代谢工程 1: metabolic control analysis (MCA) 代谢控制分析 葡萄糖 丁二醇、丙酸、乳酸等丙酮酸丙酮酸乙醛乙醇 乙酰CoA 乙醇 或乙酸 三羧酸循环 各种氨基酸、细胞组成产物、代谢产物等 method 1: metabolic control analysis (MCA) 代谢控制分析 人们采取某种措施控制胞内通量分布来找到那些对产物合成有重要影响的关键分支点和关键分支点和关键酶关键酶，研究个体酶的动力学性质，分析酶促反应对代谢通量的敏感性，从而控制通量分布。 MCA 是研究分析代谢途径中代谢控制在各个反应步骤之间如何分配的理论。可以用数学形式表达，并与实验方法相结合，对细胞代谢的调控问题提出定量的解释。MCA的 基本理论 MCA的基本研究对象是由代谢反应步骤代谢反应步骤和代代谢反应途径谢反应途径组成的代谢系统，单个反应步骤是组成单个反应步骤是组成系统的基本单元系统的基本单元。 MCA 认为代谢系统中所有反应步骤都对代谢通量和代谢物浓度进行控制控制, 因此对其中一个反应一个反应步骤步骤施加微扰施加微扰而产生的代谢通量（或代谢物浓度）而产生的代谢通量（或代谢物浓度）变化的大小变化的大小，可以作为代谢系统分析理论的基本概基本概念念。 再结合直线式代谢系统的结构约束条件，可以导出总和原理和连通原理总和原理和连通原理。）控制系数控制系数 是对代谢系统中某一步反应施加一个微小扰微小扰动动，所引起代谢通量或代谢物浓度的相对变化与该反应的反应速度 v 相对变化之比，即：CA=(dA/A)/(dv/v) 式中A-代表代谢通量， CA-通量的控制系数。 例如：A代表代谢物的浓度，则CA 为该步骤代谢物的浓度控制系数。 表示每一步骤对控制作用的强弱。越小越好。）弹性系数弹性系数 是指对某一步反应的某一参数 p（如底物、产物、酶浓度、温度、效应物等）进行微扰，所引起的反应速度 vi的相对变化与参数的相对变化之比。 弹性系数 = (dv/v) / (dA/A)， 即越大越好，即对反应的影响越大。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制代谢控制分析定义通量控制系数、浓通量控制系数、浓度控制系数、弹性系数等度控制系数、弹性系数等表征参数，通过对它们进行比较即可找到限制性步骤和关键酶，为代谢工程提供目标位点。常用的是一种基于扰动扰动-响应的方法响应的方法，即通过基因工程手段或加入抑制剂改变特定酶的水平或活性，或者改变环境条件,如底物、中间化合物、产物底物、中间化合物、产物浓度等的改变，考察其对通量分布的影响而求得各个参数。 MCA 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制总之，随着理论研究的深入，已发展到可以对含有分分支支途途径径、循循环环、酶酶-酶酶相相互互作作用用、级级联联反反应应等各种结构形式的代谢系统进行代谢控制分析。2. metabolic flux analysis ( MFA,代谢通量分析) 用于分析：确定分支途径的优先合成,以及发现其它分支途径。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 MFA是根据代谢路径中各反应的计量关系、某些底物、产物的通量某些底物、产物的通量及细胞组成等确定整个代谢网络的通量分布通量分布。该方法的基础是准稳态假设准稳态假设：假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态中间代谢物均处于准稳态，即浓度不变，可由 n个中间代谢物得到 n个关于速率的约束条件 ,而速率的总数目为 J，则待解问题的自由度为 F=J-n。这样通过实验测出F个不相关速率,就求出整体通量分布。前提是对细胞内代谢路径细胞内代谢路径有清楚的了解，尤其是各个分支点。2MFA,代谢通量分析 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制下式为计算代谢物质量平衡的化学计量方程： Ar(t)+b(t)+Rmb=0 式中：A为系数矩阵，r(t)为反应速率向量，b(t)为代谢物积累速率代谢物积累速率，Rmb为残差向量。 其中 b(t)分为胞外代谢物积累速率和分为胞外代谢物积累速率和胞内代谢物积累速率之和，前者可通过胞内代谢物积累速率之和，前者可通过测量获得，后者根据准稳态假设为零测量获得，后者根据准稳态假设为零。只需测量几个胞外速率或其它约束条件，就可以计算出胞内各代谢反应速率。 MFA 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 schulnze 将MFA的应用归纳为 6 点：1）计算细胞内部通量分布；2）计算某些难以直接测量的外部量的变化速率；3）确定代谢路径中刚性节点及控制步骤刚性节点及控制步骤；4）计算理论得率理论得率；5）确定胞内代谢路径；6）分析替代路径对通量分布的影响。 代谢流分析在微生物培养中应用比较广泛，它有助于理解细胞各代谢途径它有助于理解细胞各代谢途径的特点，并提供代谢调控或优化的信息的特点，并提供代谢调控或优化的信息，可通过同位素标记及核磁共振来测定通过同位素标记及核磁共振来测定NMR。这种方法的缺点是测定费用昂贵。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制而简单方法是通过测定细胞外代谢物测定细胞外代谢物及菌体组成及菌体组成，根据物料平衡和已知的代谢途径来计算。由于细胞代谢网络的复杂性，通常不能得到唯一解，即局限性。 可能的解决方法，一是合并反应，减少变量个数；二是通过共谢物的测定来确定循环反应的流量；三是利用线性规划的方法来求得最优化解。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制总之，通过代谢机制分析，提高目的产物产率：1）强化目的产物生成途径强化目的产物生成途径，如提高关键酶活2）打断或减弱分支途径打断或减弱分支途径，减少副产物或次级代谢产物。3）构建新途径合成产物或中间化合物，4）阻断产物的分解或利用阻断产物的分解或利用。5）提高细胞膜通透性提高细胞膜通透性，分泌出产物，以及提高菌种耐受性。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 辅酶Q10作为细胞呼吸链上的重要组成部分，抗氧化、抗衰老功能使其广泛应用于医药、食品和化妆品等行业。 自然界筛选的各种微生物作为生产菌种发酵生产CoQ10, 具有产量低、营养要求、难规模化生产。 MCA、MFA例子例子 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 吴祖芳等研究发现, CoQ10的生物合成很大程度上取决于CoQ10生物合成途径中催化DPP(聚十异戊二烯焦磷酸)的合成和PHB ( 4-羟基苯甲酸)与DPP的缩合反应的两种关键酶两种关键酶活性。1. 提高通向目标产物代谢流提高通向目标产物代谢流的手段: 增强催化限速反应的酶的表达量或活性, 从而提高代谢流; 在有竞争途径或者是分支代谢途径存在时, 阻断有害的或无关的竞争代谢途径的代谢产物合成,从而达到改变代谢流, 提高目标产物产量的目的; 强化整个代谢途径的代谢流量, 使得目标产物含量增加。 染菌的防止染菌的防止CoQ10生成途径生成途径培养基与设备灭菌限速酶- 4-羟基苯甲酸-聚异戊二烯焦磷酸转移酶, 主要负责催化pHB 与PPP的缩合反应。该酶专一性不强, 在E. coli中主要是由ubiA 基因编码; 在Saccharomyces cerevisiae 中由coq2 基因编码; 在S chizosaccharomy ces pombe 由ppt1基因编码。Zhang 等将来自E. coli、S. cerevisiae、S. pombe 的ub iA、coq2、ppt1基因转化到A. tumefaciens 中,结果发现能够表达ubiA、coq2、ppt1基因的重组A.tumefaciens 的CoQ10的含量得到较大提高。5-磷酸脱氧木酮糖合成酶( DXS)是MEP代谢途径上合成DPP的限速酶。通过在E. coli中过量表达来自P seudomonas aerug inosa, Bacillus subtilis 或Synechocy stissp. 6803 的DXS 基因, 可以使得大肠杆菌的CoQ 合成量得到提高。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制2. 阻断有害的或无关的竞争代谢途径阻断有害的或无关的竞争代谢途径 一些物质(包括芳香族氨基酸、叶酸、细菌萜醇等)与CoQ 的生物合成途径有一些共同的代谢前体。例如, 芳香族氨基酸和CoQ 的合成都需要4-羟基苯甲酸羟基苯甲酸为共同前体。 一方面增强分支酸途径中关键酶的活性从而增加4-羟基甲酸合成量, 另一方面减弱芳香族氨基酸合成途径的代谢流量减弱芳香族氨基酸合成途径的代谢流量, 使得更多4-羟基甲酸流向CoQ 合成。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 在CoQ 合成过程中, IPP(异戊烯基焦异戊烯基焦磷酸磷酸)和和DMAPP(二甲基烯丙焦磷酸二甲基烯丙焦磷酸) 是聚异戊烯侧链的合成所需的两种前体, 但是很多细菌萜醇、叶酸、胡罗卜素等物质同样需要IPP和DMAPP作为前体物。切断或者是减弱这些物质的合成途径, 使得更多的代谢前体物流向CoQ 的合成, 而提高CoQ 的产量。Yosh ida等发现, 能够在琼脂平板上形成绿色菌落的突变株其CoQ10的含量较野生型菌株提高了10% -20%, 原因是这些突变株的胡罗卜素含量均有下降。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 3. 构建新的代谢途径构建新的代谢途径 一般是指引入外源基因来改造和修指引入外源基因来改造和修饰代谢网络饰代谢网络, 使细胞从不能合成某种代谢使细胞从不能合成某种代谢产物转变为能够合成此代谢产物产物转变为能够合成此代谢产物。常用的手段有转移代谢途径, 即将多个特定代谢途径中的相关基因转移到无这些基因的菌株中, 从而达到使其能合成新的目标产物的目的; 如强化或增加次黄嘌呤合成来提高鸟苷产量。 外源的DPS（十异戊二烯焦磷酸合酶）基因在E. coli中的高表达，提高C oQ10。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制 构建外源的MVA 途径 在大肠杆菌中, IPP和DMAPP主要是通过MEP途径合成, 而在真核微生物中主要是通过MVA 途径合成。但在大肠杆菌中经在大肠杆菌中经MEP途径合途径合成成IPP量不足量不足，限制以IPP 为前体物质的合成。 通过代谢工程的手段在大肠杆菌中引入在大肠杆菌中引入MVA 途径途径从而增加IPP等前体物的供给量, 则可以提高CoQ10的含量。可将MVA 途径中的各种酶基因克隆基因克隆至大肠杆菌，或原生质体融合原生质体融合获得。 Zahiri等将A. tumefaciens 的ddsA 基因引入E. coli中, 得到的重组E. coli在初始pH =7. 0的YTG 培养基上培养,CoQ10的产量可达470 g /Gdcw。再将外源的MVA 途径引入大肠杆菌中使得CoQ10的产量进一步提高到1706 g/gDCW。 线状的线状的DNA侵入大肠杆菌侵入大肠杆菌K12细胞内时，首先环合成细胞内时，首先环合成为环状为环状DNA，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由，两边粘性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。连接酶封闭。 噬菌体感染了寄主细胞之后，噬菌体感染了寄主细胞之后， DNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由还是溶源反应，这要由CI基因和基因和cro基因编码的蛋白质同基因编码的蛋白质同噬菌体的两个操纵基因噬菌体的两个操纵基因 （OL，OR）之间的相互作用来）之间的相互作用来决定，参见图决定，参见图 3-11。2 噬菌体噬菌体DNA复制复制总之，通过代谢机制分析，提高目的产物产率：1）强化目的产物生成途径强化目的产物生成途径，如提高关键酶活2）打断或减弱分支途径打断或减弱分支途径，减少副产物或次级代谢产物。3）构建新途径合成产物或中间化合物，4）阻断产物的分解或利用阻断产物的分解或利用。5）提高细胞膜通透性提高细胞膜通透性，分泌出产物，以及提高菌种耐受性。