第二章菌种的第二章菌种的选育保育保存和复存和复苏第一节第一节 菌种的分离菌种的分离一、菌种的来源一、菌种的来源l根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或菌种保藏部门索取或购买；或菌种保藏部门索取或购买；l从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 l新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。l实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌，也也必必须重新进行分离纯化。须重新进行分离纯化。 l有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。理先进的设备与之配合。l从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选选育育的的重重要要和和基础的步骤。基础的步骤。l到到目目前前为为止止，还还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。个试样中所包含的所有微生物总数和种类。l在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以以与与各各种种不不同同类类型型的的生生长长和和代代谢谢之之微生物相适应。微生物相适应。l因因此此，建建立立一一更更为为科科学学的的和和针针对对性性不不强强的的分分离离方方法是必要的。法是必要的。 二、分离思路二、分离思路 （一）成功的分离培养方法（一）成功的分离培养方法(1)(1)认真考虑所需产品的特征和生产过程；认真考虑所需产品的特征和生产过程；(2)(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。（二）培养分离中要解决的问题（二）培养分离中要解决的问题1 1、“分离什么和从哪里分离出分离什么和从哪里分离出?” ?” 2 2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生 长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定 性及遗传操作的难易程度等。性及遗传操作的难易程度等。3 3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。、选择适宜的培养分离方法和检测方法。（三）将生态学方法用于培养分离的（三）将生态学方法用于培养分离的一般思路要点一般思路要点1 1、罗列出所要分离的微生物类群；、罗列出所要分离的微生物类群；2 2、根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分、根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分 离的微生物之生态系统或栖息地：离的微生物之生态系统或栖息地：3 3、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各 部，土壤部，土壤( (类型和土层类型和土层) )、岩石、水、昆虫和发、岩石、水、昆虫和发 酵食品等；酵食品等；4 4、罗列出所要考察和测量的环境参数，如、罗列出所要考察和测量的环境参数，如pHpH、盐、盐 分、水分、氧化还原电势及温度等；分、水分、氧化还原电势及温度等；5 5、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤 中的几丁质、葡萄表皮的果胶；中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6 6、根据上述、根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然 浸出汁和培养条件；浸出汁和培养条件；7 7、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8 8、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9 9、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选 意义的微生物类群。意义的微生物类群。l定定方方案案：首首先先要要查查阅阅资资料料，了了解解所所需需菌菌种种的的生生长长培养特性。培养特性。l采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。l增增殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培条条件件，使使所所需需菌菌种增殖培养后，在数量上占优势。种增殖培养后，在数量上占优势。l分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。l发发酵酵性性能能测测定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长和发酵最适温度、最适长和发酵最适温度、最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤 （一）采样（一）采样1 1、采样对象、采样对象 以以采采集集土土壤壤为为主主。一一般般园园田田土土和和耕耕作作过过的的沼沼泽泽土土中中，以以细细菌菌和和放放线线菌菌为为主主，富富含含碳碳水水化化合合物物的的土土壤壤和和沼沼泽泽地地中中，酵酵母母和和霉霉菌菌较较多多，如如一一些些野野果果生生长长区区和和果果园园内内。采采样样的的对对象象也也可可以以是植物，腐败物品，某些水域等。是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选2、采样季节：、采样季节： 以温度适中，雨量不多的秋初为好。以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：、采土方式： 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地 面面5-15cm处的土约处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、 环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的 数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回， 以便及时分离。以便及时分离。（二）增殖培养（二）增殖培养 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培养基，选择一定的培养条件来控制。培养基，选择一定的培养条件来控制。 例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对对下下阶阶段段的纯种分离就会顺利得多。的纯种分离就会顺利得多。 厌厌氧氧或或好好氧氧、酸酸碱碱度度的的选选择择、特特殊殊的的生生理理特特性、添加特殊的抑制剂性、添加特殊的抑制剂（三）培养分离（三）培养分离 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点，好好一一点点。纯纯种种分分离离的的方方法法有有划划线线分分离离法法、稀稀释释分分离离法法。（四）筛（四）筛 选选l 这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求得适合于工业生产用菌种。求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验（五）毒性试验l 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生生物物作作为为食食用用，均均需需通通过过两两年年以以上上的的毒毒性试验。性试验。 ( (一一一一) )采样和采集方法采样和采集方法采样和采集方法采样和采集方法l为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。l样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑塑料料袋袋和塑料瓶等。和塑料瓶等。四、实例四、实例自然界中细菌的分离自然界中细菌的分离采样的注意事项采样的注意事项1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；等；4 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于存于44下，但贮存时间不宜过长。这是因为下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。化，微生物群体之间就会出现消长。1土样采集方法土样采集方法l森森林林、旱旱地地，草草地地可可先先掘掘洞洞，由由土土壤壤下下层层向向上上层层顺序采集；顺序采集；l水水田田等等浸浸水水土土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆圆筒筒采采集集。如如果果层层次次要要求求不不严严格格，可可取取离离地地面面5 515cm15cm处处的的土土。将将采采集集到到的的土土样样盛盛入入聚聚乙乙烯烯袋袋或或玻玻璃瓶中。璃瓶中。l在在采采集集植植物物根根际际土土样样时时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部残留的土，这部分上却为根际土样。部残留的土，这部分上却为根际土样。2 2植物体采集方法植物体采集方法l在在采采集集叶叶面面时时，一一般般是是用用灭灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜鲜叶叶片片的的同同一一部部位位切切取取一一小块，并注意不要损伤周围边缘。小块，并注意不要损伤周围边缘。l选选择择叶叶面面时时应应考考虑虑叶叶位位、叶叶龄龄、叶叶片片正正反反面面和和在在一片叶上的取样部位。一片叶上的取样部位。l采采集集植植物物根根及及根根系系时时，方方法法与与根根际际土土样样采采集集方方法法相相似似。将将洗洗净净的的根根装装入入采采样样袋袋中中，采采集集根根系系时时，一般与根际土样一起保存。一般与根际土样一起保存。 3水样采集方法水样采集方法l用用于于细细菌菌检检测测的的水水样样应应收收集集于于100m1100m1干干净净、灭灭菌菌的的广口塑料瓶中。广口塑料瓶中。l由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静水层中采集水样。静水层中采集水样。l方方法法是是：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水样样进进入入。如如果果有有急急流流存存在在的的话话，应应直直接接将将瓶瓶口口反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时时应应迅迅速速并并带带有有较较大大的的弧弧度度。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。所所有有水水样样都都应应在在24h24h之之内内迅迅速速进进行行检检测测，或者或者44下贮存。下贮存。(二二)生态学参数及培养基生态学参数及培养基的组成原则的组成原则1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2 2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言，部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部部分分培培养养基基中中则则应应含含有有多多种种碳碳、氮氮源源，如如几丁质、纤维素或果胶。几丁质、纤维素或果胶。3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂( (如放线如放线菌酮和制霉素菌酮和制霉素) )，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50g50gm1m1， 以抑制真菌的生长。以抑制真菌的生长。4 4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l、2 2天。天。5 5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分也应调及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。节到与试样的生态系统参数值相近。（三）土中细菌的富集培养与分离（三）土中细菌的富集培养与分离l 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。行富集。l但但对对某某些些少少数数细细菌菌则则要要求求特特殊殊的的富富集集或或选选择择技技术才能很好地被分离培养。术才能很好地被分离培养。富集方法富集方法l运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。集技术。l富集可以促进抗性的产生并维持下来。富集可以促进抗性的产生并维持下来。l土样中细菌的富集：适度稀释后，取土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m10.1m1涂布已涂布已添加及未添加富集底物添加及未添加富集底物( (如几丁质、纤维素等如几丁质、纤维素等) )的的土浸出汁平板。土浸出汁平板。l植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取适度培养取样，洗涤，取1ml1ml经适度稀释后涂布平经适度稀释后涂布平板。板。l水中细菌的分离：水样通过水中细菌的分离：水样通过0.22m0.22m无菌滤膜，取无菌滤膜，取出滤膜用出滤膜用1ml1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释样本稀释液适度稀释, ,涂布平板倒置培养或滤纸压涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。印分离法。水中细菌分离的简易富集技术水中细菌分离的简易富集技术l在在无无菌菌的的、用用棉棉团团塞塞好好的的广广口口三三角角烧烧瓶瓶中中连连续续培培养养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；l在在不不同同水水体体的的水水样样中中加加入入一一定定的的底底物物如如蔗蔗糖糖、多多糖糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。l培培养养过过程程中中可可加加入入低低浓浓度度的的抗抗真真菌菌剂剂以以抑抑制制真真菌菌的的生长。生长。l另另一一富富集集方方法法是是在在培培养养烧烧瓶瓶中中添添加加细细菌菌“附附着着材材料料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。，如无菌的植物组织或土壤浸出液。l通通过过改改变变培培养养温温度度和和培培养养周周期期可可选选择择性性富富集集嗜嗜冷冷性性细菌、中温菌和嗜高温菌。细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤次代培养及纯化步骤l涂涂布布的的平平板板经经培培养养后后，如如生生长长出出菌菌落落，则则按按涂涂布布不不同同稀稀释释度度的的稀稀释释液液所所得得的的单单菌菌菌菌落落和和多多菌菌菌菌落落对琼脂平板进行分类。对琼脂平板进行分类。l用用无无菌菌牙牙签签将将菌菌落落转转接接到到筛筛选选平平板板上上及及转转接接至至添添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。l筛筛选选平平板板经经培培养养后后，按按生生长长出出菌菌落落的的形形态态学学特特征征如色素、菌落形态等进行最初分组。如色素、菌落形态等进行最初分组。l将将认认为为有有希希望望的的菌菌落落用用牙牙签签转转接接到到另另一一模模拟拟分分离离琼脂平板上进行筛选。琼脂平板上进行筛选。生产选种生产选种 在在长长年年累累月月的的生生产产实实践践中中，在在培培养养工工艺艺条条件件没没有有任任何何可可见见变变更更情情况况下下，突突然然发发现现某某些些批批次次生生产产水水平平提提高高较较大大，这这就就有有可可能能是是个个别别自自然然变变异异朝朝更更好好的的方方向向变变的的细细胞胞，在在这这种种条条件件下下很很适适应应于于培培养养条条件件，并并逐逐渐渐显显示示出出它它的的生生长长优优势势，这这种种优优势势的的发发展展，促促使使它它优优良良的的生生产产性性能能表表露露。进进行行类类似似新新种种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。第二节第二节 工业菌种的育种方针工业菌种的育种方针工业菌种的育种：工业菌种的育种： 是是运运用用遗遗传传学学原原理理和和技技术术对对某某个个用用于于特特定定生生物物技技术术目目的的的的菌菌株株进进行行的的多多方方位位的的改改造造。通通过过改改造造，可可使使现现存存的的优优良良性性状状强强化化，或或去去除除不不良性质或增加新的性状。良性质或增加新的性状。工业菌种育种的方法工业菌种育种的方法l诱变诱变l基因转移基因转移l基因重组基因重组育种过程育种过程包括下列包括下列3 3个步骤：个步骤： (1) (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的 引入。引入。 (2) (2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。 (3) (3)改良菌种的评价改良菌种的评价( (包括实验规模和工业生产包括实验规模和工业生产 规模规模) )。选择育种方法时综合考虑的因素选择育种方法时综合考虑的因素(1)(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系待改良性状的本质及与发酵工艺的关系( (如批式如批式 或连续发酵试验或连续发酵试验) )；(2)(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的 明了程度；明了程度；(3)(3)经济费用。经济费用。l如如果果对对特特定定菌菌种种的的基基本本性性状状及及其其工工艺艺知知晓晓甚甚少少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：l如如果果对对其其遗遗传传及及生生物物化化学学方方面面的的性性状状已已有有较较深深的的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。工业菌种改良方法工业菌种改良方法(1)(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加 特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力 来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出 新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)(2)增加前体物的浓度。增加前体物的浓度。(3)(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对对高高浓浓度度的的有有潜潜在在毒毒性性的的底底物物、前前体体或或产产品的耐受力。品的耐受力。(4)(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。 (5)(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品 的结构类似物抗性。的结构类似物抗性。 提高特定基因的表达水平提高特定基因的表达水平l引引入入强强转转录录及及翻翻译译信信号号，可可通通过过在在一一高高效效表表达达载载体体上上克克隆隆靶靶基基因因；在在靶靶基基因因的的上上游游引引入入强强启启动动子子；修修改改现现有有表表达达信信号号，提提高高基基因因效效力等。力等。l诱导解除基因表达抑制的突变。诱导解除基因表达抑制的突变。 改进菌种的生长效率改进菌种的生长效率l通过确定并改变代谢中的耗能部分通过确定并改变代谢中的耗能部分; ;l由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。l赋赋予予菌菌种种对对多多种种底底物物，特特别别是是价价廉廉而而丰丰富富的的底底物的利用能力，由此可降低操作费用。物的利用能力，由此可降低操作费用。提高菌株对底物的利用率方法：提高菌株对底物的利用率方法：第三节第三节营养缺陷型的选育营养缺陷型的选育l营营养养缺缺陷陷型型是是指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的缺缺乏乏合合成成某某些些营营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分才才能正常生长的变异株。能正常生长的变异株。l与营养缺陷型对应的是野生型。与营养缺陷型对应的是野生型。一、基本概念一、基本概念l能能满满足足野野生生型型菌菌株株正正常常生生长长的的培培养养基基称称基基本本培培养基养基(MM)(MM)；l在在基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分的的称称补补充充培养基培养基(SM)(SM)；l能能满满足足各各种种营营养养缺缺陷陷型型生生长长的的称称完完全全培培养养基基(CM)(CM)，如如牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基、麦麦芽芽汁汁培培养养基基等。等。二、营养缺陷型的用途二、营养缺陷型的用途 营营养养缺缺陷陷型型在在生生产产上上和和科科学学研研究究上上用用途途很很大大。目目前前生生产产氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸的的菌菌种种都都是是各各种种类类型型的的缺缺陷陷型型。要要研研究究代代谢谢途途径径，育育种种技技术术都都必必须须有营养缺陷型的菌株为材料。有营养缺陷型的菌株为材料。三、筛选营养缺陷型的步骤三、筛选营养缺陷型的步骤l出发菌株的选择出发菌株的选择l处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备l淘汰野生型淘汰野生型l检出缺陷型检出缺陷型l确定生长谱确定生长谱(一一)出发菌株的选择出发菌株的选择1 1、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。敏感，容易达到好的效果。2 2、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。相像，也是良好的出发菌株。3 3、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。次诱变能积累较多的提高。4 4、出发菌株开始时可以同时选、出发菌株开始时可以同时选2 23 3株，在处理株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5 5、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状 大部分是隐性的，特别是高产基因。大部分是隐性的，特别是高产基因。 6 6、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处 理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有 的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期 的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。 (二二)处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备 这这一一步步骤骤的的关关键键是是制制备备单单细细胞胞和和单单孢孢子子状状态态的的、活活力力类类似似的的菌菌悬悬液液，为为此此要要进进行行合合适适培培养养基基的的培养，并要离心，洗涤，过滤。培养，并要离心，洗涤，过滤。（三）诱变方法（三）诱变方法l物理诱变物理诱变l化学诱变化学诱变 根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。对象的实际，设计诱变处理方案。（四）淘汰野生型（四）淘汰野生型l抗抗生生素素法法：野野生生型型能能在在MMMM中中生生长长，而而缺缺陷陷型型不不能能，于于是是将将诱诱变变处处理理液液在在MMMM中中培培养养短短时时让让野野生生型型生生长长，处处于于活活化化阶阶段段，而而缺缺陷陷型型无无法法生生长长，仍仍处处于于休休眠眠状状态态。由由于于细细菌菌或或酵酵母母对对一一些些抗抗生生素素敏敏感感，于于是是就就相相应应加加入入一一定定量量的的抗抗生生素素，结结果果活活化化状状态态的的野野生生型型就就被被杀杀死死，保保存存了了缺缺陷陷型型。一一般般细细菌菌可可以以采采用用青青霉霉素素，酵酵母母可可采采用用制制霉霉菌菌素。素。l菌菌丝丝过过滤滤法法：对对于于霉霉菌菌，因因孢孢子子生生长长后后会会长长出出菌菌丝丝体体，就就可可用用滤滤纸纸过过滤滤法法将将菌菌丝丝滤滤去去，而而缺缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 （五）检出缺陷型（五）检出缺陷型l原原理理：在在固固体体基基本本培培养养基基和和完完全全培培养养基基上上，生生长长情情况况完完全全不不同同，缺缺陷陷型型在在CMCM上上生生长长良良好好，而而在在MMMM上则不生长，野生型都能生长。上则不生长，野生型都能生长。 l具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法 1 1、将一较平且直径小于、将一较平且直径小于1cm1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的金属圆筒蒙上一层灭菌 的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2 2、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻 一压，使之成为印模，标记方位。一压，使之成为印模，标记方位。3 3、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的 同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。 1、影印法、影印法4 4、将、将CMCM和和MMMM在恒温箱中培养。在恒温箱中培养。5 5、二平皿相同方位进行比较，即可发现在、二平皿相同方位进行比较，即可发现在MMMM平平 皿上长出的菌落少于皿上长出的菌落少于CMCM平板上的。平板上的。MMMM上未长上未长 而相应于而相应于CMCM上长出的那几个菌落就可能是缺上长出的那几个菌落就可能是缺 陷型。陷型。 此此法法要要求求平平皿皿上上菌菌落落不不能能太太多多，菌菌落落之之间间应应有有一定间隔。一定间隔。 2、点种法、点种法l也就是任意法。也就是任意法。l用用接接种种针针或或牙牙签签将将CMCM上上长长出出的的菌菌落落在在MMMM和和CMCM两两副副平平板板上上接接种种，依依次次在在相相应应位位置置点点种种，然然后后一一起培养，观察其生长情况。起培养，观察其生长情况。l此法结果明确，但工作量大。此法结果明确，但工作量大。 3、夹层法、夹层法l先先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MMMM，凝凝固固后后再再倒倒一一薄薄层层MMMM琼琼脂脂培培养养基基，培培养养24h24h，将将出出现现的的菌菌落落标标记记，然然后后倒倒上上一一层层CMCM琼琼脂脂培培养养基基，再再培培养养。这这时时第第二二批批长出的菌落就可能是缺陷型。长出的菌落就可能是缺陷型。l此此法法缺缺点点是是，结结果果有有时时不不明明确确，而而且且将将缺缺陷陷型型菌落从夹层中挑出并不很容易。菌落从夹层中挑出并不很容易。四、营养缺陷型生长谱的确定四、营养缺陷型生长谱的确定 验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷因子，即生长谱测定。因子，即生长谱测定。生长谱测定的方法生长谱测定的方法 将将缺缺陷陷型型菌菌株株培培养养后后，收收集集菌菌体体，制制备备成成细细胞胞悬悬液液，与与MMMM培培养养基基( (融融化化并并凉凉至至50)50)混混合合并并倾倾注注平平皿皿。待待凝凝固固后后，分分别别在在平平皿皿的的5 56 6个个区区间间放放上上不不同同的的营营养养组组合合的的混混合合物物或或吸吸饱饱此此组组合合营营养养物物的的滤滤纸纸圆圆片片。培培养养后后会会在在某某组组合合区区长长出出，就就可可测测得所需营养。得所需营养。个平皿测一个菌。个平皿测一个菌。 以以不不同同组组合合的的营营养养混混合合物物与与融融化化凉凉至至5050的的MMMM培培养养基基混混合合铺铺成成平平皿皿，然然后后在在这这些些平平皿皿上上划划线线接接种种各各个个缺缺陷陷型型菌菌株株于于各各相相应应位位置置，培培养养后后根根据据在在这这些些组组合合长长出出可可推推知知其其营营养养因因子子。在在5 56 6个平皿上可测个平皿上可测2020株菌以上。株菌以上。第四节第四节基因育种基因育种 1 1、基因重组育种：、基因重组育种： 运运用用体体外外DNADNA各各种种操操作作或或修修改改手手法法获获得得目目的的基基因因，再再借借助助于于病病毒毒、细细菌菌质质粒粒或或其其他他载载体体，将将目目的的基基因因转转移移至至新新的的宿宿主主细细胞胞并并使使其其在在新新的的宿宿主主细细胞胞系系统统内内进进行行复复制制和和表表达达，或或者者通通过过细细胞胞间间的的相相互互作作用用，使使一一个个细细胞胞的的优优秀秀性性状状经经其其间遗传物质的交换而转移给另间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。个细胞的方法。2、一个完整的基因克隆过程包括以下、一个完整的基因克隆过程包括以下步骤步骤、获得待克隆的、获得待克隆的DNADNA片段（基因）；片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、目的基因与载体在体外连接；、重组、重组DNADNA分子导入宿主细胞；分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。、重组子的扩增与或表达。基因重组基因重组载体宿主系统载体宿主系统 载体载体(vector)(vector)： 是是携携带带外外源源DNADNA进进入入宿宿主主细细胞胞进进行行扩扩增增和和表表达达的的DNADNA；一一般般是是通通过过改改造造质质粒粒、噬噬菌菌体体或或病病毒毒等构建的。等构建的。载体应具备以下条件：载体应具备以下条件：、能在适当的宿主细胞中复制；、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆 位点）以便外源位点）以便外源DNADNA插入；插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载 体体DNADNA与宿主与宿主DNADNA便于分离；便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应 的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元 件。件。宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、不存在特异的内切酶体系降解外源、不存在特异的内切酶体系降解外源DNADNA；、在重组、在重组DNADNA增殖过程中，不会对它进行修饰；增殖过程中，不会对它进行修饰；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、容易导入重组、容易导入重组DNADNA分子；分子；、符合重组、符合重组DNADNA操作的安全标准。操作的安全标准。第五节第五节杂交育种杂交育种 一、细菌杂交一、细菌杂交l在在细细菌菌中中实实现现杂杂交交的的种种类类尚尚不不多多，主主要要是是大大肠肠杆杆菌菌，其其他他还还有有鼠鼠伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌、淋病奈氏球菌等。淋病奈氏球菌等。l大大肠肠杆杆菌菌中中存存着着致致育育因因子子F F，有有F F因因子子为为F+F+，没没有有F F因子称因子称F-F-。lF F因因子子存存在在于于细细胞胞中中形形式式：游游离离状状态态(F+(F+细细胞胞) )；整整合合状状态态，即即F F因因子子插插入入胞胞核核质质的的一一定定位位置置上上(Hfr(Hfr细胞细胞) )。lF F因因子子有有明明显显的的感感染染性性，大大肠肠杆杆菌菌的的接接合合，实实质质上上是是F F因因子子的的转转移移，所所以以F+F+和和HfrHfr称称供供体体菌菌，而而F-F-称受体菌。称受体菌。二、酵母杂交育种技术二、酵母杂交育种技术 1 1、酵母繁殖方式、酵母繁殖方式 酵酵母母为为单单细细胞胞型型真真菌菌，一一般般以以出出芽芽方方式式生生殖殖，在在通通常常情情况况下下，繁繁殖殖体体为为双双倍倍体体，但但经经过过特特定定条条件件的的诱诱导导，可可使使其其产产生生单单倍倍体体孢孢子子并并可可出出芽芽产产生生单单倍倍体繁殖体。体繁殖体。l单单倍倍体体细细胞胞具具及及22两两种种交交配配型型。两两种种交交配配型型细细胞胞经经其其细细胞胞壁壁上上特特定定的的凝凝聚聚因因子子诱诱导导而而进进行行交交配配，恢恢复复为为双双倍倍体体；同同一一交交配配型型细细胞胞之之间间，则则因因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。l在在生生活活过过程程中中，酵酵母母细细胞胞还还可可以以形形成成三三倍倍体体、四四倍体、多倍体或非整倍体细胞。倍体、多倍体或非整倍体细胞。 2 2、酵母杂交、酵母杂交 一一般般而而言言，杂杂交交育育种种运运用用了了酵酵母母的的单单双双倍倍生生活活周周期期，将将不不同同基基因因型型和和相相对对的的交交配配型型的的单单倍倍体体细细胞胞经经诱诱导导杂杂交交而而形形成成二二倍倍体体细细胞胞，经经筛筛选便可获得新的遗传性状。选便可获得新的遗传性状。 酵酵母母的的杂杂交交方方法法有有孢孢子子杂杂交交法法、群群体体交交配配法法、单单倍倍体体细细胞胞杂杂交交法法和和罕罕见见交交配配法法。就就啤啤酒酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。第六节第六节原生质体育种原生质体育种l原原生生质质体体育育种种技技术术主主要要有有原原生生质质体体融融合合、原原生生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。l原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。l原原生生质质体体融融合合作作为为一一种种新新的的基基因因重重组组手手段段是是19781978年年第第三三届届国国际际工工业业微微生生物物遗遗传传学学讨讨论论会会上上提出来的。提出来的。 一、原生质体融合育种的特点一、原生质体融合育种的特点1 1、杂交频率较高：、杂交频率较高： 细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形 的原生质体。的原生质体。2 2、受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任、受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任 何一株都可能起受体或供体的作用，因此有何一株都可能起受体或供体的作用，因此有 利于不同种属间微生物的杂交。利于不同种属间微生物的杂交。3 3、遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二、遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二 亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一 的过程。的过程。4 4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合 子的可能性。子的可能性。5 5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。6 6、提高菌株产量的潜力较大。、提高菌株产量的潜力较大。7 7、有助于建立工业微生物转化体系。、有助于建立工业微生物转化体系。二、原生质体融合育种步骤二、原生质体融合育种步骤1 1、标记菌株的筛选和稳定性验证。、标记菌株的筛选和稳定性验证。2 2、原生质体制备。、原生质体制备。3 3、等量原生质体加聚乙二醇促进融合。、等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4 4、涂布于再生培养基，再生出菌落。、涂布于再生培养基，再生出菌落。5 5、选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取、选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取 融合子进一步试验、保藏。融合子进一步试验、保藏。6 6、生产性能筛选。、生产性能筛选。 三、原生质体融合育种的要点三、原生质体融合育种的要点 1 1、标记菌种的选择、标记菌种的选择 获获得得标标记记菌菌种种的的方方法法是是采采用用常常规规诱诱变变育育种种，筛筛选选出出营营养养缺缺陷陷型型或或和和抗抗药药性性菌菌株株。这这里里最最重要的是标记必须稳定。重要的是标记必须稳定。 采采用用抗抗药药性性菌菌株株除除可可作作标标记记外外，在在实实验验室室中中还还可可排排除除杂杂菌菌污污染染的的干干扰扰。为为的的是是确确证证融融合合的成功，可以采用多标记菌种。的成功，可以采用多标记菌种。2、原生质体的制备原生质体的制备 原原生生质质体体的的制制备备主主要要是是在在高高渗渗压压溶溶液液中中加加入入细细胞胞壁壁分分解解酶酶，将将细细胞胞壁壁分分离离剥剥离离，结结果果剩剩下下由由原原生生质质膜膜包包住住的的类类似似球球状状的的细细胞胞，它它保保持持原细胞的一切活性。原细胞的一切活性。 在在放放线线菌菌和和细细菌菌中中，制制备备原原生生质质体体主主要要采采用用溶溶菌菌酶酶；酵酵母母和和霉霉菌菌一一般般可可用用蜗蜗牛牛酶酶或或纤纤维维素素酶等。酶等。 四、影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素1 1、菌体的前处理、菌体的前处理 为为了了使使酶酶作作用用的的效效果果好好一一些些，可可将将菌菌作作一一些些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2 2、菌体的培养时间、菌体的培养时间 为为了了使使细细胞胞易易于于原原生生质质体体化化，一一般般选选择择增增殖殖期的菌体。期的菌体。3 3、酶浓度、酶浓度 对对于于不不同同种种属属的的微微生生物物，不不仅仅对对酶酶的的种种类类要要求求不不同同，就就是是对对酶酶的的浓浓度度也也有有差差异异。另另外外，最最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。4 4、酶处理温度、酶处理温度 5 5、破壁时的、破壁时的pHpH值值6 6、渗透压稳定剂、渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和蔗糖等有机物和KClKCl和和NaClNaCl等无机物。等无机物。第七节第七节工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术 在在生生产产发发酵酵中中，具具有有高高产产有有重重要要经经济济价价值值的的某某一一期期待待代代谢谢产产物物主主能能力力的的微微生生物物菌菌种种的的保保存存和和长长期期保保藏藏，对对于于一一成成功功的的工工业业发发酵酵过过程程极极为重要。为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)(1)经长期保藏后菌种存活健在；经长期保藏后菌种存活健在；(2)(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特保证高产突变株不改变表型和基因型，特 别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生 产的高产能力。产的高产能力。(3) (3) 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术1 1、冷冻干燥或真空干燥保藏；、冷冻干燥或真空干燥保藏；2 2、超低温或在液氮中冷冻保藏；、超低温或在液氮中冷冻保藏； 3 3、转接培养或斜面传代保藏；、转接培养或斜面传代保藏；4 4、土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。、土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。一、冷冻保藏一、冷冻保藏 l冷冷冻冻保保藏藏为为保保藏藏微微生生物物菌菌种种的的最最简简单单而而有有效效的的方法。方法。l通通过过冷冷冻冻，使使微微生生物物代代谢谢活活动动停停止止。一一般般而而言言，冷冷冻冻温温度度愈愈低低，效效果果愈愈好好。为为了了获获得得满满意意的的冷冷冻冻结结果果，通通常常应应在在培培养养物物中中加加入入一一定定的的冷冷冻冻保保护护剂剂。冷冷冻冻保保藏藏时时温温度度要要求求在在-20-20以以下下，同同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。l冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类 一、普通冷冻保藏技术一、普通冷冻保藏技术(-20)(-20)二、超低温冷冻保藏技术二、超低温冷冻保藏技术(-60(-60一一-80)-80)三、液氮冷冻保藏技术三、液氮冷冻保藏技术 普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20)(-20)l将将液液体体培培养养物物或或从从琼琼脂脂斜斜面面培培养养物物收收获获的的细细胞胞分分接接到到试试管管或或指指管管肉肉，然然后后贮贮藏藏于于一一冰冰箱箱的的冷冷藏藏室室中中，或或于于温温度度范范围围在在-5-5-20-20的的普普通通冰冰箱箱(-20)(-20)中中。或或者者，将将菌菌种种培培养养在在小小的的试试管管或或培培养养瓶瓶斜斜面面上上，待待生生长长适适度度后后，将将试试管管或或瓶瓶口口用用橡橡胶胶塞塞严严格格封封好好，同同上置于冰箱中保存。上置于冰箱中保存。l用此方法可以维持若干微生物的活力用此方法可以维持若干微生物的活力1212年。年。l应应注注意意的的是是经经过过一一次次解解冻冻的的菌菌株株培培养养物物不不宜宜再再用来保藏。用来保藏。l保保藏藏过过程程中中应应注注意意控控制制保保藏藏温温度度，培培养养瓶瓶或或试试管应严格密封。管应严格密封。l这这一一方方法法虽虽简简便便易易行行，但但不不适适宜宜多多数数微微生生物物的的长期保藏。长期保藏。超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术(-60(-60一一-80)-80) 要要求求长长期期保保藏藏的的微微生生物物菌菌种种，一一般般都都要要求求在在- -6060以下进行保藏。以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3 3加入等体积的加入等体积的2020甘油或甘油或1010二甲亚砜；二甲亚砜； 4 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70-70超低超低 温冰箱中保藏。温冰箱中保藏。 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含1010甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在温冰箱的冷冻速度一般控制在1-21-2minmin。若。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5 5年年而活力不受影响。而活力不受影响。液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术 ( (一一) )冷冻保护剂冷冻保护剂 在在液液氮氮冷冷冻冻保保藏藏中中，最最常常用用的的冷冷冻冻保保护护剂剂是是二二甲甲亚亚砜砜和和甘甘油油，最最终终使使用用浓浓度度一一般般为为甘甘油油1010、二二甲甲亚亚砜砜5 5。所所使使用用的的甘甘油油般般用用高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌，而而二二甲甲亚亚砜砜最最好好为为过过滤滤灭灭菌。菌。 ( (二二) )液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1 1、待冷冻保藏菌种悬液的制备、待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1) (1)从生长斜面制备菌悬液：从生长斜面制备菌悬液： 每一斜面加入每一斜面加入5ml5ml含含1010甘油的营养液体培养；甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.50.5lmllml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶， (2)(2)从浸没培养物制备菌悬液：从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积在浸没培养液中加入等体积20%20%无菌甘油；无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；需先用玻璃珠打散；0.5-lml0.5-lml分装玻璃安瓿或液分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于将所有封好的安瓿置于55冰箱中冰箱中3min3min，以使细，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。胞和悬浮培养基之间达到平衡。 2 2、控速冷冻、控速冷冻 (1) (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于 一较大的金属容器中；一较大的金属容器中； (2) (2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； (3) (3)以以1-2/min1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到的致冷速度降温，直到温度达到 相对温度之上几度的细胞冻结点相对温度之上几度的细胞冻结点( (通常为通常为- - 30) 30)； (4) (4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点 时尽可能快地发生相变；时尽可能快地发生相变；(5)(5)细胞冻结后，将致冷速度降为细胞冻结后，将致冷速度降为1/min1/min，直到，直到 温度达温度达-50-50；(6)(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)(-)96)或或 气相气相(-156)(-156)中保存。中保存。 如如果果无无控控速速冷冷冻冻机机，则则一一般般可可将将安安瓿瓿或或液液氮氮瓶瓶置置于于一一7070冰冰箱箱中中冷冷冻冻4h4h，然然后后迅迅速速移移入入液液氮氮罐中保存。罐中保存。( (三三) )复苏复苏 1 1、从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中。、从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中。 2 2、迅速将安瓿置于、迅速将安瓿置于37-4037-40水浴中，并轻轻摇动水浴中，并轻轻摇动 以加速解；以加速解； 3 3、用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有、用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有 2m1 2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管 反复抽吸数次，然后取反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (0.1-0.2ml (约约4 4、8 8滴滴) ) 转接入琼脂斜面上。转接入琼脂斜面上。二、二、冻干保藏冻干保藏 l 冷冷冻冻干干燥燥的的基基本本方方法法：是是通通过过在在减减压压条条件件下下使使冻冻结结的的细细胞胞悬悬液液中中的的水水分分升升华华，使使培培养养物物干干燥燥。此此法法是是微微生生物物菌菌种种长长期期保保藏藏的的最最为为有有效效的的方法之一。方法之一。l冷冷冻冻干干燥燥过过程程中中必必须须使使用用冷冷冻冻保保护护剂剂，目目前前国国内内常常用用脱脱脂脂乳乳和和蔗蔗糖糖，国国外外尚尚有有运运用用动动物物血血清清等的。等的。l大大部部分分微微生生物物菌菌种种可可以以在在冻冻干干状状态态下下保保藏藏1010年年之之久久而而不不丧丧失失活活力力。而而且且经经冻冻干干后后的的菌菌株株无无需需进行冷冻保藏，便于运输。进行冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程培养物的冻干过程( (二二) )操作步骤操作步骤1 1启启动动冷冷冻冻干干燥燥器器的的致致冷冷单单元元。当当冷冷凝凝器器的的温温度度达达到到-40-40时时启启动动真真空空泵泵，使使真真空空度度达达到到2.672.674.00Pa4.00Pa。2 2将将冷冷冻冻槽槽置置于于歧歧管管之之下下方方。槽槽中中装装入入2 23 3体体积积的的异异丙丙醇醇，然然后后插插入入温温度度计计及及可可调调温温控控仪仪降降温温探探头头打打开开降降温温探探头头控控制制醇醇浴浴温温度度在在-40-40，这这过过程程约约需需30min30min。3 3每每支支斜斜面面加加入入2ml 2ml 2020的的脱脱脂脂乳乳，然然后后用用巴巴氏氏吸吸管管将将斜斜面面上上的的菌菌苔苔吹吹打打下下制制成成孢孢子子或或菌菌体体均均悬悬液液，最最终终菌菌株株浓浓度度一一般般要要求求在在106CFU106CFUm1m1用用细细菌菌浸浸没没培培养养物物来来保保藏藏时时，加加入入4040的的脱脱脂脂乳乳，混混合合制制成成含含106CFU106CFUmlml的均悬液。的均悬液。4 4取取下下安安瓿瓿上上的的棉棉塞塞，然然后后用用lmllml移移液液管管分分装装安安瓿瓿(0.2ml(0.2ml瓿瓿) )，重新塞好棉塞。，重新塞好棉塞。5 5轻轻轻轻振振荡荡安安瓿瓿，以以使使细细胞胞重重新新悬悬浮浮。将将安安瓿瓿与与歧歧管管相相联联后后迅迅速速置置于于醇醇浴浴中中，然然后后调调节节温温控控装置。使细胞悬液迅速冻结。装置。使细胞悬液迅速冻结。6 615min15min后，将歧管与真空泵相通。后，将歧管与真空泵相通。7 7维维持持-40-40的的醇醇浴浴温温度度90-120min90-120min，然然后后调调节节温温控装置。使醇浴温度上升至控装置。使醇浴温度上升至-10-10，维持，维持2h2h。8 8关关掉掉可可调调温温控控装装置置的的降降温温探探头头，让让醇醇浴浴温温度度上上升至室温升至室温(25)(25)9 9在在冷冷冻冻干干燥燥的的最最初初4h4h内内应应定定期期测测真真空空度度，在在安安瓿瓿置置于于真真空空下下后后1h1h内内，真真空空度度必必须须达达到到13.33Pa13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.672.674.0Pa4.0Pa。10 10 在在真真空空状状态态下下，让让安安瓿瓿保保存存在在冷冷冻冻干干燥燥机机 中至少中至少16h16h以获得完全干燥。以获得完全干燥。1111干燥后，在干燥后，在2.672.674.00Pa4.00Pa的真空度下封瓶的真空度下封瓶1212在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。在所有安瓿都封盖好后，撤去真空。1313关闭真空泵。关闭真空泵。1414关闭冷凝器。关闭冷凝器。三、冻干菌种的保藏与再生三、冻干菌种的保藏与再生1 1、保藏：、保藏： 冷冷冻冻干干燥燥后后的的培培养养物物在在低低于于55下下保保藏藏。较较低低的的保保藏藏温温度度(-20(-20-70)-70)对对于于培培养养物物的的长长期期稳稳定更好。定更好。2 2、复苏：、复苏：(1)(1)在超净工作台中用在超净工作台中用7070酒精棉球擦洗安瓿，然酒精棉球擦洗安瓿，然 后用砂轮在安瓿中锉一道沟。后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰 开安瓿开安瓿(3)(3)在安瓿中加入在安瓿中加入0.50.51ml1ml营养液体培养基，慢慢营养液体培养基，慢慢 旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到 一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种 琼脂斜面或涂布平板。琼脂斜面或涂布平板。(4)(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此 直接振落入盛有直接振落入盛有l l2ml2ml液体培养基的试管中，液体培养基的试管中， 轻轻振荡轻轻振荡5 5l0minl0min，然后用此悬液接种适宜的，然后用此悬液接种适宜的 再生培养基。再生培养基。四、其他保藏方法四、其他保藏方法一、传代保藏一、传代保藏 二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏 一、传代保藏一、传代保藏l将将菌菌种种定定期期在在新新鲜鲜琼琼脂脂培培养养基基上上传传代代，然然后后在在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。l可用于实验室中若干菌种的保藏。可用于实验室中若干菌种的保藏。l此此法法最最为为简简单单和和经经济济，且且不不要要求求任任何何特特殊殊的的设设备。备。l但但此此方方法法易易发发生生培培养养基基干干枯枯、菌菌体体自自溶溶、基基因因突变。突变。l因因此此要要求求在在基基本本培培养养基基上上传传代代为为好好，目目的的是是能能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。l斜斜面面培培养养物物应应在在密密闭闭容容器器中中于于55保保藏藏，以以防防止培养基脱水并能降低代谢活性。止培养基脱水并能降低代谢活性。l此此方方法法一一般般不不适适宜宜作作工工业业生生产产菌菌种种的的长长期期保保藏藏方法。方法。二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏l将将琼琼脂脂斜斜面面或或液液体体培培养养物物浸浸入入矿矿物物油油中中于于室室温下保藏，此方法简便有效。温下保藏，此方法简便有效。l可可用用于于丝丝状状真真菌菌、酵酵母母、细细菌菌和和放放线线菌菌的的保保藏藏。特特别别对对难难于于冷冷冻冻干干燥燥的的丝丝状状真真菌菌和和难难以以在在固固体体培培养养基基上上形形成成孢孢子子的的担担子子菌菌等等的的保保藏藏更为有效。更为有效。l浸浸没没保保藏藏的的操操作作要要点点是是首首先先让让待待保保藏藏菌菌种种在在适适宜宜的的培培养养基基上上生生长长，然然后后注注入入经经170170下下灭灭菌菌1-2h1-2h的的矿物油，矿物油的用量以高出培养物矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm1cm为宜。为宜。l以以液液体体石石蜡蜡作作为为保保藏藏方方法法时时，应应对对需需保保藏藏的的菌菌株株预预先先作作试试验验。因因为为某某些些菌菌株株在在液液体体石石蜡蜡下下生生长长还还十十分分明明显显，有有些些菌菌株株如如某某些些假假丝丝酵酵母母还还会会同同化化液液体体石石蜡蜡，也也有有的的对对液液体体石石蜡蜡保保藏藏敏敏感感。所所有有这这些些菌菌株株都都不不能能用用液液体体石石蜡蜡保保藏藏。为为了了预预防防不不测测，一一般保藏株般保藏株2 23 3年也应做一次存活试验。年也应做一次存活试验。方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价斜面冰箱保藏低温各大类3 6月简便液体石蜡保藏室温、缺氧 各大类（斜面或半固体穿刺培养12年简便载体保藏干燥、无营养产芽孢和孢子的微生物1-10年简便、效果好液体保藏适当媒液酵母菌、霉菌、放线菌1-5年简便冷冻干燥保藏干燥、无氧、低温、有保护剂各大类5-15年要有设备、高效液氮保藏-196 ，有保护剂从病毒到各类细胞20年以上 要有设备、高效微生物保藏方法比较微生物保藏方法比较五、五、基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏l由由载载体体质质粒粒等等携携带带的的外外源源DNADNA片片段段通通常常是是遗遗传传不不稳稳定定的的、且且很很易易丢丢失失其其外外源源质质粒粒复复制制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。l一一般般情情况况下下当当细细胞胞丢丢失失这这些些质质粒粒时时，生生长长速度会加快。速度会加快。l当当培培养养基基中中加加入入抗抗生生素素时时，抗抗生生素素提提供供了了一一有有利利于于携携带带质质粒粒的的细细胞胞群群体体的的极极有有用用的的生生长长选选择择压压。而而且且在在运运用用基基因因工工程程菌菌进进行行发发酵酵时时，抗抗生生素素的的加加入入可可帮帮助助维维持持质质粒粒复复制制与与染染色色体体复复制制的的协调。协调。l 我我们们建建议议基基因因工工程程菌菌应应保保藏藏在在含含低低浓浓度度选选择择剂的培养基中。剂的培养基中。六、六、微生物活力和稳定性测定微生物活力和稳定性测定 l所所有有保保藏藏菌菌种种的的方方法法都都必必须须是是长长期期可可靠靠地地保保持持菌种的优良性状不变。菌种的优良性状不变。l在在保保藏藏时时定定期期检检测测菌菌种种活活力力，以以确确定定保保藏藏培培养养物物的的保保藏藏期期限限和和保保藏藏方方法法的的可可靠靠性性，以以及及确确定定在在实实际际保保藏藏过过程程中中出出现现的的细细胞胞死死亡亡程程度度和和遗遗传传稳定性。稳定性。l对对工工业业微微生生物物生生产产菌菌种种来来说说，建建议议保保藏藏菌菌种种的的形形态态学学和和生生化化特特征征( (如如代代谢谢产产物物的的产产生生、酶酶活活力力、遗遗传传特特征征及及生生化化指指标标) )应应在在保保藏藏后后加加以以检检测和确定。测和确定。l加加速速保保藏藏试试验验可可用用于于预预测测保保藏藏过过程程中中保保藏藏培培养养物物的的稳稳定定性性。在在一一给给定定温温度度下下通通过过对对高高温温下下短短期期活活力力丧丧失失程程度度检检测测，可可以以用用来来预预测测嗜嗜酸酸乳乳杆杆菌的稳定性。菌的稳定性。 l成成功功的的菌菌种种长长期期保保藏藏方方法法之之有有价价值值的的指指标标包包括括在在保保藏藏6 6个个月月、1 1年年或或更更长长时时间间后后存存活活百百分分率率( (或或存存活活单单位位) )。细细胞胞群群体体的的形形态态学学特特征征或或一一些些特特别别的的生生化化特特征征应应在在菌菌种种保保藏藏前前后后保保持持同同一一性性，以以及及实实验验室室中中、中中试试车车间间中中和和生生产产发发酵酵中中产产品品滴度的稳定性，后者极为重要。滴度的稳定性，后者极为重要。谢谢观赏谢谢观赏