酵母基因工程酵母基因工程酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统利用重组酵母生产乙肝疫苗利用重组酵母生产乙肝疫苗1996完成第一个真核生物完成第一个真核生物-酿酒酵母全基因组测序。酿酒酵母全基因组测序。1974Clarck-Walker和和Miklos发现在多数酿酒酵母发现在多数酿酒酵母中存在质粒。中存在质粒。1978Hinnen将来自一株酿酒酵母的将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，的缺陷，标志着酵母表达系统建立。标志着酵母表达系统建立。1981Hitzeman用酿酒酵母成功表达人用酿酒酵母成功表达人IFN。1983我国首次用酵母菌表达我国首次用酵母菌表达HBVHBsAg基因。基因。（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵酵酵酵母母母母菌菌菌菌(Yeast)(Yeast)是是是是一一一一群群群群以以以以芽芽芽芽殖殖殖殖或或或或裂裂裂裂殖殖殖殖方方方方式式式式进行无性繁殖的单细胞真核生物。进行无性繁殖的单细胞真核生物。进行无性繁殖的单细胞真核生物。进行无性繁殖的单细胞真核生物。 如如果果说说E.coli是是外外源源基基因因最最成成熟熟的的原原核核生生物物表表达达系系统统，Yeast则则是是最最成成熟熟的真核生物表达系统的真核生物表达系统。酵母菌表达外源基因的优势：酵母菌表达外源基因的优势：酵母菌表达外源基因的优势：酵母菌表达外源基因的优势：全全全全基基基基因因因因组组组组测测测测序序序序，基基基基因因因因表表表表达达达达调调调调控控控控机机机机理理理理清清清清楚楚楚楚，遗遗遗遗传传传传操作简便。操作简便。操作简便。操作简便。具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。大规模发酵工艺简单、成本低廉。大规模发酵工艺简单、成本低廉。大规模发酵工艺简单、成本低廉。大规模发酵工艺简单、成本低廉。不不不不含含含含特特特特异异异异性性性性病病病病毒毒毒毒、不不不不产产产产毒毒毒毒素素素素，被被被被美美美美国国国国FDAFDA认认认认定定定定为为为为安全的基因工程受体系统。安全的基因工程受体系统。安全的基因工程受体系统。安全的基因工程受体系统。能将外源基因表达产物分泌至培养基中。能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 表达产物的糖基化位点和结构特点表达产物的糖基化位点和结构特点表达产物的糖基化位点和结构特点表达产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距。与高等真核生物有差距。与高等真核生物有差距。与高等真核生物有差距。酵母菌表达外源基因的缺点：酵母菌表达外源基因的缺点：酵母菌表达外源基因的缺点：酵母菌表达外源基因的缺点：（二）酵母菌的宿主系统（二）酵母菌的宿主系统（二）酵母菌的宿主系统（二）酵母菌的宿主系统用作模式真核生物的酵母宿主菌用作模式真核生物的酵母宿主菌用作模式真核生物的酵母宿主菌用作模式真核生物的酵母宿主菌用于外源基因表达的酵母宿主菌用于外源基因表达的酵母宿主菌用于外源基因表达的酵母宿主菌用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌1 1、用作模式真核生物的酵母宿主菌、用作模式真核生物的酵母宿主菌、用作模式真核生物的酵母宿主菌、用作模式真核生物的酵母宿主菌基因表达调控机理与高等真核类似。基因表达调控机理与高等真核类似。基因表达调控机理与高等真核类似。基因表达调控机理与高等真核类似。酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母( (Saccharomyces cereviasiaeSaccharomyces cereviasiae) )：无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物；真核生物；真核生物；真核生物；繁殖方式与原核类似，易于操作；繁殖方式与原核类似，易于操作；繁殖方式与原核类似，易于操作；繁殖方式与原核类似，易于操作；酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母( (Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae) )：最成熟的真核细胞表达系统；最成熟的真核细胞表达系统；最成熟的真核细胞表达系统；最成熟的真核细胞表达系统；表达水平低；表达水平低；表达水平低；表达水平低；产物过度糖基化。产物过度糖基化。产物过度糖基化。产物过度糖基化。2、用于外源基因表达的酵母宿主菌、用于外源基因表达的酵母宿主菌巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母 ( (Pichia pastoris)Pichia pastoris)多形汉逊酵母多形汉逊酵母多形汉逊酵母多形汉逊酵母 ( (Hansenula polymorpha)Hansenula polymorpha)甲醇酵母：甲醇酵母：甲醇酵母：甲醇酵母：可利用甲醇作为唯一碳源；可利用甲醇作为唯一碳源；可利用甲醇作为唯一碳源；可利用甲醇作为唯一碳源；表达水平高；表达水平高；表达水平高；表达水平高；产物糖基化更合理。产物糖基化更合理。产物糖基化更合理。产物糖基化更合理。特点：特点：特点：特点：乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母( (Kluyveromyces lactisKluyveromyces lactis) )非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母( (Schizosaccharomyces pombe)Schizosaccharomyces pombe)其它酵母：其它酵母：其它酵母：其它酵母： 已有已有已有已有6060多种酵母菌建立了转化系统。多种酵母菌建立了转化系统。多种酵母菌建立了转化系统。多种酵母菌建立了转化系统。酿酒酵母的遗传学和分子生物学酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母表达表达外源基因最理想。外源基因最理想。3、提高外源蛋白表达产率的突变宿主菌、提高外源蛋白表达产率的突变宿主菌能提高外源基因表达或分泌的突变类型能提高外源基因表达或分泌的突变类型改善外源蛋白分泌改善外源蛋白分泌提高外源基因表达提高外源基因表达提高外源基因表达提高外源基因表达提高外源基因表达提高外源基因表达改善外源蛋白分泌改善外源蛋白分泌提高外源基因表达提高外源基因表达突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点ssc1 ssc2 rgr1ose1ssc11 rho钙离子依赖型钙离子依赖型ATP酶酶转录后加工转录后加工转录水平转录水平转录水平转录水平羧肽酶羧肽酶Y转录水平转录水平如如：rho突变株突变株中人溶菌酶表达量提高中人溶菌酶表达量提高10倍。倍。4、抑制超糖基化的突变宿主菌、抑制超糖基化的突变宿主菌措施：措施：构建超糖基化缺陷突变株。构建超糖基化缺陷突变株。酵酵母母菌菌普普遍遍拥拥有有蛋蛋白白质质糖糖基基化化系系统统，但但野野生生型型酵酵母母菌菌对对外外源源蛋蛋白白的的糖糖基基化化反反应应很难控制，呈很难控制，呈超糖基化超糖基化倾向。倾向。抑制超糖基化的突变类型抑制超糖基化的突变类型mnn 甘露糖生物合成缺陷甘露糖生物合成缺陷alg Asn侧链糖基化缺陷侧链糖基化缺陷och 外侧糖链添加缺陷外侧糖链添加缺陷突变类型突变类型生物效应生物效应如：如：人人 1-抗胰蛋白酶、人抗胰蛋白酶、人tPA在酿酒酵母在酿酒酵母mnn9和和och1突变株中高活性表达。突变株中高活性表达。5、减少泛素依赖型蛋白降解的突变宿主菌、减少泛素依赖型蛋白降解的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用HOOC泛素泛素76aaLys靶蛋白靶蛋白Lys靶蛋白靶蛋白泛素连接酶泛素连接酶E3Lys靶蛋白靶蛋白泛素连接酶泛素连接酶E3蛋白蛋白酶体酶体靶蛋白降解靶蛋白降解泛素释放泛素释放酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：UBIUBI11编码泛素编码泛素编码泛素编码泛素- -羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252 对数生长期表达对数生长期表达对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭稳定期关闭稳定期关闭UBIUBI22编码泛素编码泛素编码泛素编码泛素- -羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252 对数生长期表达对数生长期表达对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭稳定期关闭稳定期关闭UBIUBI33编码泛素编码泛素编码泛素编码泛素- -羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白7676 对数生长期表达对数生长期表达对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭稳定期关闭稳定期关闭UBIUBI44编码泛素五聚体编码泛素五聚体编码泛素五聚体编码泛素五聚体对数生长期关闭对数生长期关闭对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达稳定期表达稳定期表达酵母菌有酵母菌有酵母菌有酵母菌有4 4个泛素编码基因个泛素编码基因个泛素编码基因个泛素编码基因：酵母菌有酵母菌有酵母菌有酵母菌有7 7个泛素连接酶基因个泛素连接酶基因个泛素连接酶基因个泛素连接酶基因：UBCUBC1 1、UBCUBC2 2、UBCUBC3 3、UBCUBC4 4、UBCUBC5 5、UBCUBC6 6、UBCUBC7 7泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母UBI4缺陷型：缺陷型：在在酿酿酒酒酵酵母母菌菌中中，泛泛素素主主要要由由UBI4基基因因表达。表达。UBI4突突变变株株能能正正常常生生长长，但但细细胞胞内内游游离离泛泛素素分分子子的的浓浓度度比比野野生生株株低低得得多多，是是外外源源基基因表达的理想受体。因表达的理想受体。UBAUBA1 1缺陷型：缺陷型：缺陷型：缺陷型： UBA1编编码码泛泛素素激激活活酶酶E1，是是一一种种看看家基因。家基因。UBA1突突变变株株是是致致死死性性的的，但但其其等等位位基基因因缺缺陷陷是是非非致致死死性性的的，且且能能削削弱弱泛泛素素介介导的蛋白降解。导的蛋白降解。UBC4-UBC5双突变型：双突变型： UBC4-UBC5双双突突变变型型能能大大幅幅度度削削弱弱泛泛素介导的蛋白降解。素介导的蛋白降解。7个个泛泛素素连连接接酶酶基基因因的的突突变变对对衰衰减减蛋蛋白白降解作用同样有效。降解作用同样有效。6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌l酿酒酵母具有酿酒酵母具有20多种蛋白酶多种蛋白酶l空泡蛋白酶基因空泡蛋白酶基因PEP4野生型和野生型和pep4-3突变株突变株B-半乳糖苷酶活性明显升高半乳糖苷酶活性明显升高（三）（三）（三）（三） 酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母附加型质粒（酵母附加型质粒（酵母附加型质粒（酵母附加型质粒（YEpYEp）酵母复制型质粒（酵母复制型质粒（酵母复制型质粒（酵母复制型质粒（YRpYRp）酵母着丝粒质粒（酵母着丝粒质粒（酵母着丝粒质粒（酵母着丝粒质粒（YCp)YCp)酵母人工染色体（酵母人工染色体（酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）酵母整合型质粒（酵母整合型质粒（酵母整合型质粒（酵母整合型质粒（YIpYIp）2 2 质粒（酿酒酵母质粒（酿酒酵母质粒（酿酒酵母质粒（酿酒酵母）人工构建质粒：人工构建质粒：人工构建质粒：人工构建质粒：野生型质粒：野生型质粒：野生型质粒：野生型质粒：除酵母外，其它几种酵母的细胞内也除酵母外，其它几种酵母的细胞内也含有野生型的相似质粒。含有野生型的相似质粒。l结合酵母属：结合酵母属：pSR1、pSB1、pSB2l克鲁维酵母属：克鲁维酵母属：pKD1酿酒酵母中的酿酒酵母中的酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2 环状质粒：环状质粒：环状质粒：环状质粒：RAFRAFREP1REP1STBSTBorioriREP2REP2FLPFLPIRIRIRIRAA野野生生型型，双双链链、环环状状，6318bp，拷贝数，拷贝数50-100。同源重组同源重组同源重组同源重组BBIRsIRs: :反向重复序列，同源重组反向重复序列，同源重组反向重复序列，同源重组反向重复序列，同源重组FLPFLP: :编码产物驱动编码产物驱动编码产物驱动编码产物驱动IRsIRs同源重组同源重组同源重组同源重组REPREP: :编码产物控制质粒稳定性编码产物控制质粒稳定性编码产物控制质粒稳定性编码产物控制质粒稳定性STBSTB:REP:REP结合位点结合位点结合位点结合位点含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；人工构建酵母质粒的共同特点：人工构建酵母质粒的共同特点：人工构建酵母质粒的共同特点：人工构建酵母质粒的共同特点：含有含有含有含有E.coliE.coli质粒复制起点，便于克隆操作；质粒复制起点，便于克隆操作；质粒复制起点，便于克隆操作；质粒复制起点，便于克隆操作；含有在酵母和含有在酵母和含有在酵母和含有在酵母和E.coliE.coli中进行选择的双标记；中进行选择的双标记；中进行选择的双标记；中进行选择的双标记；除除除除YIpYIp型质粒外均为穿梭载体。型质粒外均为穿梭载体。型质粒外均为穿梭载体。型质粒外均为穿梭载体。YEpYEp质粒：质粒：质粒：质粒：复制子：源自复制子：源自复制子：源自复制子：源自2 2 质粒；质粒；质粒；质粒；拷贝数：拷贝数：拷贝数：拷贝数：50-10050-100；不不不不稳稳稳稳定定定定：培培培培养养养养几几几几代代代代后后后后，质质质质粒粒粒粒丢丢丢丢失失失失率率率率高高高高达达达达50-50-70%70%，主主主主要要要要由由由由于于于于分分分分配配配配不均匀所致。不均匀所致。不均匀所致。不均匀所致。YRpYRp质粒：质粒：质粒：质粒：不不不不稳稳稳稳定定定定：培培培培养养养养几几几几代代代代后后后后，质质质质 粒粒粒粒 丢丢丢丢 失失失失 率率率率 高高高高 达达达达 50-50-70%70%，主主主主要要要要由由由由分分分分配配配配不不不不均均均均匀所致。匀所致。匀所致。匀所致。复制子：源自酵母染色体的复制子：源自酵母染色体的复制子：源自酵母染色体的复制子：源自酵母染色体的ARSARS；ARS:autoreplicationsequence拷贝数：拷贝数：拷贝数：拷贝数：50-10050-100；YCpYCp质粒：质粒：质粒：质粒：拷贝数：拷贝数：拷贝数：拷贝数：1-51-5。在在在在YRpYRp中引入中引入中引入中引入CENCEN；CENCEN：着着着着丝丝丝丝粒粒粒粒，源源源源自自自自酵酵酵酵母母母母3 3号号号号染染染染色色色色体体体体，有有有有丝丝丝丝分分分分裂裂裂裂稳稳稳稳定，拷贝数低。定，拷贝数低。定，拷贝数低。定，拷贝数低。复制子：源自酵母染色体复制子：源自酵母染色体复制子：源自酵母染色体复制子：源自酵母染色体 的的的的ARSARS；YACYAC质粒：质粒：质粒：质粒：用于大型基因文库用于大型基因文库用于大型基因文库用于大型基因文库构建。构建。构建。构建。在在在在YCpYCp中引入中引入中引入中引入TELTEL；TELTEL：端端端端粒粒粒粒，酵酵酵酵母母母母染染染染色色色色体体体体末末末末 端端端端 序序序序 列列列列 ， 利利利利 于于于于 线线线线 性性性性DNADNA末端稳定；末端稳定；末端稳定；末端稳定；稳稳稳稳定定定定性性性性随随随随着着着着插插插插入入入入DNADNA片片片片段的增大而增加；段的增大而增加；段的增大而增加；段的增大而增加；YIpYIp质粒：质粒：质粒：质粒：拷贝数：通常为拷贝数：通常为拷贝数：通常为拷贝数：通常为1 1只有只有只有只有E.coliE.coli的复制子；的复制子；的复制子；的复制子；引引引引入入入入酵酵酵酵母母母母基基基基因因因因组组组组的的的的同同同同源源源源序序序序列列列列：以以以以标标标标记记记记基基基基因因因因his3 his3 55和和和和33端作同源序列；端作同源序列；端作同源序列；端作同源序列；载体以同源重组方式，载体以同源重组方式，载体以同源重组方式，载体以同源重组方式，整合整合整合整合入酵母基因组；入酵母基因组；入酵母基因组；入酵母基因组；（四）酵母菌的转化系统（四）酵母菌的转化系统（四）酵母菌的转化系统（四）酵母菌的转化系统转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法原生质体转化法原生质体转化法原生质体转化法原生质体转化法碱金属离子介导转化法碱金属离子介导转化法碱金属离子介导转化法碱金属离子介导转化法电击转化法电击转化法电击转化法电击转化法原生质体转化法原生质体转化法 在在在在CaCa2+2+和和和和PEGPEG存存存存在在在在下下下下，转转转转化化化化子子子子可可可可达达达达原原原原生生生生质质质质体体体体总总总总数的数的数的数的1-2%1-2%。大多数需要标记基因筛选转化子。大多数需要标记基因筛选转化子。大多数需要标记基因筛选转化子。大多数需要标记基因筛选转化子。对线型和环状对线型和环状DNA的吸收没有特异性。的吸收没有特异性。1个个受受体体细细胞胞可可同同时时接接纳纳多多个个质质粒粒分分子子，这这种种共转化共转化的原生质体占的原生质体占转化子总数转化子总数的的25-33%；特点：特点：原生质体转化法的缺点：原生质体转化法的缺点：转化率受原生质再生率的严重制约。转化率受原生质再生率的严重制约。操作周期长；操作周期长；2）碱金属离子介导转化法）碱金属离子介导转化法酵酵母母菌菌完完整整细细胞胞经经碱碱金金属属离离子子(如如Li+)、PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。吸吸收收线线型型DNA的的能能力力明明显显大大于于环环状状DNA，二者相差二者相差80倍。倍。共转化现象极为罕见；共转化现象极为罕见；特点：特点：3）电击转化法）电击转化法适用范围广。适用范围广。酵酵母母菌菌完完整整细细胞胞或或原原生生质质体体可可在在电击下吸收质粒电击下吸收质粒DNA。不使用。不使用PEG。特性：特性：转化率高；转化率高；操作方便；操作方便；转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运1）单单、双双链链DNA均均可可转转化化酵酵母母菌菌，单单链链的的转化率是双链的转化率是双链的10-30倍。倍。2）含含复复制制子子的的单单链链质质粒粒进进入入细细胞胞后后，能能准准确地转化为双链并复制。确地转化为双链并复制。3）不不含含复复制制子子的的单单链链质质粒粒进进入入细细胞胞后后，能能高高效效地地同同源源整整合合入入染染色色体体，这这对对体体内内定定点点突突变酵母基因组极有利。变酵母基因组极有利。4）克克隆隆在在整整合合型型质质粒粒YIp上上的的外外源源基基因因，若若含含受受体体细细胞胞染染色色体体DNA的的同同源源序序列列，会会发发生生高频同源整合，整合子占转化子的高频同源整合，整合子占转化子的50-80%。用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因显性基因显性基因宿主菌：宿主菌：宿主菌：宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变如：如：如：如：LEULEU-、TRPTRP-、HISHIS-、URAURA-营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因载体：载体：载体：载体：携带相应的合成基因携带相应的合成基因携带相应的合成基因携带相应的合成基因如：如：如：如：leu1/leu2leu1/leu2、trp1trp1、his3/his4his3/his4、ura3ura3选择压力：选择压力：选择压力：选择压力：不完全培养基不完全培养基不完全培养基不完全培养基如：如：如：如：YNBYNB、无机盐培养基、无机盐培养基、无机盐培养基、无机盐培养基显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。显性标记基因显性标记基因显性标记基因显性标记基因氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶抗抗抗抗G418G418氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素抗氯霉素抗氯霉素抗氯霉素二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺铜离子螯合物铜离子螯合物铜离子螯合物铜离子螯合物耐受铜离子耐受铜离子耐受铜离子耐受铜离子蔗糖转化酶蔗糖转化酶蔗糖转化酶蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因标记基因标记基因编码产物编码产物编码产物编码产物遗传表型遗传表型遗传表型遗传表型aphcatdhfrcup1suc2ilv2（五）酵母菌的表达系统（五）酵母菌的表达系统（五）酵母菌的表达系统（五）酵母菌的表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统1 1、酿酒酵母表达系统、酿酒酵母表达系统、酿酒酵母表达系统、酿酒酵母表达系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母系统启动子酿酒酵母系统启动子酿酒酵母系统启动子酿酒酵母密码子的偏爱性酿酒酵母密码子的偏爱性酿酒酵母密码子的偏爱性酿酒酵母密码子的偏爱性酿酒酵母分泌系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母表达系统存在的问题1 1）酿酒酵母系统启动子）酿酒酵母系统启动子）酿酒酵母系统启动子）酿酒酵母系统启动子UAS：上游激活序列：上游激活序列TATA盒盒：富含：富含ATURS：上游阻遏序列：上游阻遏序列DAS：下游激活序列：下游激活序列UASURSTATA起始起始位点位点编码序列编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bpDAS甘油醛甘油醛甘油醛甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因( (GAPDHGAPDH) )磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因( (PKGPKG) )乙醇脱氢酶基因乙醇脱氢酶基因乙醇脱氢酶基因乙醇脱氢酶基因( (ADHADH) )酿酒酵母表达系统常用启动子：酿酒酵母表达系统常用启动子：酿酒酵母表达系统常用启动子：酿酒酵母表达系统常用启动子： 糖酵解途径中关键酶的强启动子，受糖酵解途径中关键酶的强启动子，受糖酵解途径中关键酶的强启动子，受糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：葡萄糖诱导：葡萄糖诱导：葡萄糖诱导： 半乳糖激酶启动子半乳糖激酶启动子半乳糖激酶启动子半乳糖激酶启动子( (GAL1)GAL1)野野野野生生生生型型型型GAL4GAL4表表表表达达达达水水水水平平平平低低低低，产产产产物物物物活活活活性性性性可可可可被被被被GLAL80GLAL80产产产产物物物物完全抑制，半乳糖诱导效果差。完全抑制，半乳糖诱导效果差。完全抑制，半乳糖诱导效果差。完全抑制，半乳糖诱导效果差。GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80GAL1GAL1、GAL7GAL7和和和和GAL10GAL10基基基基因因因因连连连连锁锁锁锁在在在在一一一一起起起起，独独独独立立立立转转转转录录录录，共同调控；共同调控；共同调控；共同调控；GAL4GAL4产产产产物物物物与与与与UASUAS结结结结合合合合，促促促促进进进进转转转转录录录录；GAL80GAL80产产产产物物物物抑抑抑抑制制制制GAL4GAL4产物的活性，阻遏转录；产物的活性，阻遏转录；产物的活性，阻遏转录；产物的活性，阻遏转录；半乳糖诱导半乳糖诱导半乳糖诱导半乳糖诱导GAL4GAL4高表达，不受高表达，不受高表达，不受高表达，不受GAL80GAL80产物抑制，产物抑制，产物抑制，产物抑制，激活激活激活激活GAL1GAL1、GAL7GAL7、GAL10GAL10等高效转录。等高效转录。等高效转录。等高效转录。PGAL10GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80将将将将GAL4GAL4的启动子换成的启动子换成的启动子换成的启动子换成GAL10GAL10的诱导型强启动子；的诱导型强启动子；的诱导型强启动子；的诱导型强启动子；PHO5PHO5启动子在培养基磷酸盐耗尽时，启动转录；启动子在培养基磷酸盐耗尽时，启动转录；启动子在培养基磷酸盐耗尽时，启动转录；启动子在培养基磷酸盐耗尽时，启动转录；pho4pho4TS TS 温度敏感，温度敏感，温度敏感，温度敏感，3535时失活，时失活，时失活，时失活，PHO5PHO5关闭；关闭；关闭；关闭；pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子通过启动子通过启动子通过启动子通过降温降温降温降温(23(23) )诱导诱导诱导诱导表达。表达。表达。表达。pho4pho4基因编码产物是基因编码产物是基因编码产物是基因编码产物是PHO5PHO5启动子的正调控因子；启动子的正调控因子；启动子的正调控因子；启动子的正调控因子； pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子启动子启动子启动子严紧控制型启动子严紧控制型启动子 对雄激素具有应答能力的启动子对雄激素具有应答能力的启动子l以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效的将外源基因的表达水平控制在一个合适的范效的将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围内。围内。l雄激素受体表达水平雄激素受体表达水平 、雄激素浓度、雄激素浓度 、重组质粒、重组质粒拷贝数三者之间平衡有效作用于启动子拷贝数三者之间平衡有效作用于启动子l外源基因水平控制在高于基底水平外源基因水平控制在高于基底水平14001400倍范围倍范围2）酵母菌对密码子的偏爱性）酵母菌对密码子的偏爱性甘油醛甘油醛-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶(GAPDH)磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶(PKG)乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶(ADH)在在酿酿酒酒酵酵母母中中，高高丰丰度度蛋蛋白白质质96%以以上上的氨基酸由的氨基酸由25个密码子编码，个密码子编码，如：如：它们对应于异常活跃的高组分它们对应于异常活跃的高组分tRNA,而低而低组分组分tRNA基本上不会被使用。基本上不会被使用。酵母酵母tRNA与外源基因的密码子的不匹配性，与外源基因的密码子的不匹配性，影响了异源影响了异源mRNA的翻译速率，更重要的是的翻译速率，更重要的是降低了降低了mRNA的结构稳定性。的结构稳定性。酵母蛋白质的分泌运输机制酵母蛋白质的分泌运输机制多肽性激素因子：多肽性激素因子：多肽性激素因子：多肽性激素因子：MF-MF- 酸性磷酸酸性磷酸酸性磷酸酸性磷酸酯酶酯酶：PHO5PHO5蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖酶酶：SUC2SUC2杀杀手毒素因子：手毒素因子：手毒素因子：手毒素因子：KILKIL3 3）酿酒酵母分泌系统）酿酒酵母分泌系统）酿酒酵母分泌系统）酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母酿酒酵母信号信号信号信号肽肽特点特点特点特点：保守性低，大多异源宿主系保守性低，大多异源宿主系保守性低，大多异源宿主系保守性低，大多异源宿主系统统的信号的信号的信号的信号肽肽不能互用；不能互用；不能互用；不能互用；信号信号信号信号肽结肽结构：构：构：构：正电荷区正电荷区 疏水区疏水区极性区极性区Met目的蛋白目的蛋白信号肽剪切位点信号肽剪切位点“-3-1规律规律”MF-MF- 信号信号信号信号肽肽：8888个残基个残基个残基个残基组组成。成。成。成。Met目的蛋白目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13编码的二肽酶编码的二肽酶分泌效率高；分泌效率高；分泌效率高；分泌效率高；在酵母系在酵母系在酵母系在酵母系统统具有通用性；具有通用性；具有通用性；具有通用性；u除了信号肽以及其构象特征外，受体细胞除了信号肽以及其构象特征外，受体细胞内信号肽剪酶系的表达水平对异源蛋白的高内信号肽剪酶系的表达水平对异源蛋白的高效分泌也有很大的影响。效分泌也有很大的影响。u异源蛋白的性质不同，信号肽序列的效率异源蛋白的性质不同，信号肽序列的效率也不一样，只有异源蛋白一致的情况下比较也不一样，只有异源蛋白一致的情况下比较信号肽的效率才有意义。信号肽的效率才有意义。对对对对Thr/SerThr/Ser的羟基氧进行糖基化。的羟基氧进行糖基化。的羟基氧进行糖基化。的羟基氧进行糖基化。 4 4）酿酒酵母糖基化系统）酿酒酵母糖基化系统）酿酒酵母糖基化系统）酿酒酵母糖基化系统糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：糖基化位点：AsnAsn天冬酰胺天冬酰胺天冬酰胺天冬酰胺-X-Thr/Ser-X-Thr/Ser（XX代表任何氨基酸）代表任何氨基酸）代表任何氨基酸）代表任何氨基酸） 对对对对AsnAsn的的的的酰酰酰酰胺胺胺胺氮氮氮氮进进进进行行行行糖糖糖糖基基基基化化化化，对对对对蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的折叠、稳定性及活性较重要。折叠、稳定性及活性较重要。折叠、稳定性及活性较重要。折叠、稳定性及活性较重要。N N型糖基化型糖基化型糖基化型糖基化：OO型糖基化型糖基化型糖基化型糖基化： OO型型型型糖糖糖糖链链链链仅仅仅仅由由由由甘甘甘甘露露露露糖糖糖糖组组组组成成成成（哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞的还含唾液酸基团）。的还含唾液酸基团）。的还含唾液酸基团）。的还含唾液酸基团）。酵母菌糖基化特点：酵母菌糖基化特点：酵母菌糖基化特点：酵母菌糖基化特点： N N型型型型或或或或OO型型型型糖糖糖糖基基基基的的的的外外外外链链链链进进进进一一一一步步步步形形形形成成成成庞庞庞庞大大大大的的的的、由由由由甘甘甘甘露露露露糖糖糖糖组组组组成成成成的的的的复复复复杂杂杂杂分分分分支支支支结结结结构构构构，会会会会增增增增加加加加免免免免疫疫疫疫原原原原性、影响活性和药代稳定性。性、影响活性和药代稳定性。性、影响活性和药代稳定性。性、影响活性和药代稳定性。过糖基化：过糖基化：过糖基化：过糖基化：糖链组成：糖链组成：糖链组成：糖链组成：5 5）酿酒酵母表达系统的缺陷）酿酒酵母表达系统的缺陷）酿酒酵母表达系统的缺陷）酿酒酵母表达系统的缺陷不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵。不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵。不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵。不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵。表达载体传代不稳定（表达载体传代不稳定（表达载体传代不稳定（表达载体传代不稳定（YEpYEp、YRpYRp）；）；）；）；所采用的强启动子调控不严谨；所采用的强启动子调控不严谨；所采用的强启动子调控不严谨；所采用的强启动子调控不严谨； 表达水平普遍不高：表达水平普遍不高：表达水平普遍不高：表达水平普遍不高： 表达产物过糖基化。表达产物过糖基化。表达产物过糖基化。表达产物过糖基化。2 2、甲醇酵母表达系统、甲醇酵母表达系统、甲醇酵母表达系统、甲醇酵母表达系统甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母表达系统的优缺点甲醇酵母表达系统的优缺点甲醇酵母表达系统的优缺点甲醇酵母表达系统的优缺点甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母表达系统操作原理甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策1 1）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子甲醇酵母甲醇酵母甲醇酵母甲醇酵母（methylotrophicyeast)methylotrophicyeast)： 可利用甲醇作为单一碳源的一类酵母。可利用甲醇作为单一碳源的一类酵母。可利用甲醇作为单一碳源的一类酵母。可利用甲醇作为单一碳源的一类酵母。巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)多形汉逊酵母多形汉逊酵母（Hansenula ploymorpha)博伊丁假丝酵母博伊丁假丝酵母（Candia boidinii) 毕赤酵母毕赤酵母毕赤酵母毕赤酵母/ /假丝酵母假丝酵母假丝酵母假丝酵母汉逊酵母汉逊酵母汉逊酵母汉逊酵母醇氧化酶醇氧化酶醇氧化酶醇氧化酶甲醇氧化酶甲醇氧化酶甲醇氧化酶甲醇氧化酶alcoholoxidase,AOXalcoholoxidase,AOXmethanoloxidase,MOXmethanoloxidase,MOXAOX1AOX1、AOX2MOXAOX2MOX名称和拷贝数不同。名称和拷贝数不同。名称和拷贝数不同。名称和拷贝数不同。甲醇氧化酶：甲醇氧化酶：甲醇氧化酶：甲醇氧化酶：甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%30%以上；以上；以上；以上；AOX1AOX1占主导地位，负责占主导地位，负责占主导地位，负责占主导地位，负责AOX99%AOX99%以上活性。以上活性。以上活性。以上活性。AOX1与与AOX2：毕毕毕毕赤赤赤赤酵酵酵酵母母母母和和和和假假假假丝丝丝丝酵酵酵酵母母母母基基基基因因因因组组组组中中中中存存存存在在在在2 2个个个个AOXAOX基基基基因：因：因：因：AOX1AOX1、AOX2AOX2；AOX1AOX1与与与与AOX2AOX2基因基因基因基因97%97%同源；同源；同源；同源；甲醇氧化酶启动子：甲醇氧化酶启动子：目前已发现的、最强的真核启动子；目前已发现的、最强的真核启动子；目前已发现的、最强的真核启动子；目前已发现的、最强的真核启动子；AOX1AOX1：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇诱导：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇诱导MOXMOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导严谨调控型启动子：严谨调控型启动子：严谨调控型启动子：严谨调控型启动子：当当甘甘油油被被消消耗耗尽尽时时，加加入入甲甲醇醇，诱诱导导重重组组蛋白的表达。蛋白的表达。毕赤酵母的发酵过程：毕赤酵母的发酵过程：成长期成长期：诱导期诱导期：过渡期过渡期：以甘油为碳源，目的是收获一定的菌量。以甘油为碳源，目的是收获一定的菌量。不不加加碳碳源源，目目的的是是消消耗耗掉掉甘甘油油，解解除除其其对对AOX1启动子的阻遏。启动子的阻遏。优点：优点：AOX1启启动动子子是是目目前前最最强强、调调控控机机理理最最严严格格的的启动子之一，启动子之一，甲醇甲醇可严格调控外源基因表达；可严格调控外源基因表达；2 2）甲醇酵母表达系统的优缺点）甲醇酵母表达系统的优缺点）甲醇酵母表达系统的优缺点）甲醇酵母表达系统的优缺点表达水平高；表达表达水平高；表达HBsAg50倍于酿酒酵母倍于酿酒酵母产物可产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、脂酰化；翻译后修饰：糖基化、磷酸化、脂酰化；实验室和工业操作简单。实验室和工业操作简单。产物可正确折叠和高效分泌；产物可正确折叠和高效分泌；过过糖糖基基化化程程度度比比酿酿酒酒酵酵母母少少（8-15个个vs100-150个甘露糖）；个甘露糖）；可利用简单无机盐培养基高密度发酵；可利用简单无机盐培养基高密度发酵；不能满足结构要求严格的糖基化；不能满足结构要求严格的糖基化；缺点：缺点：载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。（多拷贝整合）（多拷贝整合）3 3）甲醇酵母表达系统操作原理）甲醇酵母表达系统操作原理）甲醇酵母表达系统操作原理）甲醇酵母表达系统操作原理宿主菌株与标记基因宿主菌株与标记基因宿主菌株与标记基因宿主菌株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达载体胞内表达与分泌表达载体胞内表达与分泌表达载体胞内表达与分泌表达载体宿主菌株与标记基因宿主菌株与标记基因宿主菌株与标记基因宿主菌株与标记基因二大宿主系统主要特点二大宿主系统主要特点二大宿主系统主要特点二大宿主系统主要特点毕赤酵母毕赤酵母汉逊酵母汉逊酵母最适温度最适温度3037最适最适pH值值4.54.5甘油阻遏甘油阻遏是是否否糖基化糖基化部分过度部分过度较正常较正常高密度发酵高密度发酵100g/L100g/L二大宿主系统主要选择标记二大宿主系统主要选择标记二大宿主系统主要选择标记二大宿主系统主要选择标记宿主宿主选择标记选择标记毕赤酵母毕赤酵母his4、G418、Zeocin、Cu2+汉逊酵母汉逊酵母leu2、his3、ura3、G418毕赤酵母系统毕赤酵母系统毕赤酵母系统毕赤酵母系统主要宿主菌主要宿主菌主要宿主菌主要宿主菌宿主株宿主株特特点点Y11430野生型、野生型、Mut+GS115his4-、Mut+KM71his4-、aox1:ARG4(AOX1-)、MutsSMD1168his4-、胞外蛋白酶缺陷，高分泌、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003his4-、AOX1-、AOX2-，Mut-MutMut表型与甲醇利用率表型与甲醇利用率表型与甲醇利用率表型与甲醇利用率Mut AOX1基因基因AOX2基因基因表型表型Mut+ 存在存在存在存在正常型正常型Muts缺失缺失存在存在缓慢型缓慢型Mut-缺失缺失缺失缺失负型负型甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件甲醇酵母系统的整合事件YRpYRp型载体：型载体：型载体：型载体： 传传传传代代代代不不不不稳稳稳稳定定定定，传传传传代代代代过过过过程程程程同同同同源源源源或或或或非非非非同同同同源源源源重重重重组组组组，高高高高选选选选择择择择压压压压力力力力迫迫迫迫使使使使高高高高拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数整整整整合合合合，可可可可达达达达100100拷贝。拷贝。拷贝。拷贝。主要为单拷贝整合，主要为单拷贝整合，主要为单拷贝整合，主要为单拷贝整合，1-10%1-10%为多拷贝整合。为多拷贝整合。为多拷贝整合。为多拷贝整合。 YIpYIp型载体：型载体：型载体：型载体：在靶序列处线性化载体在靶序列处线性化载体在靶序列处线性化载体在靶序列处线性化载体DNADNA，诱导同源重组；，诱导同源重组；，诱导同源重组；，诱导同源重组；有两种整合模式：有两种整合模式：有两种整合模式：有两种整合模式：插入插入插入插入、取代取代取代取代；毕赤毕赤毕赤毕赤酵母系统酵母系统酵母系统酵母系统模式模式模式模式表达载体表达载体表达载体表达载体5AOX1启动子片段含启动子片段含AOX1启动子，启动子，在甲醇诱导下可启动外源基因表达；在甲醇诱导下可启动外源基因表达；MCS为外源基因的插入位点；为外源基因的插入位点；信信号号肽肽序序列列使使外外源源蛋蛋白白分分泌泌到到发发酵酵上清中，便于纯化；上清中，便于纯化；TT提供转录终止和提供转录终止和polyA修饰信号；修饰信号；HIS4为营养缺陷型筛选标志，能与为营养缺陷型筛选标志，能与酵母染色体酵母染色体his4基因同源重组；基因同源重组；3AOX1基基因因片片段段能能与与酵酵母母染染色色体体AOX1基因同源重组；基因同源重组；Amp为载体在为载体在E.coli中的筛选标志；中的筛选标志；f1ori为丝状噬菌体的复制起点。为丝状噬菌体的复制起点。 AOX1AOX1位点插入位点插入位点插入位点插入载体的载体的3AOX1区与酵母基因组区与酵母基因组AOX1基因的基因的末端发生整合重组。末端发生整合重组。 His4His4位点插入位点插入位点插入位点插入载体的载体的HIS4区与酵母基因组区与酵母基因组HIS4基因的末端基因的末端发生整合重组。发生整合重组。 多基因插入事件（串联整合）多基因插入事件（串联整合）多基因插入事件（串联整合）多基因插入事件（串联整合） 基因取代（基因取代（基因取代（基因取代（GS115GS115，AOX1AOX1+）甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统胞内表达胞内表达胞内表达胞内表达载体载体载体载体表达载体类型表达载体类型需带入需带入ATG单位点单位点胞内表达与分泌表达载体胞内表达与分泌表达载体甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统胞内表达胞内表达胞内表达胞内表达载体载体载体载体表达载体类型表达载体类型需带入需带入ATG多位点多位点甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达载体载体载体载体信号肽：信号肽：PHO1甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统甲醇酵母系统分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达载体载体载体载体信号肽：信号肽：MF- pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点载体的信号肽序列和多克隆位点4 4）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策载体稳定性载体稳定性载体稳定性载体稳定性基因剂量基因剂量基因剂量基因剂量整合位点整合位点整合位点整合位点甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型mRNA5mRNA5端端端端ATAT含量分泌信号含量分泌信号含量分泌信号含量分泌信号表达产物稳定性表达产物稳定性表达产物稳定性表达产物稳定性 载体稳定性载体稳定性载体稳定性载体稳定性采用采用采用采用YIpYIp型载体型载体型载体型载体: : 更易实现整合、整合位点清楚。更易实现整合、整合位点清楚。更易实现整合、整合位点清楚。更易实现整合、整合位点清楚。同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。YRpYRp型载体的稳定化：型载体的稳定化：型载体的稳定化：型载体的稳定化： 选选选选择择择择- -非非非非选选选选择择择择培培培培养养养养交交交交替替替替数数数数十十十十代代代代可可可可得得得得稳稳稳稳定定定定的的的的整整整整合子，但费时、整合位点不确定。合子，但费时、整合位点不确定。合子，但费时、整合位点不确定。合子，但费时、整合位点不确定。 基因剂量基因剂量基因剂量基因剂量构建高拷贝整合型表达载体。构建高拷贝整合型表达载体。构建高拷贝整合型表达载体。构建高拷贝整合型表达载体。外源基因表达存在基因剂量效应。外源基因表达存在基因剂量效应。外源基因表达存在基因剂量效应。外源基因表达存在基因剂量效应。筛选多拷贝整合子筛选多拷贝整合子筛选多拷贝整合子筛选多拷贝整合子 载载载载体体体体引引引引入入入入G418/ZeocinG418/Zeocin抗抗抗抗性性性性标标标标记记记记，整整整整合合合合子子子子拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数与与与与抗抗抗抗性性性性成成成成正正正正相相相相关关关关，采采采采用用用用高高高高G418/ZeocinG418/Zeocin抗抗抗抗性性性性转化子。转化子。转化子。转化子。体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子；体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子；体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子；体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子；采用采用采用采用YRpYRp型载体稳定化技术，获高拷贝整合子；型载体稳定化技术，获高拷贝整合子；型载体稳定化技术，获高拷贝整合子；型载体稳定化技术，获高拷贝整合子； 整合位点整合位点整合位点整合位点毕毕毕毕赤赤赤赤酵酵酵酵母母母母中中中中个个个个别别别别情情情情况况况况整整整整合合合合于于于于His4His4位位位位点点点点的的的的比比比比AOX1AOX1位点的低。位点的低。位点的低。位点的低。外外外外源源源源基基基基因因因因表表表表达达达达盒盒盒盒整整整整合合合合于于于于AOX/MOXAOX/MOX或或或或标标标标记记记记基因处，均可高效表达；基因处，均可高效表达；基因处，均可高效表达；基因处，均可高效表达； 甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型甲醇利用表型在分泌表达情况下，甲醇利用慢型在分泌表达情况下，甲醇利用慢型（Muts）更利于表达。）更利于表达。 mRNA5mRNA5端端端端应尽量避免在应尽量避免在应尽量避免在应尽量避免在UTRUTR区出现区出现区出现区出现AUGAUG和次级结构。和次级结构。和次级结构。和次级结构。mRNAmRNA55端端端端非非非非翻翻翻翻译译译译区区区区（UTRUTR）的的的的组组组组成成成成与与与与长长长长度度度度应尽量与应尽量与应尽量与应尽量与AOX1/MOXAOX1/MOX的一致；的一致；的一致；的一致； AOX1AOX1基基基基因因因因5-UTR5-UTR长长长长114nt114nt，富富富富含含含含A+UA+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高。其编码的乙醇氧化酶表达量极高。其编码的乙醇氧化酶表达量极高。其编码的乙醇氧化酶表达量极高。 基因序列的基因序列的AT含量含量AT含量越高，越容易出现类似于终止子含量越高，越容易出现类似于终止子的结构。的结构。对对A+T含含量量丰丰富富的的基基因因，最最好好重重新新设设计计序序列列，使使其其(A+T)含含量量在在30-55范范围围内内。这这种种方方法使人血清白蛋白法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高的表达量提高50倍。倍。 分泌信号分泌信号分泌信号分泌信号可可可可采采采采用用用用酿酿酿酿酒酒酒酒酵酵酵酵母母母母来来来来源源源源的的的的MF-MF- 、PHOPHO或或或或SUCSUC等等等等的的的的信信信信号号号号肽肽，或或或或野野野野生生生生型型型型信信信信号号号号肽肽，但但但但要要要要比比比比较较分分分分析适用性。析适用性。析适用性。析适用性。分泌表达效率与所用信号肽密切相关；分泌表达效率与所用信号肽密切相关；分泌表达效率与所用信号肽密切相关；分泌表达效率与所用信号肽密切相关；采用采用蛋白酶缺陷宿主株蛋白酶缺陷宿主株：如如P.pastoris SMD1168。表达产物稳定性表达产物稳定性分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素。分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素。降低培养基降低培养基pH值值：蛋白酶在酸性条件下活性较低。蛋白酶在酸性条件下活性较低。向培养基中向培养基中添加蛋白胨添加蛋白胨或或酪蛋白水解物酪蛋白水解物：竞争性抑制蛋白酶活性。竞争性抑制蛋白酶活性。目目前前，20余余种种重重组组蛋蛋白白在在巴巴斯斯德德毕毕赤赤酵酵母母系系统统中中成成功功表表达达，如如：人人血血清清白白蛋蛋白白(HSA)、乙乙型型肝肝炎炎表表面面抗抗原原(HBsAg)、肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子(TNF)、表皮生长因子、表皮生长因子(EGF)等。等。数数种种重重组组蛋蛋白白在在多多形形汉汉逊逊酵酵母母表表达达系系统统中中成功表达，如成功表达，如HBsAg。（六）利用重组酵母生产乙肝疫苗（六）利用重组酵母生产乙肝疫苗（六）利用重组酵母生产乙肝疫苗（六）利用重组酵母生产乙肝疫苗乙肝病毒的结构与性质乙肝病毒的结构与性质乙肝病毒的结构与性质乙肝病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由由由由乙乙乙乙肝肝肝肝病病病病毒毒毒毒（HBVHBV）感感感感染染染染引引引引起起起起的的的的急急急急慢慢慢慢性性性性乙乙乙乙型型型型肝肝肝肝炎炎炎炎是是是是一一一一种种种种严严严严重重重重传传传传染染染染病病病病，每每每每年年年年约约约约200200万万万万病病病病人人人人死死死死亡亡亡亡，3 3亿亿亿亿人人人人成成成成为为为为HBVHBV携携携携带带带带者者者者，其其其其中中中中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。 利利利利用用用用酵酵酵酵母母母母大大大大规规规规模模模模生生生生产产产产乙乙乙乙肝肝肝肝疫疫疫疫苗苗苗苗为为为为其其其其应应应应用提供了保证。用提供了保证。用提供了保证。用提供了保证。 目目目目前前前前对对对对HBVHBV还还还还没没没没有有有有一一一一种种种种有有有有效效效效的的的的治治治治疗疗疗疗药物，药物，药物，药物，乙肝疫苗乙肝疫苗乙肝疫苗乙肝疫苗可有效预防病毒感染。可有效预防病毒感染。可有效预防病毒感染。可有效预防病毒感染。HBVHBV的结构与性质的结构与性质的结构与性质的结构与性质 HBVHBV是是是是 蛋蛋蛋蛋 白白白白 包包包包 裹裹裹裹型型型型的的的的双双双双链链链链DNADNA病病病病毒毒毒毒，有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的病病病病毒毒毒毒颗颗颗颗粒粒粒粒呈呈呈呈球球球球面面面面状状状状，直直直直径径径径4242nmnm，基因组基因组基因组基因组3.23.2kbkb。HBVHBV的结构：的结构：的结构：的结构： 病病病病毒毒毒毒颗颗颗颗粒粒粒粒主主主主要要要要结结结结构构构构蛋蛋蛋蛋白白白白是是是是病病病病毒毒毒毒表表表表面面面面抗抗抗抗原原原原 ( (HBsAgHBsAg) )；颗颗颗颗粒粒粒粒内内内内蛋蛋蛋蛋白白白白包包包包括括括括核核核核心心心心抗抗抗抗原原原原(HBcAg)(HBcAg)、病毒、病毒、病毒、病毒DNADNA聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。HBsAg：HBV包包膜膜糖糖蛋蛋白白，包包括括小小分分子子(S)、中分子中分子(M)、大分子大分子(L)表面抗原三种形式。表面抗原三种形式。HBsAgHBsAg编码基因：编码基因：编码基因：编码基因：ATGATGATGATGATGATGTAATAA108aa108aa55aa55aa226aa226aapreS1preS1preS2preS2S SS S蛋白蛋白蛋白蛋白226aa226aaMM蛋白蛋白蛋白蛋白281aa281aaL L蛋白蛋白蛋白蛋白399aa399aaS蛋蛋白白可可刺刺激激机机体体产产生生中中和和抗抗体体，是是制制备乙肝疫苗的主要成分。备乙肝疫苗的主要成分。S蛋白：蛋白：即即小小分分子子HBsAg，是是构构成成HBV包包膜膜的的主主要要成成分分，大大量量存存在在于于感感染染者者血血清清中中，是是感染感染HBV的主要标志。的主要标志。 HBVHBV在在在在体体体体外外外外细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养基基基基中中中中不不不不能能能能繁繁繁繁殖殖殖殖，第第第第一一一一代代代代乙乙乙乙肝肝肝肝疫疫疫疫苗苗苗苗是是是是从从从从病病病病毒毒毒毒携携携携带带带带者者者者的的的的肝肝肝肝细细细细胞胞胞胞质膜上提取的。质膜上提取的。质膜上提取的。质膜上提取的。 质质质质膜膜膜膜来来来来源源源源的的的的疫疫疫疫苗苗苗苗有有有有较较较较高高高高的的的的免免免免疫疫疫疫原原原原性性性性，但受原材料限制，难以产业化。但受原材料限制，难以产业化。但受原材料限制，难以产业化。但受原材料限制，难以产业化。传统乙肝疫苗的制备：传统乙肝疫苗的制备：传统乙肝疫苗的制备：传统乙肝疫苗的制备：产乙肝产乙肝产乙肝产乙肝HBsAgHBsAg的重组酿酒酵母的重组酿酒酵母的重组酿酒酵母的重组酿酒酵母 2020世世世世纪纪纪纪8080年年年年代代代代始始始始，选选选选择择择择酿酿酿酿酒酒酒酒酵酵酵酵母母母母表表表表达达达达重重重重组组组组HBsAgHBsAg。 将将将将S S抗抗抗抗原原原原基基基基因因因因置置置置于于于于ADH1ADH1启启启启动动动动子子子子下下下下，获获获获得得得得有有有有免免免免疫疫疫疫活活活活性性性性的的的的重重重重组组组组蛋蛋蛋蛋白白白白，以以以以球球球球形形形形脂脂脂脂蛋蛋蛋蛋白白白白颗颗颗颗粒粒粒粒的的的的形形形形式式式式存存存存在在在在，平平平平均均均均直直直直径径径径2222nmnm，结结结结构构构构和和和和形形形形态态态态与与与与慢性慢性慢性慢性HBVHBV携带者血清中的病毒颗粒相同。携带者血清中的病毒颗粒相同。携带者血清中的病毒颗粒相同。携带者血清中的病毒颗粒相同。 以以以以酿酿酿酿酒酒酒酒酵酵酵酵母母母母生生生生产产产产的的的的重重重重组组组组HBsAgHBsAg颗颗颗颗粒粒粒粒作作作作为为为为乙乙乙乙肝肝肝肝疫疫疫疫苗苗苗苗已已已已商商商商品品品品化化化化，产产产产量量量量达达达达细细细细胞胞胞胞总总总总蛋蛋蛋蛋白白白白量量量量的的的的1-2%1-2%。 MM和和和和L L抗抗抗抗原原原原对对对对S S型型型型疫疫疫疫苗苗苗苗有有有有显显显显著著著著的的的的增增增增效效效效作作作作用用用用，由由由由三三三三者者者者( (或或或或两两两两者者者者) )构构构构成成成成的的的的复复复复合合合合型型型型乙乙乙乙肝肝肝肝疫疫疫疫苗苗苗苗，可诱导对可诱导对可诱导对可诱导对S S抗原无响应人群的免疫反应。抗原无响应人群的免疫反应。抗原无响应人群的免疫反应。抗原无响应人群的免疫反应。 将将将将S S抗抗抗抗原原原原基基基基因因因因置置置置于于于于AOX1AOX1强强强强启启启启动动动动子子子子下下下下，将将将将工工工工程程程程菌菌菌菌在在在在含含含含甘甘甘甘油油油油的的的的培培培培养养养养基基基基中中中中培培培培养养养养，待待待待甘甘甘甘油油油油耗耗耗耗尽尽尽尽后后后后，加加加加入入入入甲甲甲甲醇醇醇醇诱诱诱诱导导导导表表表表达达达达，S S抗抗抗抗原原原原的的的的产产产产量量量量可达细胞可溶性蛋白总量的可达细胞可溶性蛋白总量的可达细胞可溶性蛋白总量的可达细胞可溶性蛋白总量的3%3%。产乙肝产乙肝产乙肝产乙肝HBsAgHBsAg的的的的重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母 在在在在大大大大规规规规模模模模生生生生产产产产中中中中，巴巴巴巴斯斯斯斯德德德德毕毕毕毕赤赤赤赤酵酵酵酵母母母母工工工工程程程程菌菌菌菌在在在在240240L L的的的的发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐中中中中培培培培养养养养，可可可可获获获获得得得得9090g g 2222nmnm的的的的HBsAgHBsAg颗颗颗颗粒粒粒粒，可可可可制制制制成成成成900900万万万万份份份份乙肝疫苗。乙肝疫苗。乙肝疫苗。乙肝疫苗。利用重组酵母生产人血清清蛋白利用重组酵母生产人血清清蛋白人血清清蛋白是血浆的主要成分；是机体内重要生理人血清清蛋白是血浆的主要成分；是机体内重要生理物质的可溶性载体；维持血液正常渗透压方面起重要物质的可溶性载体；维持血液正常渗透压方面起重要作用；人血清清蛋白主要用作血浆扩充剂。作用；人血清清蛋白主要用作血浆扩充剂。成熟的人血清清蛋白为一非糖基化的单一多肽链，由成熟的人血清清蛋白为一非糖基化的单一多肽链，由585个氨基酸组成，含有个氨基酸组成，含有17对二硫键，由此维系的空间对二硫键，由此维系的空间构像是血清清蛋白的生物功能所必需的。构像是血清清蛋白的生物功能所必需的。p酿酒酵母：酿酒酵母：N端端Asp-Ala-His特征序列的成熟人血清清蛋白特征序列的成熟人血清清蛋白cDNA基因（基因（1.8kb）与各种不同信号肽编码序列体外拼接，并克隆在含）与各种不同信号肽编码序列体外拼接，并克隆在含有有UYP启动子和启动子和ADH1终止子的表达型质粒终止子的表达型质粒pJDB207上，克隆菌上，克隆菌的表达水平为的表达水平为55mg/L，但是人血清清蛋白序列在这个系统在难以，但是人血清清蛋白序列在这个系统在难以分泌，大部分形成受体结合型的表达产物。分泌，大部分形成受体结合型的表达产物。p乳酸克鲁维酵母：乳酸克鲁维酵母：生产的重组人血清清清蛋白具有正确的折叠构生产的重组人血清清清蛋白具有正确的折叠构象和加工模式，象和加工模式，17对二硫键完全正确配对，与天然的人血清清蛋对二硫键完全正确配对，与天然的人血清清蛋白几乎没有区别。白几乎没有区别。p巴斯德毕氏酵母：巴斯德毕氏酵母：最为优良的重组人血清清蛋白的表达分泌系统。最为优良的重组人血清清蛋白的表达分泌系统。在最优发酵条件下，重组毕赤酵母合成和分泌重组人血清清蛋白在最优发酵条件下，重组毕赤酵母合成和分泌重组人血清清蛋白的产率高达的产率高达15g/L，生产成本更低。，生产成本更低。HAS-CD4:人血清蛋白与人血清蛋白与CD4受体的融合蛋白受体的融合蛋白HIV感染的阻断剂使用感染的阻断剂使用,有效阻止有效阻止HIV感染感染CD4+淋巴细胞淋巴细胞