Chap.7Chap.7 微生物遗传变异和育微生物遗传变异和育种种微生物遗传学研究意义微生物遗传学研究意义1 1） 微生物学的主要分支微生物学的主要分支2 2）为生命遗传现象的解释提供依据）为生命遗传现象的解释提供依据3 3）是分子生物学发展的基础学科）是分子生物学发展的基础学科4 4）促进工业微生物菌种的选育）促进工业微生物菌种的选育 .1 .1 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、证明遗传物质的三个典型实验一、证明遗传物质的三个典型实验-细菌转化实验细菌转化实验 - -噬菌体感染实验噬菌体感染实验 - -植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 1 1、细菌转化实验、细菌转化实验 - - 动物试验动物试验 (Grifith,1928)(Grifith,1928)-细菌培养实验细菌培养实验S S（死）（死）+R+R（活）（活） S S（ 少量活）少量活） +R +R（活）（活）S S（无细胞提取液）（无细胞提取液）+R+R（活）（活） S S（ 少量活）少量活） +R +R（活）（活）-细菌培养试验（细菌培养试验（AveryAvery，19441944）2 2噬菌体感染实验噬菌体感染实验 (Hershey;Chase,1952) (Hershey;Chase,1952)3 3植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 (Fraenkel- (Fraenkel-Conrat,1956)Conrat,1956)二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式（一）真核与原核微生物遗传物质比较（一）真核与原核微生物遗传物质比较原核与真核微生物原核与真核微生物基因组大小细菌染色体数目与形状细菌染色体结构细菌染色体结构真核微生物染色体结构 (示核小体） 真核生物基因结构真核微生物基因表达控制（二）原核生物的质粒（二）原核生物的质粒质粒：质粒： 游离于染色体外，游离于染色体外，独立复制，独立复制，环状、环状、共价、共价、闭合闭合dsDNAdsDNA分子，分子， 即即 cccDNA cccDNA。 质粒的特点质粒的特点1 1）大小：）大小：大质粒：大质粒：60kb60kb、1/cell1/cell小质粒：小质粒： 10-20/cell 10-20/cell2 2）自主复制能力：）自主复制能力： 型复制、滚环复制型复制、滚环复制 数量控制：严紧型数量控制：严紧型 ；松弛型；松弛型3 3）转移性：）转移性：TraTra区基因：区基因：附加体：附加体：某些质粒既可整某些质粒既可整合进宿主染色体，又可与合进宿主染色体，又可与染色体脱离，称之染色体脱离，称之 。4）质粒的消除：）质粒的消除： - -理化因子理化因子 - -原生质体诱导法原生质体诱导法5 5）不相容性：）不相容性： 两种亲缘关系相近的质粒不能稳定地两种亲缘关系相近的质粒不能稳定地存在于同一个细胞中。存在于同一个细胞中。（G-G-菌的部分不相容群）菌的部分不相容群）质粒的遗传表型质粒的遗传表型1 1） F F质粒（致育因子）质粒（致育因子） Tra Tra基因：编码转移相基因：编码转移相关关蛋白；合成性纤毛蛋白；合成性纤毛2 2）R R质粒（抗药因子）质粒（抗药因子） -RTF -RTF基因（抗性转移因子）基因（抗性转移因子） - -抗性决定子抗性决定子 （抗抗生素、抗药、抗（抗抗生素、抗药、抗种金属）种金属）3 3）ColCol质粒（大肠杆菌素因子）质粒（大肠杆菌素因子） - -产大肠杆菌素产大肠杆菌素 细菌素：由细菌质粒编码产生的细菌素：由细菌质粒编码产生的只能只能 抑制或杀灭近抑制或杀灭近缘细菌或同种缘细菌或同种 不同菌株的蛋不同菌株的蛋白质。白质。 Col Col质粒类型：质粒类型： - -非接合型：松弛型非接合型：松弛型 - -接合型：严紧型接合型：严紧型4 4）TiTi质粒质粒：合成冠瘿碱、大型质粒：合成冠瘿碱、大型质粒5 5）RiRi质粒质粒：产生根毛、大型质粒：产生根毛、大型质粒7 7）降解质粒）降解质粒：降解、接合：降解、接合8 8）致病性质粒：）致病性质粒： 溶血素、肠毒素溶血素、肠毒素（S.aureusS.aureus）9 9）共生固氮质粒：）共生固氮质粒： - -结瘤基因结瘤基因（nodnod） - -固氮基因固氮基因（nifnif）1010）隐蔽质粒：）隐蔽质粒： - - 未有明确表型未有明确表型工程质粒工程质粒-pBR322-pBR322主要特点：主要特点：1 1）分子量小）分子量小2 2）稳定、松弛型复制稳定、松弛型复制3 3）可大量扩增可大量扩增4 4）容易分离）容易分离5 5）可携带小于）可携带小于10kb10kb外源外源DNADNA6 6）带有带有2 2个选择标记个选择标记 ; 7 ; 7）多个单一酶切位点多个单一酶切位点 8 8）容易转化）容易转化利用选择标记鉴别携带外源片段的转化子利用选择标记鉴别携带外源片段的转化子(双抗菌素对照筛选）双抗菌素对照筛选）建议读物 .2 .2 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 一、基因突变一、基因突变野生型菌株：从自然界分离获得的菌株，野生型菌株：从自然界分离获得的菌株， 称之为称之为 。基本培养基基本培养基(MM)(MM)：满足野生型菌株生长最：满足野生型菌株生长最 低营养要求的合成培养基。低营养要求的合成培养基。（一）突变类型（一）突变类型营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失 了了 某种营养合成能力，而无法在基本某种营养合成能力，而无法在基本培培 养基上生长的变异类型。养基上生长的变异类型。 表示：表示：基基 因：因：hishis+ +，his his - - ； 表表 型：型：His His + + ，His His - - 抗性突变型：抗性突变型：野生型菌株由于突变而产了对某些化学药物野生型菌株由于突变而产了对某些化学药物或致死物理因子抗性变异类型。或致死物理因子抗性变异类型。表示：表示：基基 因：因： strstrr r、strstrs s； tettetr r、tettets s； 表表 型：型：Str Str r r ， Str Str s s条件致死突变型：条件致死突变型：某些菌株或病毒经基因突变后，在某种条件某些菌株或病毒经基因突变后，在某种条件可生长并实现表型，而在另一条件却无法生可生长并实现表型，而在另一条件却无法生长繁殖的突变类型。长繁殖的突变类型。(如温度敏感突变株：如温度敏感突变株：Ts）形态突变株形态突变株抗原突变株抗原突变株产量突变株产量突变株突变株类型划分：突变株类型划分：-选择性突变株：营养缺陷型、抗性选择性突变株：营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型突变型、条件致死突变型-非选择突变株：形态、抗原、产量非选择突变株：形态、抗原、产量突变型突变型（二）突变率及其捡出（二）突变率及其捡出突变率：突变率：某一细胞在每一世代中发生突变的几率。常用某一细胞在每一世代中发生突变的几率。常用单位群体中每一世代产生的突变株的数目来表单位群体中每一世代产生的突变株的数目来表示。示。突变株的捡出及突变率的计算突变株的捡出及突变率的计算捡出方法：捡出方法：1）选择性突变株）选择性突变株-营养缺陷型营养缺陷型-抗药性突变抗药性突变回复突变回复突变:（三）基因突变的自发性与不对称性（三）基因突变的自发性与不对称性突变的自发性：基因可自发产生突变。突变的自发性：基因可自发产生突变。（辐射、自身有害物质、碱基配对错误）（辐射、自身有害物质、碱基配对错误）突变的不对应性：突变性状与引起突变突变的不对应性：突变性状与引起突变的环境因素无直接对应关系。的环境因素无直接对应关系。平板影印培养试验平板影印培养试验 (Lederberg)(Lederberg)（四）基因突变及其机制（四）基因突变及其机制1 1、诱发突变、诱发突变 ( (点突变点突变, , 畸变畸变) )1)1)点突变点突变(1)(1)碱基置换碱基置换 - -转换转换 - -颠换颠换可能的可能的突变型：突变型：错义突变错义突变无义突变无义突变同义突变同义突变相关的诱变剂相关的诱变剂直接引起置换：直接引起置换：亚硝酸、亚硝基胍、羟胺、烷化剂亚硝酸、亚硝基胍、羟胺、烷化剂间接引起置换：间接引起置换：碱基类似物碱基类似物（5 5BU, 5-AU)BU, 5-AU)(2(2）移码突变）移码突变 DNA DNA序列中插入或缺失少数核苷酸，序列中插入或缺失少数核苷酸，从而使该处后面遗传密码的阅读框架发生改从而使该处后面遗传密码的阅读框架发生改变的突变。变的突变。 2 2）染色体畸变染色体畸变 DNA DNA分子的大段损伤，包括缺失、重复、分子的大段损伤，包括缺失、重复、 插入、易位（转座）和倒拉等。插入、易位（转座）和倒拉等。转座：转座：DNADNA分子通过非同源重组方式，分子通过非同源重组方式，从染色体的某一部位转移到另一部位的从染色体的某一部位转移到另一部位的现象。现象。 转座因子转座因子凡具有转座作用的凡具有转座作用的DNA序列均称之序列均称之。特点：特点：-转座作用转座作用-末端重复序列末端重复序列-转座酶基因转座酶基因转座因子类型转座因子类型插入序列插入序列转座子转座子(或称或称复合转座子）复合转座子）转座噬菌体转座噬菌体a）插入序列）插入序列(IS)b）转座子转座子(Tn)转座机理转座机理转座子的遗传效应和生物学意义转座子的遗传效应和生物学意义（复制型转座）（复制型转座）遗传效应遗传效应1）插入突变）插入突变2）DNADNA重排重排意义：意义：进化，获得突进化，获得突变株，抗药性变株，抗药性鉴定必须基因鉴定必须基因（五）紫外线对（五）紫外线对DNADNA的损伤及其修复的损伤及其修复1 1损伤的机理：损伤的机理：形成胸腺嘧啶二聚体形成胸腺嘧啶二聚体2、修复作用、修复作用1）光复活作用）光复活作用光解酶光解酶-二聚体复合二聚体复合物为光激活物为光激活 2.2.暗修复作用：暗修复作用： 3 3、重组修复、重组修复 4 4、SOSSOS修复修复二、二、 突变与育种突变与育种（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种( (定向培育）定向培育）（二）诱变育种（二）诱变育种1 1、基本原则（应考虑的问题）、基本原则（应考虑的问题）1 1） 诱变剂的选择诱变剂的选择 ( (有效性有效性, ,安全性，简便性安全性，简便性) )诱变剂诱变效果测定诱变剂诱变效果测定（回复突变率的测定）（回复突变率的测定）-艾姆氏试艾姆氏试 验验( (检测三致物质）检测三致物质）2 2）出发菌株）出发菌株3 3）诱变菌株的状态）诱变菌株的状态 - -处理单胞处理单胞（孢）悬液（孢）悬液 - -选择单倍体选择单倍体或单核细胞或单核细胞4 4）剂量：低剂量；）剂量：低剂量； ( (表示方法表示方法) )5 5）提高检出效率）提高检出效率 - -利用形态特征利用形态特征 - -鉴别培养基鉴别培养基利用鉴别培养基检出突变株利用鉴别培养基检出突变株 - -蛋白酶高活性菌株的检出蛋白酶高活性菌株的检出 （酪蛋白为（酪蛋白为N N源，加源，加HgClHgCl2 2观察透明观察透明圈）圈） - -淀粉酶高活性菌株的检出淀粉酶高活性菌株的检出 （淀粉为（淀粉为C C源，加源，加I I2 2液观察透明圈）液观察透明圈） - -有机酸高产菌株的检出有机酸高产菌株的检出 （培养基加（培养基加CaCOCaCO3 3观察透明圈）观察透明圈）6 6）设计高效的）设计高效的 筛筛选方案选方案 - -初筛（数量、初筛（数量、 定性）定性） - -复筛（质量、复筛（质量、 定量）定量）7 7）创新性的）创新性的 筛筛选方法选方法 2 2、营缺型的筛选、营缺型的筛选（1 1）三种基本培养基）三种基本培养基基本培养基基本培养基- :- :满足野生型菌株生长满足野生型菌株生长最低营养要求的组合培养基。最低营养要求的组合培养基。完全培养基完全培养基+ + ：满足所有营缺型菌株满足所有营缺型菌株生长营养要求的天然或半组合培养基。生长营养要求的天然或半组合培养基。补充培养基补充培养基AA，B B ：满足相应营缺型满足相应营缺型菌株生长营养要求的组合或半组合培养基。菌株生长营养要求的组合或半组合培养基。（2 2）三类遗传型个体）三类遗传型个体野生型：从自然界分离获得的菌株不论野生型：从自然界分离获得的菌株不论营养状况如何，均称为营养状况如何，均称为。（A+B+）营缺型：野生型菌株经诱变由于代谢障碍，营缺型：野生型菌株经诱变由于代谢障碍，而必须添加某种物质才能生长的突变株。而必须添加某种物质才能生长的突变株。 （A+B-）（A-B+） 原养型：营缺型回复突变后的菌株。原养型：营缺型回复突变后的菌株。 （A+B+）基本基基本基 完全基完全基 补充基补充基野生型野生型 + + + + + +营缺型营缺型 + + + +原养型原养型 + + + + + +（3 3）筛选步骤）筛选步骤1）诱变）诱变2）淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法）淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法3）检出：）检出：夹层培养法；限量补充法夹层培养法；限量补充法逐个检出法；影印平板法逐个检出法；影印平板法夹层培养法夹层培养法（4 4）鉴定缺陷型）鉴定缺陷型( (生长谱法生长谱法) )1 1）制备基本）制备基本 培养基；培养基；2 2）加充分洗）加充分洗 涤菌悬液；涤菌悬液；3 3）加待测营）加待测营 养物；养物；4 4）观察生长。）观察生长。定位（点）诱变定位（点）诱变盒式诱变 寡核苷酸引物诱变Strain improvement for fermentation and biocatalysis processes by genetic engineering technology建议读物.3 .3 基因重组基因重组基因重组（遗传重组）：基因重组（遗传重组）：两个独立基因组内的遗传物两个独立基因组内的遗传物质，通过一定的途径转移到一质，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定的基因组过程。起，形成新的稳定的基因组过程。遗传工程遗传工程 -基因重组技术基因重组技术经典、同源、生物自然属性、经典、同源、生物自然属性、体内体内-DNA重组技术：重组技术：分子水平、同分子水平、同-异源、体外异源、体外一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组 （一）转化（一）转化受体菌直接吸收供体菌游离的受体菌直接吸收供体菌游离的DNADNA片段而获得部分遗传性状的现片段而获得部分遗传性状的现象。象。1 1、转化的基本条件、转化的基本条件（1 1）感受态：）感受态： 受体菌最容易接受外源受体菌最容易接受外源DNA DNA 片段并能实现片段并能实现转化的一种生理状态。转化的一种生理状态。 影响因素：影响因素： - -遗传因素（感受态因子遗传因素（感受态因子; ;种属的特异种属的特异性；）性；） - -外部因素（外部因素（CAMPCAMP、聚乙二醇、二价阳、聚乙二醇、二价阳 离子离子-低温低渗低温低渗CaClCaCl处理、培养条件）处理、培养条件） 转化频率：转化频率：0.10.11%1%（很低），最高（很低），最高10%10%，质粒，质粒 为良好的转化因子。为良好的转化因子。 浓度：浓度： 1010-5-5 ug/ml ug/ml结构：一般转化因子都是线状双链结构：一般转化因子都是线状双链DNADNA，少数为，少数为 线状单链线状单链DNADNA。大小：每一转化大小：每一转化DNADNA片段分子量约片段分子量约 110 1107 7， 约占约占 染色体组染色体组0.3%0.3%，平均，平均 15 15个基因。个基因。（2 2）转化因子）转化因子转化因子转化因子非交换非交换 2 2、转化过程、转化过程 1 1）酶解和吸收单链）酶解和吸收单链2 2）同源区配对、）同源区配对、 整合整合3 3）复）复 制制4 4）形成转化子）形成转化子3.3.转染转染(Tranfection)(Tranfection)提纯的病毒提纯的病毒DNADNA或或RNARNA进入宿主细胞并进入宿主细胞并增殖出正常的病毒后代现象。增殖出正常的病毒后代现象。 If DNA from a virus is used If DNA from a virus is used as the cloning vector, the as the cloning vector, the process is called transfection.process is called transfection. (Introduction to microbiology, John (Introduction to microbiology, John L. Ingraham )L. Ingraham ) （二）转导（二）转导 完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介, ,使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。现象。1 1、普遍转导、普遍转导 完全缺陷噬菌体对供体任何完全缺陷噬菌体对供体任何DNADNA小片小片段进行段进行“误包误包”,”,而将其遗传性状传递给而将其遗传性状传递给受体菌的现象，包括完全普遍转导和流产受体菌的现象，包括完全普遍转导和流产普遍转导两种类型。普遍转导两种类型。完全转导完全转导 ( (形成转导子形成转导子) )感染复数：感染的噬菌体数感染复数：感染的噬菌体数/ /被感染细胞数被感染细胞数流产转导：流产转导：( (仅形成一个转导子仅形成一个转导子, , 产生小菌落产生小菌落) )经转导进入受体菌的供体菌经转导进入受体菌的供体菌DNADNA片段片段，在受体菌内不交换、整合、在受体菌内不交换、整合、复制，也不迅速消失，仅进行转录、翻译、性状表达转导现象。复制，也不迅速消失，仅进行转录、翻译、性状表达转导现象。 、局限转导、局限转导 部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定的基因部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定的基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象。携带到受体菌中并获得表达的转导现象。 A A、低频转导（）、低频转导（）噬菌体感染噬菌体感染）诱导裂解）诱导裂解）不正常切离（低频转）不正常切离（低频转导裂解物）导裂解物）（ dgal、 dbio）形成局限转导子）形成局限转导子B B、高频转导（）、高频转导（） 1 1）概念）概念低频转导低频转导(LFT)(LFT)裂解物：溶源裂解物：溶源噬菌体感染后，噬菌体感染后， 带少数局限转导噬菌体带少数局限转导噬菌体的细胞的细胞裂解物。裂解物。双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体 和缺陷噬菌体的受体菌。和缺陷噬菌体的受体菌。 ( (来源：来源：LFTLFT裂解物以高的感染复数感染宿主裂解物以高的感染复数感染宿主) )双重溶源菌双重溶源菌2 2）高频转导：在局限转导中，用双重溶源）高频转导：在局限转导中，用双重溶源菌诱导后产生的高频转导裂解物转导受体菌菌诱导后产生的高频转导裂解物转导受体菌可获得的高达可获得的高达 50% 50% 的转导子，称之的转导子，称之 。3）过程：）过程：1）双重溶源菌）双重溶源菌2）诱导，获得高频转导裂解物）诱导，获得高频转导裂解物3）高频转导裂解物低）高频转导裂解物低m.o.i感染受体菌感染受体菌（3 3）溶源转变）溶源转变 温和噬菌体温和噬菌体 感染宿主后，宿主通过感染宿主后，宿主通过溶源化而获得免疫性以外新性状的现溶源化而获得免疫性以外新性状的现象。象。白喉毒素：白喉毒素：白喉杆菌的白喉杆菌的-噬菌体带有噬菌体带有“TOX”“TOX”基因基因（三）接合（三）接合 接合：通过细胞间的直接接触接合：通过细胞间的直接接触, ,由质由质粒介导的遗传物质转移的现象粒介导的遗传物质转移的现象. . 接合子：通过接合接合子：通过接合 而获得新的遗传而获得新的遗传 性状的受体细胞。性状的受体细胞。 存在方式存在方式: :四种接合型菌株四种接合型菌株1 1、F F - - 2 2、 F F+ + 菌株菌株OritOrit：起始子：起始子3 3、HfrHfr菌株：菌株：高频重组菌株，高频重组菌株， F F+ +整合在染色体上整合在染色体上 成为附加体的状态，若与成为附加体的状态，若与F F - -接合，有很高接合，有很高的重组的重组 频率。频率。1 1）细胞接触）细胞接触2 2）HfrHfr断裂、断裂、 转移、转移、 复制复制3 3）接合中断）接合中断4 4）形成接合子）形成接合子利用利用接合中断法绘制染色体图谱接合中断法绘制染色体图谱中断杂交试验中断杂交试验基因测序基因测序 （鸟枪法）（鸟枪法）1.1.构建文库构建文库2.2.随机测序随机测序3.3.片断排列片断排列4.4.编辑编辑 4 4、 F F 菌株菌株（质粒带有部分（质粒带有部分染色体片断的菌染色体片断的菌株）株）初生初生F F 菌株菌株次生次生F F 菌株菌株建议读物建议读物基因水平转移是细菌进化的主要动力 微生物功能基因组学 （四）原生质体融合（四）原生质体融合 通过人为方法通过人为方法, ,使遗传性状不同的两使遗传性状不同的两个个细胞的原生质体融合细胞的原生质体融合, ,继而遗传重组继而遗传重组, ,借借以获得兼有双亲性状以获得兼有双亲性状, ,遗传性稳定的融遗传性稳定的融合子的过程。合子的过程。主要步骤：主要步骤：1 1）选择亲本）选择亲本2 2）制备原生质体）制备原生质体3 3）促融）促融4 4）原生质体再生）原生质体再生5 5）融合子检出）融合子检出6 6）筛选）筛选MetabolicengineeringbygenomeshulfflingG.StephanopoulosNature biotechnology 2002, 20, 666-建议读物：建议读物：总结：总结：.5 .5 菌种衰退、复壮和保藏菌种衰退、复壮和保藏菌种衰退现象：形态、生长速度、代谢产物、致病性、抗逆性等复壮：通过分离纯化和测定，从衰复壮：通过分离纯化和测定，从衰退群体中筛选未退化的个体。退群体中筛选未退化的个体。菌种菌种衰退的防止：1）减少传代次数2）良好培养条件3）利用不易衰退的细胞传代4）菌种的有效保藏菌种的有效保藏菌种保藏相关问题：菌种保藏相关问题：1 1保藏条件：低温、干燥、无氧、低保藏条件：低温、干燥、无氧、低 营养、保护剂营养、保护剂2 2、菌种的有效管理、菌种的有效管理 保藏机构：保藏机构：ATCCATCC、CCTCCCCTCC3 3、有效的保藏方法、有效的保藏方法常用保藏方法比较：常用保藏方法比较：