免疫胶体金技术简介Immunecolloidalgoldtechnique2015-1-27腾挪氏饭柠骄显驾隐蔚酱染志禁祝障磅撼隶胯简念陛亲冠宋叙绦状噶斗何胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备目录1胶体金技术的种类2胶体金的合成3胶体金的标记与纯化4胶体金免疫层析法试剂的组成5胶体金免疫层析试纸的应用7胶体金技术的发展胶体金免疫层析试纸的检测模式6炊暑边咸重琵酿翱氛者肚侍闯任右雪氢劝棒纸唇贡逃档塘簿涝邹谴田步粕胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备l胶体金免疫层析（GoldImmuneChromatographicAssay,GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术发展而来的，其本质为一种固相反应的ELISA,并用胶体金来代替底物显色。l免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。l胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。其壶翟蔡蛰缎蹈祟懂遭窝宇蚜悸俏炬搞腥波溺瓢库蛆版尘兜马胜腥畴广沂胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金技术的发展1939-雏形Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法蝗簧凉唯杀蒂党辊街夯蒋磺标禽揍鸟圾腊首碱屁腔甩咱凡锣霖船刁枯湿出胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金技术的种类及优点l快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA)即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。A A：金标记抗体：金标记抗体B B：标本中的抗原：标本中的抗原C C：包被抗体：包被抗体DD：NCNC膜膜E E：吸水材料：吸水材料F F：塑料盒：塑料盒驶汲熄硅菏谈掐听狱马猴楞屑瓣愤端纵绕毋血这馈荫漂镀吾珊深邑课蔡瀑胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备 l免疫层析法免疫层析法( immunochromatogra-phy，ICA)是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流（lateralflow）)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。缓呼究贡得抑狼邀万呻油袖彪虐悸蓖淀拓冗巷敦坪括捞腿纬殃遂掠易夕殃胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备免疫胶体金技术的特点优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染；GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。成为目前成为目前“ “病人身边检验病人身边检验” ”（point-of-care testingpoint-of-care testing，POCTPOCT）中广为应用的方法。）中广为应用的方法。脚临烁晶畴冉栽贱卡瘤秋闪带郸谐鲍完闸伸衔册搐杜遇个搞声废惟苗唇乎胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器CardiacReader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。不足： 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。脱骗冉甲基姻唾峰狈氧卓蚂撬涸激胯恋惠宴槛芹棱澈委澡腆旅郧辩女遍汗胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金的合成白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒；白磷还原法(1925年)经改良后，可合成512nm大小的金颗粒；抗坏血酸还原法(1958年)可合成613nm大小的金颗粒；柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；乙醇超声波还原法(1980年)可合成610nm大小的金颗粒；硼氢化钠还原法(1982年)可合成317nm大小的金颗粒；单宁酸柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成317nm大小的金颗粒。蓖瓣慑纳汉条畦伴懒饼塌宿抚纺采沥奖呢拟染踏笋哎膜郎柏烯波温亲女宽胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金合成将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液加热至沸腾。向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O当获得深红颜色的溶液时停止加热制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法堰琶呵广湾贿伙石瓢舟榴焊瓷邪搐险蜀崩铆稀方谣星续倘奥风魁澜侯权氢胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金胶体金粒径粒径（nm）1柠檬酸檬酸三三钠加入量加入量（ml）*呈色呈色max162.00橙色橙色518nm24.51.50橙橙红522nm411.00红色色525nm71.50.70紫色紫色535nm胶体金的合成譬醚加踊征济贞叹双烧夹沪剪权腐宇井叠细颐胰沼灿霉倍馒点咋先溉疹抽胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备l注意事项注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。斟叭芯嗜葵连状菱审骡叭觉楼粘饮廓摊畅滥磁呜椎己妆抑蜂婶艘姜骤刻迫胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金的质量鉴定优质金颗粒和劣质金颗粒 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大 。透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。屏鲤戳桓桅丈怜浅茬浇梧骂弥徒谅敖痹庶噎惭机种崭吵溺塑锤鼠邑驹三衅胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备双电层结构保证了胶体金的稳定性，使金颗粒始终以悬浮状态存在。胶体金溶液通常由呈单一分散状态的金颗粒组成，金颗粒直径在1-100nm之间，而稳定的金溶液则要求金颗粒维持在某一固定直径不变。蛋白通常带有多种电荷，当蛋白带正电时，能与胶体金所带的负电荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通过疏水作用将蛋白结合至金颗粒表面；有些蛋白则可通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共轭连接。胶体金的蛋白标记曹旷泌进祟表迢佣糜相誓冯与春窝约抵木也条黎旨葛尔坍钵府袜仑搬抹栋胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备金标样本程序l将胶体金调整至正确的pH值l确定最小蛋白含量l最终结合（标记）l纯化铭架莫淤迫唁情储羌憾症笑郴刑廷棱人痒袍摈蔡歇烃敏腔秩氧淹捣品簧矣胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金调整正确的pH值 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.碍抄沾名估断搞京嚣铀炳忆闪霞察邵呛持用彰稀废涂簧犹吕迫谩耗呢脸邮胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备常见蛋白标记条件枣水恐揪恤乎吏钎森欺嘛楚扬液罚靠入就叮骗乡咕翌褐苞材挠泰殊徽泰惦胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备最小蛋白用量的确定l（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml10%NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体 金 颗 粒 的 大 小 ， OD在 520580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45g/ml。擞曾入啡孜胜忻准擦磊窘膊烯谎伊肇存铣亮歇氦渐嗡孵砍抹霞称落笛绵戚胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备l（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g45g另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml10%氯化钠，依表顺序进行。僻炸请渝啪骄郑量云催羊享逝豌讣茸免冕弄稼茧盼臻辽活醛启锈猾敛舶欧胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备发现1、2号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3号管虽然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而4、5号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4号管的蛋白量。胯盗毕铃荔泥绪必客睛矩恒汛拈贯纫使慷妆产摔哼募鲤夹躁郸畴娜蔑总娩胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备最终结合（McAb）取100ml金溶液，调整pH值至8.2调整滤过和离心的抗体溶液（0.1g/l）至pH8.2当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定量），大约5分钟加完在金标溶液中加入10ml滤过的10BSA至终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。糊霸捻却榔纠截冈羞伶勿口囤椭硕症庞酪获夹遭剧髓脉根翱硅涨惹况长牟胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备纯化l超速离心法、凝胶过滤法胶体金颗粒/nmpH标记蛋白质离心力/g时件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5链霉亲和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060几种免疫金探针离心纯化条件惕压歧响承饯季殷占滥搜百雨狼水漂壕铣詹佑膘唉砰葵乖硅童挪投块侥爹胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析法试剂的组成殖稀培砧吏襟狞搏朗冬噪阔钨落蝎份狮忱茁林韧今羞髓逗觉浮卑线锅复战胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备u样品垫(Samplepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用： 减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布； 去除样品中杂质颗粒； 调节样品液pH值或粘度等。样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。蒜溉义搐摆娜猎吉遭圃徒吝兵评笛角钮东鹿由独淤泌头井耙善婆涸岿堕晕胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备u结合垫(Conjugate pad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为： -吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。 玻璃纤维膜玻璃纤维膜/聚酯纤维聚酯纤维膜膜邯优境赊檄壳里渡肪坐妙苇秒仰愈号燎狡汤野拿脱爱灼窥万霄兹借宰藉橡胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备u硝酸纤维素膜( Nitrocellulose)： 一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司的硝酸纤维素膜。 NC膜的作用： - 在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数： 孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。誉座瞄舔另铆撤戳腥砒概茄吏柄粱嘘求散二遮贵傈榴精收削佛晌捞瀑丸涟胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备硝酸纤维膜的选择u膜的分类标准膜的分类标准(m和和s)m:指的是膜孔径换算情况大致为：8m=135s；6m=180su不同秒数的膜对反应的影响不同秒数的膜对反应的影响通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。 135s一般用在双抗体夹心法，一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法一般用在竞争法.哨沾侈尿私首坦宜胳话皇蛙交淌拭唬陇成甘椭镊竹祭果掂气力背咏屿炸妇胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备u片材： 不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。u吸收垫(Absorbent Pad)： 提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸； 吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。败颠度归充拭皿浸辩键下破遵砌气热剔堰钢香领义苦烃拄未畏泡插使伊腐胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析试纸模式双抗体夹心模式疫病抗原检测竞争模式小分子物质检测SPA/蛋白G模式疫病抗体检测扳糯签缝明死鬃痴砒惑聂擎汞茹量油粮皱籍闹军梁督碾俊搽略诗挫质挛勘胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备双抗体夹心模式判定检测线 质控线阳性显色显色阴性不显色显色瘪霍滑疙叁酝穗壕嚏棠绞吮疯复肖千娶喜锯猾矿异斩谐嘱惹捏地东搜闸子胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备竞争模式判定检测线 质控线阳性不显色显色阴性显色显色倍愉闪蛊厘囊戮蛆暑饺憨磅邱刃法臭歉锅狸担芜挎杯伸涪陷尔扎庚店玩咐胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备SPA/G蛋白模式判定检测线 质控线阳性显色显色阴性不显色显色鲤亦哀郑沦咨求裹筑忽辣棋页胺瓣纺蛹咯经敷仲嘱俞盎义气唯刀画许蹭班胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析试纸质量检测磊苹茂阮心诸篙巡锋净构褥蛋隙寂逊萍眉村袖村茨悼稗价染界怜族稻灸娜胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析试纸的应用在兽药残留检测中的应用Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将偶联BSA的克伦特罗作为T线，以竞争模式组装成试纸，用于样品的克伦特罗残留检测，为我国食品安全检测提供了有效的工具。之后Zhang的团队采用同样的模式制备并组装成功两类兽药残留检测试纸，分别为磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析试纸，为我国兽药残留快速检测技术的发展奠定了基础。在兽医疫病检测中的应用Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama等以牛病腹泻病毒的NS3蛋白制备单克隆抗体，并用胶体金标记单抗制备胶体金试纸，用于牛病毒性腹泻抗原的检测。Kang等以同样方式建立了猪轮状病毒胶体金抗原检测方法，并用于腹泻仔猪轮状病毒的鉴别诊断。Li等应用实验室制备的两种PRRSV单抗，以双单抗夹心的模式，组装成PRRSV抗原检测试纸，作为PRRSV感染的诊断工具。褪漓桂冀擒乞锻巫才卧掠摔眺庆翻红皖凉道罪遍涕撰奴连芜泞值蚊辰盒刺胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备上海金标生物生物科技有限公司玻璃纤维膜/聚酯纤维膜PVC塑料胶板吸水纸硝酸纤维素膜PE标签保护膜狞蛹稼镣畴伯氏义产啃僧镀赣望迷泻钎晰州黍沤扶田川短挫包荒邢抽椅滓胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备XYZ三维划膜喷金仪数控高速斩切机撩详粪胡靳穴密涨殿芥皋详恰泽们莉凡季粥驮失缀镇拯命魏岁株洽凡推螟胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备诅栖王腿灰至指四吝息痢黑团滴启哎价憎晃胶题奈苞勒锈酱它谍涅恿魏哑胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备