第四章第四章 放射免疫分析放射免疫分析目的与要求： 掌握放射免疫分析的基本原理，实验室配置及质量控制。内容： 放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年创建的一种体外放射分析技术。这是检验专业学生必须掌握和重点。第一节第一节 基本原理基本原理一、必须掌握放免分析的基本原理： 放射免疫分析是在体外条件下，由非标记抗原与定量的标记抗原对限量的特异性抗体的竞争性抑制的反应。 参加反应的有标记抗原、非标记抗原(标记抗原或待测抗原)和特异性抗体，如下几点必须透彻理解： 1、标记抗原与非标记抗原和特异抗体结合的能力被认为是相同的。 2、标记抗原与特异性抗体结合形成标记抗原抗体复合物，非标记抗原与特异性抗体结合形成非标记抗原抗体复合物。 3、标记抗原与非标记抗原之和多于物质异性抗体结合位点。这样当反应达到平稀时，标记抗原抗体复合物的生成量受非标记抗原数量的制约。例如：非标记抗原数量增加时，就会抑制标记抗原与抗体的结合，标记抗原抗体复合物的生成量就减少，未与抗体结合的标记抗原的数量加。这种特异性的竞争性抑制的数量关系就是放射免疫分析的定量基础。标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的特定函数关系，也称为剂量反应曲线。二、剂量反应曲线 剂量反应曲线又称标准曲线。是放射免疫分析定量的基础，是衡量物质浓度的客观尺度(一)标准曲线的手工绘制形态 标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，或所采用坐标系统不同而有不同的形态。(二)标准曲线的基本数学函数式 放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双向性的，服从质量作用定律。 (三)掌握亲和常数K值的计算、意义及应用、平衡常数K又称亲和常数，或叫做结合常数。该常数对特定的抗原抗体反应系统是固定不变的。K的单位为1mol或L/mol。 其意义在于可用K值反映抗体之间的亲和力。K值与游离抗体浓度呈反比关系。K值越大，则游离的抗体浓度Ab越小，结合的抗原抗体复合物Ag-Ab浓度越大。即抗原抗体的结合力越大。K值是与抗原抗体共同相关的数值，不能认为仅仅是抗体(或抗原)之间的K值。 目前，国内外有多种计算K值的方法，有的非常复杂，而通常使用的方法是S catchard分析作图法。(四)掌握标准曲线的斜率对测定的影响 标准曲线的斜率对放射免疫分析方法的灵敏度和精密度均有影响。 影响标准曲线斜率的因素： 1、亲和常数K 2、标记抗原和标准抗原的用量 3、特异性抗体的用量(五)掌握Bo(总结合)、T(总管)、NSB的概 念第二节第二节 放射免疫分析方法学放射免疫分析方法学一、掌握建立放射免疫分析方法的必备条件(一)对标准抗原的基本要求 (1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与抗体的亲和力和特异性应相同。标准抗原与待测抗原所处的介质条件应基本相同。 (2)抗原必须纯度度。 (3)标准抗原的量必须准确。 (4)标准抗原应有很好的稳定性。(二)对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱发产生多克隆抗体，选取抗体滴度高的血清，为RIA所用。抗血清的质量直接影响放射免疫分析方法的灵活敏度和特异性。检查抗血清质量的指标主要有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价)。(三)对标记抗原的要求 标记抗原是放射性测定的依据，对标记抗原的基本要求：1、标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。2、标记抗原要有适当高的放射性比活度。3、标记抗原应具有足够高的放射化学纯度(四)分离B与F的方法理想分离应满足如下要求：1、分离B、F完全、快速。2、不影响免疫反应的平衡条件。3、不受分离操作时的环境因素(如pH、温度等)的影响。4、操作简便，分离试剂的来源丰富且价廉。目前的分离方法有：1、非特异性分离法(1)吸附法：利用表面活性物质将反应的液中小分子游离部分F吸附，通过离心，将F沉淀，使大分子结合物B留在上清液中，而达到分离的目的。(2)过滤法：反应液中B与F混合物在通过一定规格孔径的滤膜时，大分子不会通过滤膜孔被阻留在滤膜上，小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离。(3)沉淀法。2、特异性分离法 (1)双抗法(Ab2法)：应用抗IgG的第二抗体来分离B和F的方法称为双抗体法。 双抗体法具有特异、高效、非特异性结合低、重复性好等优点。在使用此法时，往往加入适量的第一抗体同种动物血清作载体。同时第二抗体必须是过量(但也不宜过大)，且以不影响反应平衡为宜. (2)固相分离法：将特性抗体(第一或第二抗体)或抗原结合在固相物质。 (3)金黄色葡萄球菌A蛋白分离法。二、掌握放射免疫分析的设计方法：(一)标讥抗原和抗体用量最佳化设计。1、标记抗原用量选择。2、抗血清的使用滴度选择及其方法。(二)标准抗原剂量设计1、标准抗原剂量范围2、标准曲线工作范围(三)加样顺序设计(四)反应介质(五)反应容积与温度及时间 1、反应容积 缩小反应容积可相应减少抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度，使反应试剂消耗减少。 2、温育温度和时间 抗原、抗体结合反应的平衡结合常数K与温度有关必须通过实验来确定最佳工作条件。(六)B与F分离方法选择(七)样品采集与保存第四节第四节 放射免疫分析的质量控制放射免疫分析的质量控制一、掌握误差和放射免疫误差的来源 (一)误差及其分类 (二)放射免疫分析误差来源二、掌握质量控制与质控样品 (一)放射免疫分析的质量控制内容 (二)质量控制样品三、掌握质量控制指标：灵敏度、精密度、偏倚和准确度、特异性、稳定性、临床有效性。四、掌握实验室内部质量控制：精密度的评价、批内偏倚的评价和批间重现性评价。五、掌握实验室间的外部质量评价。