实实 验验 九九 噬菌体效价的测定噬菌体效价的测定目的要求目的要求1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法、掌握噬菌体效价测定的原理及方法2、观察噬菌斑的形态、观察噬菌斑的形态实实 验验 内内 容容 一一培养基和实验物品的准备培养基和实验物品的准备本次实验准备工作（本次实验准备工作（2 2人人/ /组）组）1 1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（ pH 7.4-7.6pH 7.4-7.6pH 7.4-7.6pH 7.4-7.6 ）； （已准备好）。（已准备好）。2 2、测定效价时稀释用、测定效价时稀释用9ml9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液牛肉膏蛋白胨液体培养液 2 2支支/ /组，分装于组，分装于1818180mm180mm试管；试管；3 3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%2%的琼脂）的琼脂）底层用，底层用，150ml/150ml/组，装于组，装于250ml250ml三角瓶，三角瓶， （用于制备（用于制备9 9个无菌平板，倒薄一点）个无菌平板，倒薄一点）4 4、上层用、上层用5ml5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8 %0.8 %的琼脂）的琼脂），融化后分装于，融化后分装于1515150mm150mm试管中加塞包扎灭菌，试管中加塞包扎灭菌，1010支支/ /组；组；（上周已准备好）。（上周已准备好）。5 5、1ml1ml无菌吸管无菌吸管 4 4支支/ /组。组。实实 验验 内内 容容 二二噬菌体知识介绍噬菌体知识介绍一、几个重要概念一、几个重要概念1、噬菌体：、噬菌体：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，分布极广，个体很小，微生物的病毒，分布极广，个体很小，在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。不同的噬菌体在电镜下有三种形态：不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蝌蚪形、微球形和丝形蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。2、噬菌斑：、噬菌斑： 在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞裂解形成的，其形状、大小不等。裂解形成的，其形状、大小不等。3、噬菌体效价：、噬菌体效价： 指指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌样品中所含具有侵染活性的噬菌体（烈性噬菌体）数量体（烈性噬菌体）数量噬菌斑形成噬菌斑形成单位（单位（pfu，plaque-forming unit）。）。效价（效价（titre，titer）这一名词在不同的）这一名词在不同的场合有其不同的含义（如抗生素等）场合有其不同的含义（如抗生素等）。二、病毒粒子的构造（模型）二、病毒粒子的构造（模型）噬噬菌菌体体的的形形态态及及分分类类科科属属大大肠肠杆杆菌菌T4噬噬菌菌体体结结构构示示意意图图大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图及电镜照片及电镜照片头部头部六角形基板六角形基板领环领环螺旋形尾鞘螺旋形尾鞘核心或管核心或管（中空）（中空）尾刺或刺突尾刺或刺突尾丝尾丝噬菌斑示意照片噬菌斑示意照片宿主细宿主细菌菌苔菌菌苔噬菌斑噬菌斑大大肠肠杆杆菌菌T噬噬菌菌斑斑的的表表型型形形态态三、噬菌体的分类三、噬菌体的分类根据噬菌体与宿主菌的相互关系根据噬菌体与宿主菌的相互关系烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage） 能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。菌体，并最终裂解细菌。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage） 噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌能随细菌DNA复制，复制，并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合态、营养态三种形式。态、营养态三种形式。针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、溶源菌溶源菌四、噬菌体繁殖（生活周期）四、噬菌体繁殖（生活周期）1 1、吸附、吸附2 2、侵入、侵入3 3、增殖（生物合成）、增殖（生物合成）4 4、成熟装配、成熟装配5 5、裂解释放、裂解释放T4噬菌体吸附和噬菌体吸附和DNA的注入的注入T偶偶数数噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆杆菌菌的的扫扫描描电电镜镜照照片片T4噬噬菌菌体体的的生生活活周周期期T4噬噬菌菌体体的的装装配配五、噬菌体的应用五、噬菌体的应用1、细菌的鉴定与分型、细菌的鉴定与分型 噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。2、遗传学及分子生物学研究的重要工具、遗传学及分子生物学研究的重要工具 噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，且易获得大量的突变体胞简单得多，且易获得大量的突变体构建基因文库（构建基因文库（噬菌体）；基因工程载噬菌体）；基因工程载体；噬菌体展示技术。体；噬菌体展示技术。3 3、细菌感染的诊断与治疗、细菌感染的诊断与治疗 利用其专一性，可以诊断和治疗一些利用其专一性，可以诊断和治疗一些相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治疗已有应用）疗已有应用） 但专一性也限制了噬菌体在临床上的但专一性也限制了噬菌体在临床上的广泛应用（人们最需要的是广谱性）。广泛应用（人们最需要的是广谱性）。六、噬菌体的危害六、噬菌体的危害在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使生产难以完成。生产难以完成。表现形式：表现形式：发酵周期明显延长；发酵周期明显延长；碳源消碳源消耗缓慢；耗缓慢；发酵液变清，镜检时，有大量异发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；常菌体出现；发酵产物的形成缓慢或根本发酵产物的形成缓慢或根本不形成；不形成；用敏感菌作平板检查时，出现大用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；量噬菌斑；用电子显微镜观察时，可见到用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。有无数噬菌体粒子存在。轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。七、以防为主的措施：七、以防为主的措施：1、决不使用可疑菌种；、决不使用可疑菌种； 2、严格保持环境卫生；、严格保持环境卫生；3、决不排放或随便丢弃活菌液；、决不排放或随便丢弃活菌液；4、注意通气质量、注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在3040米高空；米高空；5、加强管道及发酵罐的灭菌；、加强管道及发酵罐的灭菌；6、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；7、严格执行会客制度。、严格执行会客制度。实实 验验 内内 容容 三三噬菌体效价的测定噬菌体效价的测定一、噬菌体效价测定的方法一、噬菌体效价测定的方法（梯度稀释）（梯度稀释）斑点试验法斑点试验法液体稀释试管法液体稀释试管法以不长菌判断（澄清）以不长菌判断（澄清）双层平板法双层平板法最常用，优点较多最常用，优点较多单层平板法单层平板法载玻片法载玻片法快速快速其它病毒的效价（计数）测定其它病毒的效价（计数）测定空斑计数、空斑计数、电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝集、集、ELISA酶标仪）酶标仪）噬菌体效价测定的方法噬菌体效价测定的方法二、双层平板法二、双层平板法单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较双层平板法的优点：双层平板法的优点：加了底层培养基后，可使原来底面不平加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；的玻璃皿的缺陷得到了弥补；所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、面上，因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象；重叠现象；因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。菌斑较大，更有利于计数。 三、实验原理三、实验原理一个噬菌体一个噬菌体侵染细胞侵染细胞引起裂解引起裂解扩扩散重复裂解散重复裂解形成一个噬菌斑（琼脂凝形成一个噬菌斑（琼脂凝胶中）胶中）宿主细胞数远远大于噬菌体数？宿主细胞数远远大于噬菌体数？噬菌体效价（噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数噬菌斑数10稀释倍数稀释倍数四、实验步骤四、实验步骤1 1、制备底层平板、制备底层平板 将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板养基平板9 9个（倒薄一些），凝固。个（倒薄一些），凝固。2 2、加入大肠杆菌敏感菌、加入大肠杆菌敏感菌 在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板在每个牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液上，无菌条件下，各皿加入敏感菌菌悬液0.9mL0.9mL。3、稀释噬菌体、稀释噬菌体 取取1mL含噬菌体液加入到含噬菌体液加入到 9mL牛肉牛肉膏蛋白胨培养液中，采用膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法，倍稀释法，分别制备噬菌体稀释液（分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。）。4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合 将已加有大肠杆菌敏感菌将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板皿平板（ 10-5 、 10-6 、 10-7各各3皿）中，分别皿）中，分别加入加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置噬菌体稀释液，混合后放置5分钟。分钟。5、加入上层培养基、加入上层培养基 将将5mL溶化的半固体培养基中迅速溶化的半固体培养基中迅速倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板倒入含噬菌体与大肠杆菌敏感菌平板中（中（4550），并混合均匀。静止凝），并混合均匀。静止凝固。固。6、培养、培养 37培养培养2.5小时或室温培养小时或室温培养12小时。小时。7、观察、计数、观察、计数 观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑形成单位（的噬菌斑形成单位（pfu）记录于表格）记录于表格内。内。8、计算噬菌体的效价、计算噬菌体的效价 选取选取30300个个pfu数的平板计算每数的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体效价。毫升未稀释的原液的噬菌体效价。噬菌体效价（噬菌体效价（pfu/ml）= 噬菌斑数噬菌斑数10 稀释倍数稀释倍数实验步骤框图（教师进行演示操作）实验步骤框图（教师进行演示操作）用牛肉膏蛋白胨固用牛肉膏蛋白胨固体培养基倒平板体培养基倒平板9皿（薄一点）皿（薄一点） 噬菌体稀释液（噬菌体稀释液（10-5、10-6、10-7）0.1mL敏感菌菌悬液敏感菌菌悬液0.9mL放入已有底层固体培养基的放入已有底层固体培养基的平板中平板中混匀放置混匀放置5分钟分钟将将5mL溶化的半固体培养基中倒入溶化的半固体培养基中倒入上述平板中（上述平板中（4550）混匀（动作？）混匀（动作？）37培养培养5小时或小时或室温培养室温培养12小时小时观察结果计数观察结果计数教科书介绍方法的操作步骤教科书介绍方法的操作步骤噬菌体稀释液噬菌体稀释液0.1ml大肠杆菌培养液大肠杆菌培养液0.9ml4548溶化好牛肉膏溶化好牛肉膏蛋白胨半固体培养基蛋白胨半固体培养基4ml混匀吸附混匀吸附5min搓动混匀后倒于搓动混匀后倒于有底层的平板中有底层的平板中铺平铺平37 培养培养56小小时，观察计数时，观察计数思考题思考题噬菌体稀释度10-510-610-7123平均123平均123平均pfu数/平板每毫升中的pfu数1、记录结果，并进行统计分析。、记录结果，并进行统计分析。2、什么因素决定噬菌斑的大小？、什么因素决定噬菌斑的大小？3、如果在你的测定平板上，偶尔出现、如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？菌体效价测定？4、噬菌体效价测定实验中所用操作方、噬菌体效价测定实验中所用操作方法和书上介绍的操作方法比较有什法和书上介绍的操作方法比较有什么优缺点？么优缺点？下周实验内容下周实验内容微生物（细菌）的常见生理生化反应 要点：要点： 1、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 2、了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的重要作用。、了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的重要作用。 3、掌握通过糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）鉴别不同微、掌握通过糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）鉴别不同微生物的方法。生物的方法。 4、了解、了解IMViC（吲哚、甲基红、伏（吲哚、甲基红、伏-普、柠檬酸）与硫化普、柠檬酸）与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。