生物电子显微技术生物电子显微技术 第六章第六章 SEMSEM样品制备技术样品制备技术生物电子显微技术生物电子显微技术第一节第一节 SEMSEM样品制备技术概述样品制备技术概述一、生物样品按含水量分类一、生物样品按含水量分类 1. 含水量少的硬组织含水量少的硬组织 包括：毛发、牙齿、植物花粉、子粒等，昆虫包括：毛发、牙齿、植物花粉、子粒等，昆虫 的口器、刚毛、鳞毛、卵壳等的口器、刚毛、鳞毛、卵壳等 处理过程：清洁表面处理过程：清洁表面粘胶粘胶喷金喷金观察观察 2. 含水量多的软组织含水量多的软组织 包括：动植物器官、组织及细菌、真菌等包括：动植物器官、组织及细菌、真菌等 处理过程：取材固定处理过程：取材固定脱水脱水干燥干燥 喷金喷金观察观察生物电子显微技术生物电子显微技术 1. 使样品的表面形貌结构保持活体时的近使样品的表面形貌结构保持活体时的近 似形态似形态,所观察的表面要求处理干净。所观察的表面要求处理干净。 2. 对拟研究内表面结构，可采用冷冻断裂对拟研究内表面结构，可采用冷冻断裂 技术获取一个新的观察面。技术获取一个新的观察面。 3. 尽可能在样品没变形的情况下除去水份，尽可能在样品没变形的情况下除去水份， 即对样品进行即对样品进行“无损干燥无损干燥”。 4. 样品表面应有良好的导电性能和二次电样品表面应有良好的导电性能和二次电 子发射率。子发射率。 5. 进行细胞化学研究时，要求标记物有一进行细胞化学研究时，要求标记物有一 定的形态，以便于识别。定的形态，以便于识别。二二 样品制备的基本要求样品制备的基本要求生物电子显微技术生物电子显微技术三三 样样品品制制备备的的一一般般流流程程生物电子显微技术生物电子显微技术第二节第二节 样品制备的一般程序样品制备的一般程序一一 样品的前处理样品的前处理二二 样品的干燥样品的干燥四四 样品表面的导电处理样品表面的导电处理三三 样品装台（粘胶）样品装台（粘胶）生物电子显微技术生物电子显微技术（一）、样品的前处理一般过程（一）、样品的前处理一般过程 取材取材清洗清洗固定固定脱水脱水（二）、（二）、SEM与与TEM在前处理中的区别在前处理中的区别 1. 样品大，一般样品大，一般6100mm2,高厚高厚510mm, 对于易卷曲的样品可固定在硬纸板或卡片纸上。对于易卷曲的样品可固定在硬纸板或卡片纸上。 2. 特别注意表面清洁（生理盐水、缓冲液、特别注意表面清洁（生理盐水、缓冲液、 5%苏打水、超声波震荡、酶消化）苏打水、超声波震荡、酶消化） 3. 固定时间适当延长，除了戊二醛、锇酸、高固定时间适当延长，除了戊二醛、锇酸、高 锰酸钾外做固定液外，还有锰酸钾外做固定液外，还有Paleace，Dalton 固定液固定液 4. 脱完水时要用进入中间液进行置换。脱完水时要用进入中间液进行置换。一一 样品的前处理样品的前处理生物电子显微技术生物电子显微技术（三）思考题（三）思考题 在TEM与SEM样品制备过程中，SEM制样在脱水后需要进行特殊干燥处理，而TEM超薄切片中脱水后无需干燥处理，分析其中原因。从两方面考虑：1. 样品块的大小不同。2. SEM与TEM成像机理及观察样品的 特征区域不同。生物电子显微技术生物电子显微技术二二 样品的干燥样品的干燥（一）、（一）、 空气干燥法（自然干燥法空气干燥法（自然干燥法 ） 1. 基本描述基本描述 将经过脱水的样品，让其暴露在空气中将经过脱水的样品，让其暴露在空气中 使脱水剂逐渐挥发干燥使脱水剂逐渐挥发干燥 ，也可直接，也可直接(不脱不脱 水水)放在干燥器中干燥。放在干燥器中干燥。 2. 基本特点基本特点 优点：简便易行、节省时间优点：简便易行、节省时间 缺点：由于脱水剂挥发时表面张力的作缺点：由于脱水剂挥发时表面张力的作 用，组织块会而产生收缩变形用，组织块会而产生收缩变形 生物电子显微技术生物电子显微技术方法1：单固定或双固定脱水样品置于100的脱水剂中在空气中自然干燥；方法2：固定（组织导电处理）浸泡在缓冲液与乙醚的1：1中5min空气干燥；方法3：单固定或双固定乙醇脱水浸没于六甲基二硅胺烷HMDS中二次每次15min通风厨干燥1h3. 常用方法常用方法生物电子显微技术生物电子显微技术（二）、临界点干燥法（二）、临界点干燥法(CPD: critical point dryer)1. 基本含义基本含义： 临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。2. 基本特点基本特点 优点：避免表面张力的影响，较好地保存 样品的微细结构。操作较方便， 快速23小时即可完成，常用 缺点：需要特殊仪器设备-临界点干燥仪。生物电子显微技术生物电子显微技术3. 基本概念基本概念 临界点：临界点：物质的气态和液态两相之间物质的气态和液态两相之间达到相同密度、成为均一流体时的温度达到相同密度、成为均一流体时的温度和压力的总称。此时的温度称为临界点和压力的总称。此时的温度称为临界点温度，压力称为临界点压力。温度，压力称为临界点压力。 中间剂中间剂：把用来置换脱水剂而后又被：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。干燥剂所置换的液体。生物电子显微技术生物电子显微技术4. 常用干燥剂常用干燥剂干燥剂干燥剂丙酮、醋酸戊酯丙酮、醋酸戊酯生物电子显微技术生物电子显微技术5. 常用中间剂：常用中间剂： 中间剂：把用来置换脱水剂而后又被中间剂：把用来置换脱水剂而后又被 干燥剂所置换的液体。干燥剂所置换的液体。 试剂：醋酸（异）戊酯、丙酮试剂：醋酸（异）戊酯、丙酮6. 干燥过程：干燥过程： 固定脱水固定脱水转入中间液转入中间液移至样品移至样品 室室用液体用液体CO2置换醋酸异戊置换醋酸异戊 酯酯 CO2汽化排气汽化排气干燥干燥生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术7. CO2临界点干燥器工作原理临界点干燥器工作原理生物电子显微技术生物电子显微技术(1) 脱水不彻底脱水不彻底(2) 醋酸异戊酯反流醋酸异戊酯反流(3) 样表粘有过多醋酸异戊酯样表粘有过多醋酸异戊酯(4) 样品量过多样品量过多(5) 样品室温度高，注入样品室温度高，注入CO2困难注入困难注入 CO2量太少量太少(6) 样品室漏气样品室漏气8. 临界点干燥失败（不彻底）的原因临界点干燥失败（不彻底）的原因生物电子显微技术生物电子显微技术(1) 样品块过大样品块过大。组织块几何空间中心位置的水份无法经脱水、中间剂置换、CO2置换等过程除去，CO2也无法完全置换掉中间剂，造成样品内外部由液CO2（占9597）、中间剂醋酸异戊酯23样品中心位置游离态水份12组成，在充分达到CO2临界态的4045，压力1011MPa时，样品几何中心位置游离态水由液体气化为水蒸汽时(液态醋酸异戊酯由液体气化为蒸汽时）有表面张力的存在，从而使样品有少量变形(2) CO2放入或排出时放入或排出时 ,样表压力骤增减样表压力骤增减(3) 生物样品本身性质决定及临界点干燥生物样品本身性质决定及临界点干燥本身的缺陷本身的缺陷造成样品有少量变形9. 原因分析原因分析：经CO2临界点干燥之后 的样品仍有少量变形的原因？生物电子显微技术生物电子显微技术10. 干冰优点干冰优点 (1) 有利于微小样品的干燥有利于微小样品的干燥 (2) 无需钢瓶，搬运方便无需钢瓶，搬运方便 (3) 能准确放入足够的能准确放入足够的CO2量量 (4) 夏天使用方便夏天使用方便 (5) 不污染样品不污染样品生物电子显微技术生物电子显微技术玫瑰花瓣表面的SEM照片(850X)，CPD ( critical point dryer)干燥 玫瑰花瓣表面的SEM照片(850X)，风干凝固 生物电子显微技术生物电子显微技术（三）、冰冻干燥（三）、冰冻干燥1. 含水样品直接冷冻干燥含水样品直接冷冻干燥 常规常规步骤：步骤： 取材取材固定固定冷冻保护处理冷冻保护处理快速冷快速冷 冻冻升华（升华（10-2乇）干燥乇）干燥装台镀膜装台镀膜 基本特点基本特点： 无需脱水，不会使样品收缩，较早使无需脱水，不会使样品收缩，较早使 用的方法。但花费时间长，消耗液氮用的方法。但花费时间长，消耗液氮 多，易产生冰晶损伤，未被广泛应用多，易产生冰晶损伤，未被广泛应用. 基本描述基本描述：将经过冷冻的样品置于高真空：将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程的过程.生物电子显微技术生物电子显微技术 基本描述基本描述：样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到：样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到 某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂 一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。 基本特点：基本特点： 优点：可减少冰晶损伤，且干燥时间短。优点：可减少冰晶损伤，且干燥时间短。 缺点：有机溶剂对样品成分有抽提作用，缺点：有机溶剂对样品成分有抽提作用， 造成部分内含物丢失。造成部分内含物丢失。2. 样品脱水后的冷冻干燥样品脱水后的冷冻干燥生物电子显微技术生物电子显微技术 氟里昂氟里昂TF冷冻干燥冷冻干燥 固定脱水固定脱水置换置换(氟里昂取代酒精氟里昂取代酒精) 冷冻冷冻干燥干燥 乙醇冷冻干燥法 固定脱水冷冻干燥升温取样 乙腈(acetonitrile)真空干燥法： 基本描述：CH3CN，甲基氰，气化热很大， 冷却后会固化、升华，利用乙腈在急速 蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥。 一般流程： 固定漂洗乙腈脱水渗透升华干燥常用方法常用方法 生物电子显微技术生物电子显微技术氟氟里里昂昂TF冷冷冻冻干干燥燥生物电子显微技术生物电子显微技术乙腈真空干燥法乙腈真空干燥法生物电子显微技术生物电子显微技术（四）、从高熔点的有机材料中干燥（四）、从高熔点的有机材料中干燥1. 基本描述基本描述：选用高熔点的有机材料作为：选用高熔点的有机材料作为升华介质，既可以保留冷冻干燥的优点，升华介质，既可以保留冷冻干燥的优点，又可以不对样品进行冷冻处理，无冷冻损又可以不对样品进行冷冻处理，无冷冻损伤，还简化操作。伤，还简化操作。、莰烯干燥法、莰烯干燥法（1971 Wattens.Buk）取材双固定清洗脱水取材双固定清洗脱水置换置换(100苯脱脂、苯苯脱脂、苯和环氧丙烷和环氧丙烷1:1、纯环氧丙烷每次、纯环氧丙烷每次15min) 过过渡渡(莰烯莰烯40-45和环氧丙烷和环氧丙烷1:1)加纯莰烯加纯莰烯45，20min升华真空干燥升华真空干燥装台镀膜观察装台镀膜观察2. 基本方法基本方法：生物电子显微技术生物电子显微技术 叔丁醇干燥法叔丁醇干燥法 取材固定清洗乙醇脱水样品在100乙醇与叔丁醇的3：1、1：1、1：3、纯叔丁醇中各10min 纯叔丁醇4凝固 真空干燥镀膜观察2. 基本方法基本方法：生物电子显微技术生物电子显微技术三三 样品装台样品装台( (粘胶粘胶) )（一）、导电胶（一）、导电胶 适于：样品块大的组织块，能用较适于：样品块大的组织块，能用较 大的工具操作大的工具操作 类型：银导电胶，碳导电胶类型：银导电胶，碳导电胶（二）、双面胶带（二）、双面胶带 适于：细小颗粒（粉末、纤维、适于：细小颗粒（粉末、纤维、 薄片）薄片） 类型：碳双面胶带、铜、塑料片基类型：碳双面胶带、铜、塑料片基生物电子显微技术生物电子显微技术离子溅射（导电处理）的离子溅射（导电处理）的作用作用: 1.防止样品损伤和荷电效应 2.增加二次电子发射率，改善图像质量 3. 即排除原子序数效应的干扰。 导电处理的一般导电处理的一般方法方法： 1. 金属镀膜法 2. 组织导电法四四 样品表面的导电处理样品表面的导电处理离子溅射镀膜法真空镀膜法生物电子显微技术生物电子显微技术 样品荷电样品荷电效应说明图效应说明图生物电子显微技术生物电子显微技术AuC生物电子显微技术生物电子显微技术1. 概念概念：采用特殊装置将电阻率小的金属(Au,Pt,Ag,Pd)离子溅射或真空蒸发后覆盖在样品表面的方法。2. 作用：作用： (1) 消除荷电效应，提高二次电子发射率 增加信噪比，提高图像反差; (2) 提高样品表面的机械强度，增强样 品耐受电子的轰击能力; (3) 防止来自组织内部的信息参与成像。（一）、金属镀膜法：（一）、金属镀膜法：生物电子显微技术生物电子显微技术3. 对金属膜的要求对金属膜的要求 (1)膜的厚度要均匀,膜要薄,20nm左右 (2)膜本身无结构，或结构很细微 (3)二次电子发射率要高 (4)耐电子束的轰击，化学稳定性好4.具体方法具体方法 A. 离子溅射镀膜法离子溅射镀膜法 (1)离子溅射： 在低真空中进行辉光放电时，阴 极物质有飞散的现象。 (2) 离子溅射仪的作用离子溅射仪的作用： 离子溅射（0.010.1Torr） 离子蚀刻（要求高真空，高电压条件）生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术(3)离子溅射仪构造离子溅射仪构造： 真空部分:真空泵、真空钟罩、真空表、 进气阀 溅射部分： 金属靶：溅射时做阴极,蚀刻时做阳极 （金属: Au,Pt,Pd) 样品台：溅射时阳极，蚀刻时阴极 靶台距离调节器： 控制部分：电压调节器、电流表、定 时器，阳极阴极转换器A. 离子溅射镀膜法离子溅射镀膜法生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术(4) 离子溅射仪工作原理 放入样品抽真空加高压产生电场残余气体分子电离正粒子轰击金属靶激发金属颗粒金属颗粒依附于样品表面金属膜形成A. 离子溅射镀膜法离子溅射镀膜法生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术 溅射出来的金属颗粒小溅射出来的金属颗粒小,镀膜质地精细镀膜质地精细 镀膜薄厚均匀镀膜薄厚均匀 膜片厚度容易控制膜片厚度容易控制,不掩盖样品表面结构不掩盖样品表面结构, 节省金属材料节省金属材料 膜片附着力强膜片附着力强 受辐射热影响较小，对样品的损伤小。受辐射热影响较小，对样品的损伤小。 所需真空度低，节省时间所需真空度低，节省时间 金属粒子能够进入到样品表面的缝隙金属粒子能够进入到样品表面的缝隙 和凹陷处，对于表面凹凸不平的样品和凹陷处，对于表面凹凸不平的样品 也能形成很好的金属膜也能形成很好的金属膜A. 离子溅射镀膜法离子溅射镀膜法（5）离子溅射镀膜的特点）离子溅射镀膜的特点生物电子显微技术生物电子显微技术 (1) 原理:高真空下,使某些金属物质加热到熔点 以上,真空蒸发成极细的颗粒沉积到样 品表面,在样表形成薄金属膜. (2)仪器:真空喷镀仪(10-5Torr)B. 真空镀膜法真空镀膜法生物电子显微技术生物电子显微技术5. 离子溅射法与真空镀膜法比较离子溅射法与真空镀膜法比较项目离子溅射法真空镀膜法适宜真空度低0.01-0.1torr高105能否喷碳不能能镀膜附着力强弱膜厚度控制容易较难SE获取量较多一般样损伤程度小较大样品污染黑化污染无生物电子显微技术生物电子显微技术1. 1. 定义：定义： 组织导电法组织导电法:利用重金属盐溶液对生物体的蛋白质、脂肪及淀粉等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能很好的金属化合物，从而提高样品耐受电子轰击的能力和导电率。2.2.导电液应具备的条件导电液应具备的条件： (1) 能对组织染色 (2)组织结构保存完好 (3) 不污染样品 (4)不掩盖样品超微结构 (5) 导电性能好，消除荷电效应 (6) 二次电子发射率高，亮度大,图像反差强(二二)、组织导电法、组织导电法(导电染色导电染色)生物电子显微技术生物电子显微技术3 3、常用处理方法、常用处理方法 (1) 碘化钾碘化钾-碘导电染色法碘导电染色法： 碘化钾20g+碘0.2g+双蒸水100ml2.5% 戊二醛10ml+葡萄糖0.2g (2) 碘化钾醋酸铅导电法碘化钾醋酸铅导电法 A液：碘化钾 20g 碘0.2g,加双蒸水100ml B液：氢氧化钾4g 醋酸铅1.2g 加水至100ml 用时需稀释，1分母液3分水生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术（3）. 丹宁酸丹宁酸-锇酸导电法锇酸导电法:生物电子显微技术生物电子显微技术第三节第三节 特殊样品制备技术特殊样品制备技术一、直接观察法一、直接观察法二、活体观察法二、活体观察法六、样品的割断法六、样品的割断法七、蚀刻法七、蚀刻法八、铸型技术八、铸型技术三、粘贴镀膜观察法三、粘贴镀膜观察法四、熏蒸固定观察法四、熏蒸固定观察法五、石蜡组织切片观察法五、石蜡组织切片观察法九、树脂包埋的样品九、树脂包埋的样品SEMSEM观察法观察法生物电子显微技术生物电子显微技术一、直接观察法一、直接观察法2. 适用范围适用范围:适合于低倍条件下适合于低倍条件下, 观察含水观察含水量少的、表面有一定导电能力的、对分辨率量少的、表面有一定导电能力的、对分辨率要求不高的样品要求不高的样品.4. 适用样品适用样品: 植物干标本植物干标本,干种籽干种籽,干果、果干果、果壳壳,竹木、骨骼、牙齿、蛋壳、土壤、岩石、竹木、骨骼、牙齿、蛋壳、土壤、岩石、金属等金属等3. 基本步骤基本步骤:取材取材风洗水洗后风干或风洗水洗后风干或不洗不洗粘样粘样常压或低压观察常压或低压观察1.基本描述基本描述:样品不经过任何处理样品不经过任何处理,直接粘直接粘贴到样品托上入镜观察贴到样品托上入镜观察生物电子显微技术生物电子显微技术二、活体观察法二、活体观察法1. 基本描述基本描述： 利用样品本身具有的导电和产生二次电子的利用样品本身具有的导电和产生二次电子的 能力，直接观察一些体积较小、含水分不多能力，直接观察一些体积较小、含水分不多 的活体昆虫或新鲜组织、器官的方法。其的活体昆虫或新鲜组织、器官的方法。其特特 点点是：可观察生物活体形态结构和生活状态，是：可观察生物活体形态结构和生活状态， 图像表现真实，没有变形或人为附加结构。图像表现真实，没有变形或人为附加结构。2. 基本要求基本要求： 限制昆虫的爬行和跳跃，用胶带限制其活动。限制昆虫的爬行和跳跃，用胶带限制其活动。 样品体积尽可能小；样品体积尽可能小； 低压观察常用低压观察常用25Kv，最大，最大10Kv； 操作熟练，迅速观察尽早摄影操作熟练，迅速观察尽早摄影生物电子显微技术生物电子显微技术3. 基本步骤基本步骤： 取材取材清洗或不洗清洗或不洗胶带粘样胶带粘样 常压或低压观察常压或低压观察4. 适用样品适用样品： 螟、蛾、蚊、蚁、蜂、螨、线虫、螟、蛾、蚊、蚁、蜂、螨、线虫、 被粘牢固的昆虫或其器官被粘牢固的昆虫或其器官生物电子显微技术生物电子显微技术三、粘贴镀膜观察法三、粘贴镀膜观察法1. 基本描述基本描述： 样品只进行粘贴、镀膜即可。样品只进行粘贴、镀膜即可。 其其特点特点：常压观察下获得高分辨率高：常压观察下获得高分辨率高 放大倍数图像。放大倍数图像。2. 适用范围适用范围: 适宜适宜 观察表面细微结构丰富、观察表面细微结构丰富、 含水量含水量 少的、形态比较固定或不宜进行脱水或少的、形态比较固定或不宜进行脱水或 干燥的样品。本方法解决了样品的导电率干燥的样品。本方法解决了样品的导电率 及二次电子发射量的问题，可以常压下观及二次电子发射量的问题，可以常压下观 察高倍率、高分辨率图像察高倍率、高分辨率图像生物电子显微技术生物电子显微技术3. 基本步骤基本步骤： 取材取材粘样粘样镀碳（样品表面凹镀碳（样品表面凹凸变化大的可先喷镀碳层）凸变化大的可先喷镀碳层）金属金属膜膜 常压观察常压观察4. 适用样品适用样品: 成熟的孢子、花粉，生活状态的菌成熟的孢子、花粉，生活状态的菌体、菌落，尘埃、微小颗粒，丝绒、体、菌落，尘埃、微小颗粒，丝绒、毛发，表面凹凸变化大的样品，如昆毛发，表面凹凸变化大的样品，如昆虫体表等。虫体表等。生物电子显微技术生物电子显微技术四、熏蒸固定观察法四、熏蒸固定观察法1. 基本描述基本描述：粘贴后的样品放置于密闭容器中，：粘贴后的样品放置于密闭容器中，用熏蒸法进行固定，经镀膜或不镀膜即可观察。用熏蒸法进行固定，经镀膜或不镀膜即可观察。其其特点特点：该方法适合：该方法适合“不宜在液体中处理样品不宜在液体中处理样品”，蒸汽固定剂为，蒸汽固定剂为12的锇酸，全部操作在通的锇酸，全部操作在通风橱进行，高倍观察时还应离子溅射镀膜。风橱进行，高倍观察时还应离子溅射镀膜。2. 基本步骤基本步骤:取材取材粘样粘样熏蒸固定熏蒸固定(10-30min)镀膜或不镀膜镀膜或不镀膜常压或低压观察常压或低压观察3. 适用样品适用样品: 固定培养基上的培养物，用于固定培养基上的培养物，用于研究培养细胞的生长繁殖过程，菌落的自然研究培养细胞的生长繁殖过程，菌落的自然状态、菌丝的生长，孢子的形成等。状态、菌丝的生长，孢子的形成等。生物电子显微技术生物电子显微技术五、石蜡组织切片观察法五、石蜡组织切片观察法1. 基本描述基本描述：对动植物的石蜡切片进行：对动植物的石蜡切片进行适当处理，放在适当处理，放在SEM下观察。其下观察。其特点特点：图像分辨率高、景深大立体感强，制样图像分辨率高、景深大立体感强，制样简单、成本低、时间短。简单、成本低、时间短。2. 基本步骤基本步骤：光镜定位：光镜定位切片切片贴台贴台脱蜡脱蜡(二甲苯二甲苯,3-5min后滤纸吸附溶解物，后滤纸吸附溶解物，反复反复3-5次次)镀膜镀膜(或不镀膜或不镀膜)观察观察3. 适用样品适用样品：一切组织的石蜡切片都适用，：一切组织的石蜡切片都适用，但对已经封固或加盖片的不能用。但对已经封固或加盖片的不能用。生物电子显微技术生物电子显微技术六、样品的割断六、样品的割断（一）（一） 树脂割断法树脂割断法1. 环氧树脂冷冻割断法： 取材修样(115mm) 固定脱水 包埋置换固化割断样品脱树脂 临界点干燥装台粘胶生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术2. 苯乙烯树脂割断法苯乙烯树脂割断法 特点特点: a.包埋的树脂已聚合包埋的树脂已聚合,可长期保存可长期保存 b.割断时在室温下进行割断时在室温下进行 c.易割断较硬的组织易割断较硬的组织(骨骼骨骼,结缔组织结缔组织) 步骤步骤： 取材固定脱水取材固定脱水置换置换包埋包埋聚合聚合割割 断断脱树脂脱树脂醋酸异戊酯置换醋酸异戊酯置换临临 界点干燥界点干燥装台粘胶装台粘胶生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术 1. 无水乙醇冷冻割断法: 优点:制作时间短,不易弄脏容器 步骤:取材固定脱水100%乙醇包埋冰 冻固化冷冻裂断融化乙醇临界点 干燥装台粘胶 2. 70%乙醇冷冻割断 特点:经济简单,但不能人为确定断裂面 步骤:准备冷冻自然断裂冷冻干燥 装台喷金(二二) 有机溶媒割断法有机溶媒割断法生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术方法方法: (1)刀切刀切 (2)镊子掰开镊子掰开 (3)双面胶带法双面胶带法 (4)液氮冷冻割断液氮冷冻割断(三三) 干燥样品的割断干燥样品的割断生物电子显微技术生物电子显微技术七、蚀刻法七、蚀刻法1. 酶蚀刻法酶蚀刻法 利用酶的作用使细胞的一部分物质利用酶的作用使细胞的一部分物质 被蚀刻去掉被蚀刻去掉, 从而清楚的显示出另从而清楚的显示出另 外一部分结构。外一部分结构。如：利用链霉蛋白酶如：利用链霉蛋白酶(prorase)处理处理小麦的胚乳细胞，把包在外面的细小麦的胚乳细胞，把包在外面的细胞去掉，以观察淀粉的结构。胞去掉，以观察淀粉的结构。生物电子显微技术生物电子显微技术2.离子蚀刻法离子蚀刻法 使用离子溅射仪进行辉光放电使用离子溅射仪进行辉光放电时，用高速的阳离子冲击样品表时，用高速的阳离子冲击样品表面，剥离掉样品的成分，暴露样面，剥离掉样品的成分，暴露样品内部细微结构。品内部细微结构。 如：用该方法可以看到白细胞、如：用该方法可以看到白细胞、胰脏外分泌细胞的核表面结构，胰脏外分泌细胞的核表面结构，清楚看到核孔的分布状况。清楚看到核孔的分布状况。生物电子显微技术生物电子显微技术八、铸型技术八、铸型技术 1. 概念： 为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。 2. 常用的铸型剂： 甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，是理想的铸型剂。生物电子显微技术生物电子显微技术3. 用ABS制作血管铸型样品的一般步骤 灌流和注入铸型剂 腐蚀和清洗 显微解剖和剥制铸型 干燥和镀膜 生物电子显微技术生物电子显微技术九、环氧树脂包埋的样品九、环氧树脂包埋的样品SEMSEM观察法观察法1. 基本描述基本描述：环氧树脂包埋的样品切成半薄切片：环氧树脂包埋的样品切成半薄切片或超薄切片后，再将环氧树脂除去，在或超薄切片后，再将环氧树脂除去，在SEM下观下观察研究，可以对样品的细胞结构进行多种综合研察研究，可以对样品的细胞结构进行多种综合研究，得到更多的信息。究，得到更多的信息。2.常用溶剂常用溶剂：氢氧化钠饱和乙醇（或醚类、丙氢氧化钠饱和乙醇（或醚类、丙酮）容易可以溶解已经聚合的环氧树脂，将酮）容易可以溶解已经聚合的环氧树脂，将NaOH溶解于乙醇，饱和（溶解于乙醇，饱和（24），放置），放置23天，在此过程中产生氧自由基，溶液颜天，在此过程中产生氧自由基，溶液颜色由浅褐色变成金棕色，氧自由基可以打断色由浅褐色变成金棕色，氧自由基可以打断环氧树脂和酸酐间的酯连接，溶解环氧树脂。环氧树脂和酸酐间的酯连接，溶解环氧树脂。也可用也可用NaOH的冠醚溶液。的冠醚溶液。 生物电子显微技术生物电子显微技术3.操作步骤操作步骤： 解剖镜下除去环氧树脂中不感兴趣的部分。解剖镜下除去环氧树脂中不感兴趣的部分。 将组织块（或切片）放入合适的容器中，将组织块（或切片）放入合适的容器中， 其中加入溶解液其中加入溶解液NaOH的乙醇溶液的乙醇溶液510ml,1-4h 样品取出放入绝对乙醇样品取出放入绝对乙醇(或冠醚或冠醚)中彻底清洗组织中彻底清洗组织 临界点干燥临界点干燥 粘胶镀金属膜并观察。粘胶镀金属膜并观察。生物电子显微技术生物电子显微技术作业作业1、名词解释：临界点 离子溅射 中间剂 组织导电法 铸型技术2、SEM样品制备中，需要对样品进行干燥处理， 而在TEM样品处理过程中只须对样品脱水处 理，试分析其原因。3、SEM与TEM的样品前处理过程中操作方法有 何异同。4、制备SEM的样品有那些干燥方法？5、试简述临界点干燥仪的结构及其工作原理， 临界点干燥的主要步骤。6、临界点干燥仪中，使用干冰做干燥剂有何优点。生物电子显微技术生物电子显微技术7、样品表面的导电处理方法有那些？ 金属镀膜法的作用如何？对金属膜 有何要求？8、什么是组织导电法？对样品进行组织导 电处理后，是否需要进行喷涂黄金 层？组织导电液应具备的条件？9、简述离子溅射仪的工作原理、离子 溅射仪镀膜的特点，与真空镀膜法 相比较它有什么优点？生物电子显微技术生物电子显微技术陆地面花粉粒的剥离观察陆地面花粉粒的剥离观察生物电子显微技术生物电子显微技术花粉萌发孔形态花粉萌发孔形态生物电子显微技术生物电子显微技术甘蓝型油菜花粉观察甘蓝型油菜花粉观察生物电子显微技术生物电子显微技术花花粉粉内内壁壁原原生生质质体体的的表表面面生物电子显微技术生物电子显微技术向日葵花粉观察向日葵花粉观察生物电子显微技术生物电子显微技术蓖蓖麻麻生物电子显微技术生物电子显微技术普普通通小小麦麦生物电子显微技术生物电子显微技术水水稻稻生物电子显微技术生物电子显微技术菠菠菜菜与与萝萝卜卜生物电子显微技术生物电子显微技术大大麦麦花花粉粉生物电子显微技术生物电子显微技术蜀蜀葵葵生物电子显微技术生物电子显微技术木木槿槿生物电子显微技术生物电子显微技术管道破裂口形貌管道破裂口形貌生物电子显微技术生物电子显微技术破裂口附近内壁表面结构破裂口附近内壁表面结构生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术钢铁组织形态观察图a为一碳钢在退火状态下得到的珠光体的二次电子像图 b为用2%硝酸酒精腐蚀后的铸铁组织的二次电子图c为含碳钢高温淬火后得到的马氏体组织的二次电子像生物电子显微技术生物电子显微技术图a 解理台阶 图b 羽毛花样生物电子显微技术生物电子显微技术主要参考图谱主要参考图谱1.组织细胞冷冻复型电镜图谱 人民卫生，李文镇，19812.植物花粉剥离观察扫描电镜图解 科学出版，蓝盛银，19963.细胞生物学超微结构图谱 高等教育，汪德耀，19894.医学生物学电子显微镜图谱 科学出版，中国医学科学院，19785.金相图谱，水利电力，1986