第十三章第十三章 高效液高效液相色谱法相色谱法HPLCHPLC分析化学分析化学(下，第三版下，第三版)高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法主要内容主要内容一、概述一、概述二、基本理论及条件选择二、基本理论及条件选择三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法四、影响分离的因素四、影响分离的因素五、高效液相色谱仪五、高效液相色谱仪六、超效液相色谱技术简介六、超效液相色谱技术简介七、七、HPLC定量分析方法学考察定量分析方法学考察八、八、HPLC应用应用第一节第一节 概述概述 一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别二、二、HPLC与与GC差别差别三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图四、特点四、特点一、一、HPLCHPLC与经典与经典LCLC区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典经典LC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测二、二、HPLCHPLC与与GCGC差别差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测高聚物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品，：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%续前2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3进样装置进样装置4色谱柱色谱柱分离分离5检测器检测器分析分析6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7记录装置记录装置续前续前四、四、HPLCHPLC的特点和应用的特点和应用 “三高三高” “一快一快” “一广一广” 高柱效高柱效n=104片片/米，柱效高（远高于一般米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高灵敏度高选择性高选择性分析速度快分析速度快应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%有机化合物）有机化合物）第二节第二节 基本理论和条件选择基本理论和条件选择一、塔板理论一、塔板理论平衡理论平衡理论 二、速率理论二、速率理论 Vander方程方程 三、三、HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择一、塔板理论一、塔板理论二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC对比）对比） 1.续前2）涡流扩散项及其影响）涡流扩散项及其影响 nextnext2.讨论：讨论： 1）流动相流速对）流动相流速对HPLC板高的影响（与板高的影响（与GC对比）对比）nextnext图示backback续前3）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响 图示三、三、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇，1ml/min 3. 柱温的选择：柱温的选择： 选室温选室温250C左右左右第三节第三节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPC）一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂 1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异中心能力的差异 分离前提：分离前提：K不等或不等或k不等不等续前2固定相：与固定相：与LC比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（17% 17% 分配色谱分配色谱 硅胶失活硅胶失活载体载体 吸附的水吸附的水固定液固定液二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLCLLC）1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液固定液极性极性NLLCNLLC 固定液固定液非极性非极性RLLCRLLC3正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 固定相极性固定相极性 底剂底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂） 例：水例：水 + + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF续前4流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，k，组分，组分tR5反相洗脱反相洗脱：强度因子：强度因子S，见，见P291表表13-5。水的洗脱。水的洗脱 能力为能力为0。6. 出柱顺序：极性大的组分先出柱出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱7适用：非极性适用：非极性中等极性组分（中等极性组分（HPLC80%问题）问题）（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同流动相：极性小（同LSC） 底剂底剂 + 有机极性调节剂有机极性调节剂 例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿- -甲醇，氯仿甲醇，氯仿- -乙醇乙醇续前4流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，组分，组分tR，k5正相洗脱正相洗脱：溶剂的洗脱能力主要参考极性参数：溶剂的洗脱能力主要参考极性参数P（见（见P290 表表13-3）。）。6. 出柱顺序：结构相近组分，出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱极性大的组分后出柱6适用：适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等（四）离子对色谱和离子抑制色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（ion-pair chromatography） 2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱 (ion-press chromatography)1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（IPC或或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加与其中的反离子形成中性离子对，增加k和和tR，以改善分离，以改善分离1）离子对试剂：）离子对试剂：烷基磺酸钠烷基磺酸钠分析碱分析碱 四丁基季胺盐四丁基季胺盐分析酸分析酸2）影响）影响k的因素的因素a与与m的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）b与与R的链长有关：的链长有关：R长，极性长，极性小，小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制值，抑制组分解离，增加其组分解离，增加其k和和tR，以达到改善分离的目的，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关值有关选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及pH值值 酸性物质酸性物质加入酸加入酸HAc tR，k 碱性物质碱性物质加入碱加入碱NH3H2O tR，k 调节调节pH范围：范围：3.08.0 pH8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 pH3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；弱酸；pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物分离类型选择分离类型选择 第四节第四节 影响分离的因素影响分离的因素一、分离度一、分离度 二、流动相二、流动相三、洗脱方式三、洗脱方式1 1续前2对流动相的要求：对流动相的要求：1）与固定液不反应）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的最理想的3）与检测器匹配：）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气续前 3洗脱方式洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱2）梯度洗脱：）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似GC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）图示第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪HPLC HPLC 仪器示意图仪器示意图HPLCHPLC的基本流程图的基本流程图流动相 泵色谱柱检测器 泵液分离 检测 记录进样阀进样1泵泵： 恒压泵：流量精度不稳恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用恒流泵：常用2进样装置进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）进样室） GC系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期） 2）阀进样：不必停泵，六通阀）阀进样：不必停泵，六通阀 开始分析开始分析开始分析开始分析 废废液液样样品品 淋洗液淋洗液 至分离柱至分离柱进样阀进样阀 样样品品 装装装装样样样样 废废液液 淋洗液淋洗液至分离柱至分离柱 六通六通阀（）（）（）（） 样样品品环环续前3色谱柱色谱柱：直径：直径46mm,柱长柱长1030cm 柱效评价：色谱系统适应性试验柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子）（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4检测器检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器）电化学检测器 5）化学发光）化学发光 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第六节第六节 超效液相色谱技术简介超效液相色谱技术简介（UPLC）原有原有HPLC分析需要分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要至少需要65分钟才能完成分钟才能完成 LC/MS联用可容纳联用可容纳600个色谱峰个色谱峰第七节第七节 HPLCHPLC定量分析方法学考察定量分析方法学考察n准确度（回收率实验）准确度（回收率实验）n精密度（重复性实验）精密度（重复性实验）n检出限（检出限（3 S/N）n定量限（定量限（10 S/N）n线性范围线性范围 （2个数量级）个数量级）n色谱系统适用性实验色谱系统适用性实验u柱效（理论塔板数）柱效（理论塔板数）u分离度分离度u重复性重复性u拖尾因子拖尾因子第八节第八节 HPLCHPLC的应用的应用 药物分析药物分析食品分析食品分析环境分析环境分析农药分析农药分析例题例题在反相色谱中，若以甲醇在反相色谱中，若以甲醇-水为流动相，适水为流动相，适当增加甲醇的比例时，组分的容量因子和当增加甲醇的比例时，组分的容量因子和保留时间的变化为（保留时间的变化为（ ）。）。A 样品的样品的k降低，降低，tR降低降低 B 样品的样品的k增加，增加，tR增加增加C 样品的样品的k增加，增加，tR降低降低D 样品的样品的k降低，降低，tR增加增加例题例题在正相色谱中，若适当增大流动相极性，在正相色谱中，若适当增大流动相极性，则（则（ ）。）。A 样品的样品的k降低，降低，tR降低降低 B 样品的样品的k增加，增加，tR增加增加C 相邻组分的相邻组分的 增加增加 D 对对 基本无影响基本无影响例题例题HPLC中的最佳流速中的最佳流速uH与与GC中的最佳流速中的最佳流速uG比较结果是（比较结果是（ ）A uHuGB uHuGC uH=uG例题例题用用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的办法是（想使容量因子适当增加，较好的办法是（ ）。）。A 增加流动相中甲醇的比例增加流动相中甲醇的比例 B 增加流动相中的水的比例增加流动相中的水的比例C 流动相中加人少量流动相中加人少量HAc D 流动相中加人少量的氨水流动相中加人少量的氨水例题例题在液相色谱中，常用作固定相又可用作键在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（合相基体的物质是（ ）。）。A 分子筛分子筛 B 硅胶硅胶 C 氧化铝氧化铝 D 活性炭活性炭 例题例题水在下述（）中洗脱能力最弱（作为底剂）水在下述（）中洗脱能力最弱（作为底剂）A 正相色谱法正相色谱法B 反相色谱法反相色谱法C 吸附色谱法吸附色谱法D 空间排阻色谱法空间排阻色谱法例题例题键合相的键合基团的碳链长度增加后（）键合相的键合基团的碳链长度增加后（）A 极性减小极性减小B 极性增大极性增大C 载样量增大载样量增大D 载样量减小载样量减小例题例题在分配色谱法及化学键合相色谱法中，选在分配色谱法及化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）同），以改善分离度，主要是（）A 提高分配系数比提高分配系数比B 容量因子增大容量因子增大C 保留时间增长保留时间增长D 色谱柱柱效提高色谱柱柱效提高例题例题二极管阵列检测器与一般分光光度计的主二极管阵列检测器与一般分光光度计的主要差别是（）要差别是（）A 不需光谱扫描即可获得样品每个组分的不需光谱扫描即可获得样品每个组分的 吸收光谱吸收光谱B 服从服从Lambert-Beer定律定律C 复光照射样品，而后再分光复光照射样品，而后再分光D 信号弱，需要累加信号弱，需要累加例题例题内标对比法与内标一点法的区别是（）内标对比法与内标一点法的区别是（）A 不需要加内标物不需要加内标物B 不需要校正因子不需要校正因子C 进样量不要准确进样量不要准确例题例题用反相用反相HPLC测定样品中的芦丁含量，选对氨基苯甲酸为测定样品中的芦丁含量，选对氨基苯甲酸为内标。方法如下：内标。方法如下： 准确配制准确配制1 mg/mL浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲酸对照溶液，精取芦丁对照溶液酸对照溶液，精取芦丁对照溶液2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL，分别置于，分别置于25 mL容量瓶容量瓶中，同时各加入内标溶液中，同时各加入内标溶液2.00 mL，定容。各进样，定容。各进样3次，次，进样量为进样量为10L。得芦丁色谱峰面积和内标物峰面积之。得芦丁色谱峰面积和内标物峰面积之比的平均值分别为比的平均值分别为1.43、2.86、4.29、5.37和和7.16。精称。精称样品样品0.2070 g，溶解，定容于，溶解，定容于100 mL容量瓶中。精取容量瓶中。精取10.00 mL于于25 mL容量瓶中，同时加入内标溶液容量瓶中，同时加入内标溶液2.00 mL，定容。进样量为，定容。进样量为10L， 3次进样得芦丁色谱峰面次进样得芦丁色谱峰面积与内标物峰面积之比的平均值为积与内标物峰面积之比的平均值为5.10，计算样品中芦，计算样品中芦丁的含量。丁的含量。本章小结：本章小结：1、掌握高效液相色谱的速率理论表达式，并、掌握高效液相色谱的速率理论表达式，并比较与比较与GC的异同；的异同；2、掌握液液分配色谱中化学键合相的特点及、掌握液液分配色谱中化学键合相的特点及分类；分类；3、掌握、掌握HPLC仪器组成和主要部件的特点；仪器组成和主要部件的特点；4、熟悉、熟悉HPLC的常用分析模式及色谱条件；的常用分析模式及色谱条件；5、 熟悉熟悉HPLC中分离度的影响因素式及分析中分离度的影响因素式及分析条件的选择条件的选择习题与思考题习题与思考题n思考题思考题P306307 1、2、3、4、5、7、8。n习题习题P307 1、2、3、5、6。