋DNA DNA聚合聚合酶酶I、II和和III的性的性质和功能和功能性质DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III结构基因polApolBpolC分子量（kDa）10390130分子数/细胞40010010Vmax(参入的nt/秒)16202525010003-外切酶活性5-外切酶活性进行性（nt）320010 000500 000突变体表现型UV敏感、硫酸二甲酯敏感无DNA复制温度敏感型生物功能DNA修复、RNA引物切除DNA修复染色体DNA复制其它的其它的DNA polDNA pol IV 和和DNA pol V1999年发现；年发现；在在DNA errorprone repair中起作用；中起作用；真核真核细胞的胞的DNA聚合聚合酶已在真核细胞中发现至少15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的DNA聚合酶、和以外，其它几种DNA聚合酶如聚合酶、和都有相关的报道，这些新发现的DNA聚合酶一般缺乏3-外切酶的活性（除外），因此没有校对的功能，它们主要参与DNA的跨越合成，以克服损伤对DNA复制的不利影响。 真核生物真核生物DNA polDNA pol : 引物合成引物合成DNA pol : DNA repair DNA pol : 线粒体粒体 DNA合成合成DNA pol : DNA pol IIIDNA pol : DNA pol I真核真核细胞胞DNA聚合聚合酶酶、和和的性的性质和功能和功能性质DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶亚细胞定位细胞核细胞核线粒体基质细胞核细胞核引发酶活性有无无无无亚基数目41424催化亚基的相对分子质量（kDa）16018540125125210230或125140对dNTPs的Km值(M)251040.524内在的进行性中等低高低高在PCNA存在时的进行性中等低高高高3-外切酶活性5-外切酶活性对3,5-ddNTP的敏感性低高高低中等对阿拉伯糖CTP的敏感性高低低高高对四环双萜的敏感性高低低高高生物功能细胞核DNA复制细胞核DNA修复线粒体DNA复制细胞核DNA复制细胞核DNA复制和修复真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶 真核真核DNA聚合酶聚合酶和和在跨损伤合成中的作用在跨损伤合成中的作用 真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶由由PCNA三个亚基构成的滑动钳结构三个亚基构成的滑动钳结构 DNA解解链酶DNA解链酶是一类催化DNA双螺旋解链的酶。它几乎参与和DNA有关的一切代谢过程，包括DNA复制、转录、修复和重组。任何一种DNA解链酶都能够结合DNA，这种结合与DNA序列无关，这是解链酶作用的前提。大多数解链酶优先结合DNA的单链区域，少数解链酶，优先结合DNA的双链。解链酶除了能够结合DNA以外，还能够结合NTP，并同时具有内在的依赖于DNA的NTP酶活性。所有的DNA解链酶都具有移位酶活性。其移位酶活性使得它沿着被结合的DNA链单向移动，以不断地解开DNA双链区域。 大肠杆菌大肠杆菌DnaB蛋白的解链酶活性蛋白的解链酶活性 单链DNA结合蛋白（合蛋白（SSB）是一种专门与DNA单链区域结合的蛋白质，为DNA复制、修复和重组所必需的成分。SSB本身并没有任何酶的活性，但通过与DNA单链区段的结合在DNA复制、修复和重组中发挥以下几个方面的作用：（1）暂时维持DNA的单链状态，防止互补的单链在作为复制模板之前重新退火成双螺旋；（2）防止DNA的单链区域自发形成链内二级结构（如链内双螺旋），以消除它们对DNA聚合酶进行性的影响；（3）包被DNA的单链区段，防止核酸酶对DNA单链区域的水解；（4）刺激某些酶的活性。 大肠杆菌单链结合蛋白与单链大肠杆菌单链结合蛋白与单链DNA结合的协同效应结合的协同效应 DNA拓扑异构拓扑异构酶拓扑异构酶是一类通过催化DNA链的断裂、旋转和重新连接而直接改变DNA拓扑学性质的酶。此类酶不仅可以解决在DNA复制、转录、重组和染色质重塑过程中遇到的拓扑学障碍，而且能够细调细胞内DNA的超螺旋程度，以促进DNA与蛋白质的相互作用，同时防止DNA形成有害的过度超螺旋。按照DNA链的断裂方式，拓扑异构酶被分为I型和II型。I型在作用过程中，只能切开DNA的一条链，而II型均为寡聚体蛋白，在作用过程中同时交错切开DNA的两条链，并能在消耗ATP的同时将一个DNA双螺旋从一个位置经过另一个双螺旋的裂口“主动运输”到另外一个位置。 II型拓扑异构酶主要参与DNA复制，既可以在DNA分子中引入有利于复制的负超螺旋，又可以及时清除复制叉前进中形成的正超螺旋，还能分开复制结束后缠绕在一起的两个子代DNA分子，其催化的反应依赖于ATP。 DNA复制过程中形成的正超螺旋复制过程中形成的正超螺旋 I型型DNA拓扑异构酶的作用机理拓扑异构酶的作用机理 DNA拓扑异构酶的催化的转酯反应拓扑异构酶的催化的转酯反应 II型型DNA拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶的作用机制 DNA引引发酶是一种专门用来起动或引发DNA合成的酶。由于DNA聚合酶本身不能起动多聚物的合成，只能延伸已经被起动的多聚物，因此，引发酶是DNA复制所必需的。因为DNA复制的半不连续性，所以，引发酶在前导链上只需用引发一次，而在后随链上则需用引发多次。大肠杆菌引发酶的结构模型大肠杆菌引发酶的结构模型 切除引物的切除引物的酶RNA引物只是用来起动DNA的复制，它最终并不存在于被复制的DNA分子之中，迟早要被除去，实际上，细胞内有专门的酶负责切除RNA引物。原核细胞内切除RNA的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H。真核细胞负责切除RNA引物的酶是RNase H/FEN1或FEN1/Dna2。 DNA连接接酶是一类催化一个双螺旋DNA内相邻核苷酸3-羟基和5-磷酸甚至两个双螺旋DNA两端的3-羟基和5-磷酸发生连接反应形成3,5-磷酸二酯键的酶。DNA连接酶在DNA复制过程中的作用是“缝合”后随链上相邻的冈崎片段，使不连续合成的后随链成为一条连续的链。 DNA连接酶在催化连接反应时需消耗能量。根据能量供体的性质，连接酶可以分为两类：第一类使用 NAD+，第二类使用ATP。细菌的DNA连接酶属于第一类，真核细胞、病毒和噬菌体的连接酶属于第二类。 DNA连接酶的作用机理连接酶的作用机理 尿嘧啶-DNA糖苷酶尿嘧啶-DNA糖苷酶是一种专门用来切除出现在DNA链上非正常尿嘧啶碱基的水解酶。尿嘧啶出现在DNA链上有两种原因：一是在DNA复制过程中，细胞中存在的dUTP代替dTTP直接进入新合成的DNA链；二是DNA分子中的胞嘧啶碱基发生自发脱氨基作用。 端聚端聚酶的的结构与功能构与功能端聚酶也称为端粒酶或端粒末端转移酶，由蛋白质和RNA两种成分组成，其中蛋白质具有逆转录酶的活性，其三维结构与其它逆转录酶有明显的相似性，而RNA含有1.5拷贝的端粒DNA重复序列，这一部分序列作为逆转录酶的模板。不同来源的端聚酶在RNA长度上变化很大，但它们都形成特定的二级结构，作为模板的那一部分序列处于单链状态，以方便它与端粒区的重复序列结合，并有效地充当逆转录的模板。几种真核生物的端粒重复序列几种真核生物的端粒重复序列物种名称重复序列四膜虫、草履虫和纤毛虫T2G4酵母(TG)13TG23拟南芥T3AG3人T2AG3端聚酶的结构模型端聚酶的结构模型 端聚酶的作用机理端聚酶的作用机理 端粒酶活性与细胞分裂能力的关系端粒酶活性与细胞分裂能力的关系 六、六、 DNADNA复制的过程复制的过程复制的起始（复制的起始（InitiationInitiation）复制的延伸（ElongationElongation）复制的终止（TerminationTermination）以大以大肠杆菌杆菌为代表的代表的“-复制复制”系系统 DNA复制的起始起始于OriC的识别，结束于引发体的形成 DNA复制的延伸 （1）复制体的形成（2）前导链合成（3）后随链合成（4）前导链合成和后随链合成之间的协调 DNA复制的终止和子代DNA的分离 参与大参与大肠杆菌杆菌DNA复制的主要蛋白复制的主要蛋白质或或酶酶的名称和功能的名称和功能蛋白质名称功能DNA旋转酶II型拓扑异构酶，负责清除复制叉前进中的拓扑学障碍SSB单链结合蛋白DnaA蛋白复制起始因子，识别复制起始区OriCDnaB蛋白DNA解链酶DnaC蛋白招募DnaB蛋白到复制叉DnaG蛋白DNA引发酶，引物合成DnaT蛋白辅助DnaC蛋白的作用HU蛋白类似于真核细胞的组蛋白，结合DNA并使DNA弯曲PriA蛋白引发体的装配PriB蛋白引发体的装配PriC蛋白引发体的装配DNA聚合酶IIIDNA链的延伸DNA聚合酶I切除引物，填补空隙DNA连接酶缝合相邻的冈崎片段DNA拓扑异构酶IV分离子代DNARep蛋白DNA解链酶Tus复制终止大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起始区的结构复制起始区的结构 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制过程中引发体的形成复制过程中引发体的形成 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制过程中复制体的形成复制过程中复制体的形成 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制的延伸复制的延伸 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制终止区的结构复制终止区的结构 子代子代DNA的分离的分离 真核真核细胞的胞的DNA复制复制真核细胞的DNA复制在很多方面与原核细胞极为相似，但也有几点不同于原核细胞的地方：（1）需要解决核小体和染色质结构对DNA复制构成的障碍；（2）复制叉移动的速度远低于原核细胞；（3）具有多个复制子，这可以弥补复制叉移动速度低对整个DNA复制速度的制约；（4）冈崎片段的长度小于原核细胞；（5）复制被限制在细胞周期的S期，并受到严格的调控；（6）在第一轮复制结束之前不可能进行第二轮复制，而原核细胞在第一轮复制还没有结束的时候就可以进行第二轮复制；（7）需要端聚酶解决染色体DNA末端复制问题。 真核细胞真核细胞DNA复制叉的结构模型复制叉的结构模型 参与真核参与真核细胞胞DNA复制的主要蛋白复制的主要蛋白质和和酶酶的的结构与功能构与功能蛋白质名称大小（kDa）功能T抗原（Tumor antigen）90识别复制起始区，35解链酶（受RPA的刺激）复制蛋白A（RPA）70，34，11结合单链DNA，刺激复制起始区的解链，刺激T抗原的解链酶的活性，刺激DNA聚合酶/引发酶的活性，与RFC和PCNA一道刺激DNA聚合酶的活性以产生较长的DNA产物。还能阻止DNA聚合酶/引发酶与新合成的链结合。DNA聚合酶/引发酶167, 79, 62, 48起动前导链和后随链的合成，在5-端合成约10 nt的RNA引物，3-端合成约30 nt的DNA。在后随链模板上频繁起动引物的合成。聚合酶无校对功能。 p167具有聚合酶活性，p48具有引发酶活性。与引发点稳定的结合需要RPA 的刺激。DNA聚合酶125, 55, 40完成前导链和后随链的合成。125 kDa亚基具有聚合酶和35外切酶活性，p40与 PCNA相互作用。DNA聚合酶255, 79, 29, 23并非SV40 DNA复制所必需的，但在酵母细胞中p255基因的缺失可导致细胞死亡。它在复制中确切的功能尚不清楚。p255具有聚合酶和35外切酶活性。参与真核参与真核细胞胞DNA复制的主要蛋白复制的主要蛋白质和和酶酶的的结构与功能（构与功能（续）蛋白质名称大小（kDa）功能复制因子C（RFC）140, 40, 38, 37, 36装载PCNA到DNA，依赖于DNA的 ATP酶活性（受到PCNA的刺激），与引物的3-端结合，结合需要 ATP。参与聚合酶的切换：打破RPA和DNA聚合酶/引发酶的接触，从而使聚合酶与 PCNA相连。分裂细胞核抗原（PCNA）36 提高聚合酶和聚合酶进行性，形成三聚体的环形结构（类似于大肠杆菌DNA 聚合酶III的亚基），也可以和 RFC、FEN-1、核苷酸切除修复蛋白XPG以及其它一些蛋白质结合。拓扑异构酶I110释放复制叉前面的超螺旋张力。拓扑异构酶IIa或IIb170 (IIa), 180 (IIb)分开连环体。翼式内切核酸酶（FEN-1）4353外切酶/内切酶，切除冈崎片段5-端的RNA引物，但不能水解与单链DNA相杂交的5-三磷酸核苷酸（需要RNaseH1切掉5-端的一段核苷酸），与PCNA的结合可刺激它的活性到10倍。FEN-1还能去除由DNA聚合酶/引发酶合成的错配核苷酸。RNaseH189内切核酸酶，切断引物在5-端留下单核糖核苷酸。DNA连接酶I125连接冈崎片段，结合PCNA。使用ATP为能源。SV40的的 DNA复制模型复制模型 线形形DNA末端复制末端复制问题的解决的解决（1）使用端聚酶；（2）将线形DNA暂时转变为环形DNA；（3）经重组形成串联体；（4）滚环复制；（5）使用蛋白质-dNTP作为引物。T7噬菌体噬菌体DNA末端末端DNA的复制的复制 人体发育完成，端粒酶被抑制，人体发育完成，端粒酶被抑制， 细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小小 大大端粒长度端粒长度 长 短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老癌细胞的无限繁殖癌细胞的无限繁殖 ( (癌细胞中的端粒酶被激活癌细胞中的端粒酶被激活) )正常细胞的寿命一定，正常细胞的寿命一定，called called “the Hayflick limitthe Hayflick limit”治疗肿瘤的可能方式：关闭端粒酶基因，或者抑制端粒酶活性治疗肿瘤的可能方式：关闭端粒酶基因，或者抑制端粒酶活性延长人类寿命或者获得永生的希望：重新体细胞中的激活端粒酶活性延长人类寿命或者获得永生的希望：重新体细胞中的激活端粒酶活性DNA复制的高度忠复制的高度忠实性性（1）四种dNTPs浓度的平衡（2）DNA聚合酶的高度选择性（3）DNA聚合酶的自我校对（4）错配修复（5）使用RNA作为引物绝绝 句句复错不要紧，只要校对真，错了我一个，还有后来酶。干干细胞分裂胞分裂过程中的程中的“不朽不朽链假假说”干细胞的分裂是不对称的，而分裂的不对称性使以后的干细胞能够选择性得到含有最老的DNA模板的染色体。这样的假设是合乎逻辑的，因为如果一个干细胞在分裂中抓住最老的DNA，就等于将复制可能产生的错误“拒之门外”，从而大大降低了细胞癌变的可能性，而将来分化成体细胞的子细胞得到易错的新DNA也没有什么危险，因为它们很快停止分裂或者死亡，特别是在高度更新的组织。“不朽链假说不朽链假说”图解图解 DNA复制的复制的调节机制机制 DNA复制的调控主要集中在起始阶段，现分别介绍原核细胞和真核细胞的DNA复制的起始过程是如何受到调控的。原核细胞DNA复制起始的调控 在大肠杆菌，由Dam甲基化酶和DnaA蛋白控制。真核细胞DNA复制起始的调控（1）由执照因子控制的正调控（2）由增殖蛋白控制的负调控甲基化对原核细胞甲基化对原核细胞DNA复制的调节复制的调节 错配修复酵母细胞酵母细胞DNA复制的正调控复制的正调控 DNA 损伤、修复和突变损伤、修复和突变DNA既稳定，既稳定， 但也脆弱但也脆弱哪些因素能影响到哪些因素能影响到DNA的完整性？的完整性？N细胞内源的因素N环境因素-例如化学试剂、污染物和UV线N疾病治疗-例如离子辐射和化疗细胞内源因素细胞内源因素N复制错误N例如四种dNTP之间的不平衡导致错配NDNA本身的不稳定N碱基的自发脱氨基NDNA的脱嘌呤/脱嘧啶导致碱基脱落N活性氧的作用NDNA,蛋白质和脂质的氧化DNA分子上的自发脱嘌呤作用和自发脱氨基作用分子上的自发脱嘌呤作用和自发脱氨基作用脱嘌呤脱嘌呤/脱嘧啶脱嘧啶*脱嘌呤比脱嘧啶更容易*在DNA分子上产生无碱基位点（AP位点）*大肠杆菌1次脱嘌呤/基因组/复制*嗜热水生菌300次脱嘌呤/基因组/复制*哺乳动物细胞10000次脱嘌呤/基因组/复制活性氧（活性氧（ROS）*由正常的细胞代谢产生*线粒体利用细胞85%O2，是主要的ROS来源*导致DNA、蛋白质和脂质损伤*常见的形式：过氧化氢(H2O2)超氧化物自由基(O2-)一氧化氮(NO)羟基自由基(HO)过氧亚硝基阴离子(O=NOO-)烷过氧化物(ROOH)烷氧自由基(RO)环境（外源）因素环境（外源）因素N化学试剂(1)天然化合物黄曲霉素(2)人造化合物苯并芘-香烟顺铂-化疗药物N物理因素(1)UV(2)离子辐射-射线x-射线DNA损伤类型损伤类型N碱基修饰N碱基丢失-无碱基位点N复制错误：错误N链断裂N蛋白质-DNA交联NDNA-DNA交联DNA损伤的因素和损伤的主要类型损伤的因素和损伤的主要类型损伤类型实例/原因碱基丢失自发脱碱基（热、酸），脱嘌呤脱嘧啶，104嘌呤脱落/天/细胞（恒温动物）碱基修饰形成碱基加合物，例如，8-羟基脱氧鸟嘌呤（离子辐射或活性氧），6-烷基鸟嘌呤（烷基化试剂）碱基交联嘧啶二聚体和6-4光产物（UV）碱基转换CU，AI（自发脱氨基），100碱基脱氨基/天/细胞碱基错配GT（4种dNTP浓度不平衡、碱基的互变异构或碱基之间的差别不足）DNA链断裂因磷酸二酯键被破坏引起单链断裂或双链断裂（离子辐射或特殊的化学试剂），因脱氧核糖环3号位发生断裂引起的DNA链断裂（博来霉素）DNA链间交联互补双链之间产生交联（双功能试剂的作用）DNA与蛋白质的交联UV活性氧的碱基修饰作用活性氧的碱基修饰作用 鸟嘌呤的甲基化导致碱基错配鸟嘌呤的甲基化导致碱基错配 紫外线引起的碱基损伤紫外线引起的碱基损伤 离子辐射引起的离子辐射引起的DNA链断裂链断裂 稳定，但脆弱稳定，但脆弱*不修复将导致突变不修复将导致突变干扰转录和复制导致突变加速衰老*细胞的修复机制是必需的细胞的修复机制是必需的修复机制是全方位的、高效的1/1000损伤躲过修复DNA 修复修复DNA与其它生物大分子一样，在受到机体内外因素的作用下，其结构会遭受到各种各样的损伤，但是，和其它生物大分子不一样的是，DNA是唯一的一种在发生损伤以后可以被完全修复的分子，而其它生物大分子在受到损伤以后要么被降解，要么被取代。当然，并不是发生在DNA分子上的所有损伤都可以修复。如果DNA受到的损伤不能及时被修复，不仅会使DNA的复制和转录受到影响，还可以导致细胞的癌变和早衰。细胞之所以在DNA受到损伤以后，选择的处理方法是尽量将其修复而不是将其降解，这一是因为作为遗传物质的DNA分子在细胞内只有一个拷贝，如果将其水解的话，细胞也就失去了存在的根基；二是DNA的互补双螺旋结构使得修复一个受损伤的DNA分子变得很容易。正因为如此，一种生物体，即使是那些基因组甚小的生物，也会在修复上投入大量的基因（100个基因），这再次说明了DNA的稳定性压倒一切。.被科学杂志评为1994年的年度分子DNA修复机制修复机制直接修复切除修复错配修复双链断裂修复易错修复重组修复直接修复直接修复嘧啶二聚体的直接修复由DNA光裂解酶催化。此酶直接识别和结合嘧啶二聚体。然后，利用作为吸光色素的辅基捕捉到的光能，将嘧啶二聚体打开，最后再与DNA解离。但是胎盘类哺乳动物却没有这种酶。烷基化碱基的直接修复由特定的烷基转移酶催化DNA链断裂的直接修复由DNA连接酶催化。光裂解酶的三维结构光裂解酶的三维结构 嘧啶二聚体的直接修复嘧啶二聚体的直接修复 光裂解酶作用的详细机制光裂解酶作用的详细机制 烷基化碱基的直接修复烷基化碱基的直接修复 切除修复切除修复切除修复先切除损伤的碱基或核苷酸，然后，重新合成正常的核苷酸，最后，再经连接酶重新连接，将原来的切口缝合。整个切除修复过程包括识别、切除、重新合成和重新连接。切除修复又分为碱基切除修复（BER）和核苷酸切除修复（NER），两者的主要差别在于识别损伤的机制上，前者是直接识别具体的受损伤的碱基，而后者并不识别具体的损伤，而是识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲。碱基切除修复碱基切除修复*DNA糖苷酶切除受损伤的碱基*短修补是主要途径，约占80%90%，只需合成属于AP位点的1个正常的核苷酸*长修补是次要途径，约占10%20%，为短修补途径的备用途径，要合成1小段寡聚核苷酸尿嘧啶的切除修复尿嘧啶的切除修复 DNA糖苷酶都是糖苷酶都是沿着沿着DNA小沟扫小沟扫描描DNA，当找到，当找到受损伤的碱基以受损伤的碱基以后即与后即与DNA结合，结合，并导致并导致DNA结构结构发生歪曲，以便发生歪曲，以便将损伤的碱基挤将损伤的碱基挤出双螺旋，进入出双螺旋，进入它的活性中心被它的活性中心被切割。切割。 真核细胞的碱基切除修复真核细胞的碱基切除修复 核苷酸切除修复核苷酸切除修复NER最初的切点是损伤部位附近的3,5-磷酸二酯键，主要用来修复因UV、丝裂霉素C和顺铂等因素造成的比较大的损伤，如嘧啶二聚体、6-4光产物或体积较大的碱基加合物以及链间交联等导致DNA结构发生扭曲并影响到DNA复制的损伤，此外，约20%碱基的氧化性损伤也由它修复。在修复过程中，损伤以寡聚核苷酸的形式被切除。由于NER识别损伤的机制并非针对损伤本身，而是损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲，因此，NER能够使用相同的机制和几乎同一套修复蛋白去修复一系列性质并不相同的损伤。NER在所有的生物具有相同的步骤：在所有的生物具有相同的步骤：识别损伤由特殊的蛋白质完成，并由此引发一系列的蛋白质与受损伤DNA的有序结合；切除损伤特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开DNA链，随后两个切口之间带有损伤的DNA片段被去除；修复合成DNA聚合酶以另外一条链为模板，合成已被切除的序列；缝合切口由DNA连接酶催化。两类碱基切除修复两类碱基切除修复-全局性基因组NER和转录偶联性NERC全局性基因组NER负责修复整个基因组的损伤，速度慢，效率低。C转录偶联性NER专门负责修复那些正在转录的基因在模板链上的损伤，速度快，效率高。C两类NER的主要差别在于识别损伤的机制上，至于损伤识别以后发生的修复反应并无本质上的不同。TCR由RNA聚合酶识别损伤，当RNA聚合酶转录到受损伤部位而前进受阻的时候，TCR系统即被起动。全局性全局性NER和转录偶联性和转录偶联性NER *受到ATP水解的驱动，2个UvrA与1个UvrB形成三聚体复合物（UvrA2UvrB1）；*该复合物与DNA随机结合后，沿着DNA链移动，以探测损伤的位置。*识别损伤的过程比较缓慢，为GGR系统的限速步骤。*当遇到嘧啶二聚体时，通过水解ATP，造成损伤部位的DNA双螺旋发生局部解链和进一步弯曲，致使UvrB与损伤部位形成更紧密的接触；*UvrA在ATP水解后离开复合物，留下UvrB横跨损伤部位；大肠杆菌大肠杆菌的核苷酸切除修复的核苷酸切除修复*UvrC被UvrB招募到损伤部位后激活UvrB的核酸内切酶活性，UvrB在距离嘧啶二聚体的下游4nt的位置切开DNA链；*与此同时，UvrC的核酸内切酶活性被UvrB激活，在距离嘧啶二聚体的上游7nt的位置切开DNA链；*于是，产生一个长达13nt的含有嘧啶二聚体的寡聚核苷酸片段。大肠杆菌大肠杆菌的核苷酸切除修复的核苷酸切除修复*在解链酶UvrD的作用下，ATP被水解，包含嘧啶二聚体的DNA片段发生解链而离开双螺旋，UvrC也随之而去；*最后，DNA聚合酶I或II填补空缺；*DNA连接酶则缝合切口。大肠杆菌大肠杆菌的核苷酸切除修复的核苷酸切除修复转录偶联性核苷酸切除修复转录偶联性核苷酸切除修复 哺乳动物细胞的全局性哺乳动物细胞的全局性NER和转录偶联性和转录偶联性NER 错配修复错配修复 （MMR）MMR系统主要用来修复DNA分子上错配碱基对，此外，还能修复一些因“复制打滑”而诱发的核苷酸插入或缺失损伤。错配修复系统必须能够保证只会将子链上错误的碱基切除，而不会把母链中本来就正确的碱基切除。大肠杆菌的MMR系统的确就是利用甲基化来区分子链和母链的，因此，大肠杆菌内修复复制中产生的错配碱基的系统又称为甲基化导向的错配修复。至于其它细菌和真核细胞如何区分子链和母链的尚不清楚。参与错配修复的蛋白质和酶的名称和功能参与错配修复的蛋白质和酶的名称和功能大肠杆菌酵母哺乳动物大肠杆菌中蛋白质的功能MutSMsh2,Msh6,Msh3Msh1（线粒体）Msh4，Msh5（减数分裂重组）Msh2,Msh6,Msh3不明Msh4，Msh5（减数分裂重组）识别错配碱基，具有弱的ATP酶活性。MutLMlh1Pms1Mlh2,Mlh3Mlh1Pms2Pms1调节MutS和MutH之间的相互作用，与UvrD作用。MutH不明不明结合半甲基化的GATC位点，序列和甲基化特异性内切酶，剪切非甲基化GATC的5-端。UvrD不明不明解链酶II，催化被切开的含有错配碱基的子链与母链的分离。大肠杆菌大肠杆菌MMR作用的主要步骤作用的主要步骤*（1）首先由MutS识别并结合除了C-C以外的错配碱基对，MutL随后结合；（2）在错配碱基对两侧的DNA通过MutS作相向移动；（3）MutH与MutL和GATC位点结合；（4）MutH的核酸内切酶活性被MutS/MutL激活，在非甲基化GATC的5-端切开子链；（5）UvrD作为解链酶，催化被切开的含有错配碱基的子链与母链的分离，SSB则与母链上处于单链状态的区域结合，特殊的外切酶将游离出来的含有错配碱基的单链DNA进行水解。如果MutH的切点在错配碱基的3-端，将由外切核酸酶I或X从35方向水解。如果MutH的切点在在错配碱基的5-端，则由外切核酸酶VII和RecJ来降解；（6）最后，DNA聚合酶III和连接酶分别进行缺口的修复合成和切口的缝合。Damage Bypass*ManylesionscanstillescapeDNArepairandarepresentatthetimeofDNAreplication*DuringDNAreplication-unrepaireddamagecanblockthemajorreplicativeDNApolymerasePol(,)andhaltreplication*Needtobypasstheblockormayresultinchromosomaltruncation*BERandNERcantbeusedbecausethereplicationforkhasalreadyseparatedtheparentalDNAstrands*TwoSystemsareused-RecombinationalBypassandBypassSynthesis双链断裂修复双链断裂修复同源重组修复利用细胞内一些促进同源重组的蛋白质来从姊妹染色体或同源染色体那里获得合适的修复断裂的信息，这一种方式的精确性较高；非同源末端连接（NHEJ）修复在无序列同源的情况下，让断裂的末端重新连接起来，这种方式容易发生错误，是人类修复双链断裂的主要方式。DNA双链断裂的重组修复双链断裂的重组修复 哺乳动物细胞哺乳动物细胞DNA双链断裂的非同源末端连接双链断裂的非同源末端连接 损伤跨越损伤跨越重组跨越使用同源重组的方法将DNA模板进行交换以避免损伤对复制的抑制，从而使复制能够继续下去，而随后的复制仍然使用细胞内高保真的聚合酶，因此忠实性并无下降，故此途径被视为一种无错的系统。跨越合成又称为（TLS）跨损伤合成，由专门的DNA聚合酶与停留在损伤位点上的原来催化复制的DNA聚合酶交换，在子链上（模板链上损伤碱基的对面）插入正确或错误的核苷酸，结果导致对损伤位点无错或易错的跨越。大肠杆菌的重组跨越大肠杆菌的重组跨越 大肠杆菌的大肠杆菌的SOS反应反应 SOS反应是指细胞在受反应是指细胞在受到潜在致死性压力下，到潜在致死性压力下，例如例如UV辐射、胸腺嘧辐射、胸腺嘧啶饥饿、啶饥饿、DNA修饰物的修饰物的作用和作用和DNA复制所必需复制所必需的基因的失活，做出的的基因的失活，做出的有利于细胞生存的代谢有利于细胞生存的代谢预警反应，包括易错的预警反应，包括易错的跨损伤合成、细胞丝状跨损伤合成、细胞丝状化和切除修复的激活，化和切除修复的激活，其中涉及到近其中涉及到近20个个“sos”基因的表达，基因的表达，整个反应受到整个反应受到LexA 阻阻遏蛋白和遏蛋白和RecA激活蛋激活蛋白的调节。白的调节。 大肠杆菌大肠杆菌DNA损伤的跨越合成损伤的跨越合成 DNA聚合酶聚合酶V参与的跨损伤合成的详细步骤参与的跨损伤合成的详细步骤 真核细胞真核细胞DNA的跨损伤合成的跨损伤合成 DNA的突变的突变L修复系统的不完善，为DNA的突变打开了方便之门，因为这些损伤如果在下一轮DNA复制之前还没有被修复的话，就有可能直接被固定下来传给子代，有的则通过易错的跨损伤合成产生新的错误并最终也被固定下来。这些发生在DNA分子上可遗传的结构变化通称为突变突变的类型突变的类型L点突变是指DNA分子某一位点上所发生的一种碱基对变成另外一种碱基对的突变，可分为转换和颠换两种形式，其中，转换是指两种嘌呤碱基或两种嘧啶碱基之间的相互转变，颠换是指嘌呤碱基和嘧啶碱基之间的互变L移码突变是指在一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸（非3的整数倍）的缺失或插入。碱基突变的几种方式碱基突变的几种方式 移框突变移框突变 点突变的后果点突变的后果（1）突变的密码子决定同样的氨基酸，这样的突变对蛋白质的结构和功能不会产生任何影响，因此称为沉默突变。（2）突变的密码子决定不同的氨基酸，这样的突变可能对蛋白质的功能不产生任何影响或影响微乎其微，也可能产生灾难性的后果而带来分子病。由于突变导致出现了错误的氨基酸，因此，这样的突变称为错义突变。如果错误的氨基酸与原来的氨基酸是同种性质，这种突变被称为中性突变。（3）突变的密码子变为终止密码子或者相反，前者因为终止密码子的提前出现可导致一条多肽链被截短，被称为无义突变，后者则会加长一条多肽链，被称为加长突变或通读突变。隐性突变和显性突变LDNA突变可能是隐性的，也可能是显性的。L如果突变仅仅是灭活一种蛋白质，那么，这种突变一般产生隐性性状。因为染色体是成对的，每一个基因至少有2个拷贝，一条同源染色体上正常的基因能够抵消另一条同源染色体上突变的基因对细胞功能和性状的影响。因此，只有一对同源染色体上两个相同的基因都发生突变，才会影响到表现型；如果突变产生的蛋白质对细胞有毒，这种毒性无法被另外一条染色体上正常基因表达出来的正常的蛋白质所抵消或中和，那么，这种突变被视为显性。显性突变只需要两条同源染色体上任意一个拷贝上的基因发生突变，就可以带来突变体的表现型发生变化。突变的原因突变的原因几乎任何导致DNA损伤的因素都能够导致DNA突变，前提是它们造成的损伤在DNA复制之前还没有被细胞内的修复系统修复，因此，可以这样认为，导致DNA损伤的原因在某种意义上就是导致DNA突变的原因。由内在因素引起的突变被称为自发性突变，由外在因素引发的突变被称为诱发突变。各种导致DNA突变的内外因素总称为突变原。导致自发点突变的原因导致自发点突变的原因$自发的点突变（1）DNA复制过程中的错配（2）自发脱氨基（3）活性氧的氧化（4）碱基的烷基化$自发的移码突变（1）“复制打滑”（2）转座作用。烯醇式的烯醇式的T和和G的配对的配对 自发脱氨基和活性氧作用引起的碱基转换自发脱氨基和活性氧作用引起的碱基转换 复制打滑引起的移框突变复制打滑引起的移框突变 诱发突变诱发突变1.诱发点突变（1）碱基类似物，如5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤（2）烷基化试剂，如氮芥和硫芥等（3）脱氨基试剂，如亚硝酸（4）羟胺2.诱发移码突变嵌入试剂，如吖啶黄，原黄素和EB等碱基类似物诱发的点突变碱基类似物诱发的点突变 诱变剂诱发的点突变诱变剂诱发的点突变 嵌入试剂诱发的移框突变嵌入试剂诱发的移框突变 各种化学诱变剂化学结构各种化学诱变剂化学结构 回复突变与突变的校正回复突变与突变的校正（一）回复突变如果在老的突变位点上发生第二次突变，致使原来的表现型得到恢复，这样的突变被称为回复突变。表现型能够在回复突变中恢复可能是因为突变点编码的氨基酸变成原来的氨基酸或者性质相似的氨基酸，从而使原来的突变的蛋白质功能得到全部或部分恢复。（二）校正突变校正突变有时被称为假回复突变，它是指发生在非起始突变位点上但能够掩盖或抵消起始突变的第二次突变，它分为基因内校正和基因间校正。回复突变回复突变 基因内校正基因内校正基因内校正与起始突变发生在相同的基因内，它可能是通过点突变也可能通过移码突变来实现校正，不过点突变一般只能通过点突变来校正，移码突变只能通过移码突变来校正。如果是通过点突变来校正，一般是通过恢复一个基因产物内2个残基（氨基酸残基或核苷酸残基）之间的功能联系来实现的。具体机制可能是2次突变相互抵消了2个残基的变化，从而恢复了2个残基之间的相互作用，致使基因产物能够正确地折叠，或者是2个相同的亚基能够组装成有功能的同源二聚体。基因内校正基因内校正 基因间校正基因间校正基因间校正发生在与第一次突变不同的基因上，绝大多数是在翻译的水平上起作用。这种发生第二次突变具有校正功能的基因被称为校正基因。每一种校正基因只能作用于一种类型的突变，即是无义突变、错义突变和移码突变中的一种。校正基因一般是通过恢复2个不同的基因产物之间（2条不同的多肽链、2个不同的RNA或者1条多肽和1分子RNA）的功能关系来实现的。校正基因通常编码tRNA，因为它们是通过反密码子与mRNA上的密码子相互作用来参与翻译的，所以发生在tRNA反密码子上的突变可用来校正mRNA上一个密码子的突变，恢复密码子和反密码子之间的功能联系，从而使翻译出来的蛋白质的氨基酸序列恢复如初。基因间校正基因间校正 迂回校正迂回校正 迂回校正通常适迂回校正通常适用于一条调控途用于一条调控途径。蛋白质径。蛋白质C的的突变使得信息无突变使得信息无法从法从C传给传给D，从，从而导致整个调控而导致整个调控途径无法正常运途径无法正常运转。然而，蛋白转。然而，蛋白质质D的同时突变的同时突变使得它能够绕过使得它能够绕过C直接从蛋白质直接从蛋白质B得到信息，从而得到信息，从而使原来的调控途使原来的调控途径恢复畅通。径恢复畅通。 哺乳动物细胞对哺乳动物细胞对DNA损伤做出的各种反应损伤做出的各种反应