第四章第四章 实验动物质量控制实验动物质量控制实验动物微生物及寄生虫学质量控制实验动物微生物及寄生虫学质量控制实验动物遗传学质量控制实验动物遗传学质量控制实验动物环境质量控制实验动物环境质量控制实验动物营养学质量控制实验动物营养学质量控制第一节第一节 实验动物分级及特点实验动物分级及特点一、从微生物控制方面分级一、从微生物控制方面分级(1)(1)普通动物普通动物(conventional animal, CV)(conventional animal, CV)(2)(2)清洁动物清洁动物(cleaning animal, CL)(cleaning animal, CL)(3)(3)无无 特特 定定 病病 原原 体体 动动 物物 (specific (specific pathogen pathogen free animal, SPF)free animal, SPF)(4)(4)悉悉 生生 动动 物物 ( (animal animal with with known known bacterial bacterial floraflora) )(5)(5)无菌动物无菌动物(germ free animal ,GF)(germ free animal ,GF)1 1、按微生物学控制的动物分类、按微生物学控制的动物分类2 2、国际分级法、国际分级法等级等级种类种类饲养条件饲养条件控制程度控制程度备注备注三级三级无菌动物无菌动物Germfreeanimal隔离系统隔离系统Isolationsystem以封闭的无菌技术获得以封闭的无菌技术获得,用用现有方法不能检出任何微现有方法不能检出任何微生物和寄生虫的动物。生物和寄生虫的动物。三级三级悉生动物悉生动物Gnotobioticsanimal隔离系统隔离系统Isolationsystem确知已带的微生物，经无确知已带的微生物，经无菌条件饲养的动物。菌条件饲养的动物。明确所带的微明确所带的微生物。生物。二级二级无特定病原体无特定病原体动物动物Specificpathogenfreeanimal屏障系统屏障系统Barriersystem不带有指定的致病性微生不带有指定的致病性微生物和寄生虫的动物。物和寄生虫的动物。带有非特定的带有非特定的微生物和寄生微生物和寄生虫虫一级一级普通动物普通动物Conventionalanimal开放系统开放系统Opensystem不携带所规定的人兽共患不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病病病原和动物烈性传染病的病原。的病原。对微生物携带对微生物携带状况不明确状况不明确3、国家标准分级、国家标准分级等级等级种类种类饲养条件饲养条件四级四级无菌动物无菌动物GermfreeanimalGF隔离系统隔离系统Isolationsystem四级四级悉生动物悉生动物GnotobioticsanimalGN隔离系统隔离系统Isolationsystem三级三级无特定病原体动物无特定病原体动物SpecificpathogenfreeanimalSPF屏障系统屏障系统Barriersystem二级二级清洁动物清洁动物CleananimalCL屏障系统屏障系统Barriersystem一级一级普通动物普通动物ConventionalanimalCV开放系统开放系统Opensystem二.主要动物特点及应用1.1.清洁动物与清洁动物与SPFSPF动物的应用动物的应用CLCL动物国际上认为仅适合短期或部分科研实动物国际上认为仅适合短期或部分科研实验；我国认为适用于大多数科研实验，可用验；我国认为适用于大多数科研实验，可用于生物医学研究的各领域。于生物医学研究的各领域。SPFSPF动物适用于所有科研实验，是目前国际标动物适用于所有科研实验，是目前国际标准级别的实验动物。准级别的实验动物。2 2、无菌动物的特点、无菌动物的特点形态学改变形态学改变1.1.消化系统消化系统: : 盲肠膨大，易发生盲肠扭转，导致破裂。盲肠膨大，易发生盲肠扭转，导致破裂。2.2.循环系统：心脏变小。循环系统：心脏变小。3.3.免疫系统：胸腺上皮细胞变大，胞浆泡状结构和溶酶体变小。免疫系统：胸腺上皮细胞变大，胞浆泡状结构和溶酶体变小。生理学改变生理学改变1.1.免疫功能：免疫应答慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以免疫功能：免疫应答慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。对微生物感染非常敏感。及自身免疫现象消失或减弱。对微生物感染非常敏感。2.2.生长率：豚鼠、兔生长率降低，大、小鼠改变不大。生长率：豚鼠、兔生长率降低，大、小鼠改变不大。3.3.代谢：水分代谢周期延长，肠管对水的吸收率低。代谢：水分代谢周期延长，肠管对水的吸收率低。4.4.营养：体内不能合成营养：体内不能合成VitBVitB、VitKVitK。5.5.抗辐射能力：增强。抗辐射能力：增强。6.6.寿命：长于普通动物。寿命：长于普通动物。3 3、悉生生物学、悉生生物学(gnotobiology)(gnotobiology)： 1885 1885年年pasteurpasteur认为宿主动物没有肠道菌认为宿主动物没有肠道菌群参与，生命难以维持。无菌动物的问世，证群参与，生命难以维持。无菌动物的问世，证明肠道菌群的存在，并非完全是哺乳动物生存明肠道菌群的存在，并非完全是哺乳动物生存所必需。所必需。 悉生生物学是以无菌隔离技术提供的各种悉生生物学是以无菌隔离技术提供的各种动物为实验对象，研究实验动物本身以及各种动物为实验对象，研究实验动物本身以及各种动物与微生物之间相互依存和制约关系的一门动物与微生物之间相互依存和制约关系的一门综合科学。综合科学。悉生动物的特点悉生动物的特点1.1.（1 1）GNGN动物是动物与微生物的共生复合体。动物是动物与微生物的共生复合体。2.2.（2 2）肠道存在能合成维生素和氨基酸的细菌，不会）肠道存在能合成维生素和氨基酸的细菌，不会出现维生素缺乏症。出现维生素缺乏症。3.3.（3 3）生活力、抵抗力明显增强，易于饲养。）生活力、抵抗力明显增强，易于饲养。4 4、GFGF动物的应用动物的应用微生物研究微生物研究（1 1）GFGF是研究微生物与宿主相互作用，即微生生是研究微生物与宿主相互作用，即微生生物与宏生生物相互关系，微生物与微生物的共物与宏生生物相互关系，微生物与微生物的共生与拮抗关系的最佳动物。生与拮抗关系的最佳动物。（2 2）口服）口服霍乱弧菌霍乱弧菌使幼龄使幼龄GFGF豚鼠死亡，口服前感豚鼠死亡，口服前感染染梭状芽胞杆菌梭状芽胞杆菌，动物不发生死亡；口服，动物不发生死亡；口服福氏福氏痢疾杆菌痢疾杆菌使幼龄使幼龄GFGF豚鼠死亡，口服前接种豚鼠死亡，口服前接种大肠大肠杆菌杆菌，动物不发生死亡。，动物不发生死亡。（3 3）炎症涉及细菌感染的多因素作用，）炎症涉及细菌感染的多因素作用，GFGF可把多可把多因素变成单因素，整体反应变成局部反应因素变成单因素，整体反应变成局部反应。老年学研究老年学研究1.1. GFGF大鼠寿命比大鼠寿命比CVCV大鼠延大鼠延长长1/31/3。2.2. 雌性雌性GFGF寿命比雄性动物寿命比雄性动物短，雌性短，雌性CVCV动物比雄性长。动物比雄性长。3.3. 2-32-3年的年的GFGF大鼠脏器均未大鼠脏器均未呈现同龄呈现同龄CVCV大鼠所具有的各种大鼠所具有的各种衰老变化。衰老变化。肿瘤学研究肿瘤学研究1.1.在致癌因素中，微生物引起癌变的比重较大。在致癌因素中，微生物引起癌变的比重较大。2.2.GFGF大鼠比大鼠比CVCV大鼠易发生激素依赖性肿瘤。大鼠易发生激素依赖性肿瘤。3.3.GFGF动物口服苏铁素不出现肿瘤，但动物口服苏铁素不出现肿瘤，但CVCV动物口服苏铁动物口服苏铁素出现肿瘤。素出现肿瘤。三三. . 按遗传学控制分类按遗传学控制分类 近交系近交系(inbred strain)(inbred strain) 封闭群（封闭群（closed colonyclosed colony）或）或远交系远交系(outbred stock)(outbred stock) 杂交群杂交群(hybrids)(hybrids)（一）近交系的应用（一）近交系的应用1 1遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，只需用少量的动物，即可得到非常规律的实验结果。只需用少量的动物，即可得到非常规律的实验结果。2 2组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织细胞和肿瘤移植实验中最为理想的材料。组织细胞和肿瘤移植实验中最为理想的材料。3 3明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对某些因子敏感和耐受等，这些特点在医学研究中是天然某些因子敏感和耐受等，这些特点在医学研究中是天然模型，非常重要。模型，非常重要。4 4多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项实验的不同反应与影响，还可观察实验结果是否具有普实验的不同反应与影响，还可观察实验结果是否具有普遍意义。遍意义。（二）封闭群的特征及应用（二）封闭群的特征及应用1 1封封闭闭群群动动物物的的遗遗传传组组成成具具有有很很高高的的杂杂合合性性，在在遗遗传传学学上上可可作作为为选选择择实实验验的的基基础础群群体体，用用于于某某些些性性状状遗遗传传的的研研究究。用于药物筛选和毒性试验等。用于药物筛选和毒性试验等。2 2封封闭闭群群动动物物具具有有较较强强的的繁繁殖殖力力和和生生活活力力，表表现现为为每每胎胎产产仔仔多多，胎胎间间隔隔短短，仔仔鼠鼠死死亡亡率率低低等等、生生长长快快、成成熟熟早早、对对疾疾病病抵抵抗抗力力强强、寿寿命命长长、生生产产成成本本低低优优点点。因因而而广广泛泛应应用用于预实验、学生教学等实验中。于预实验、学生教学等实验中。3 3突突变变种种所所携携带带的的突突变变基基因因通通常常导导致致动动物物在在某某些些方方面面的的异异常，从而可成为生理学、胚胎学和医学研究的模型。常，从而可成为生理学、胚胎学和医学研究的模型。（三）杂交一代动物的特征及应用（三）杂交一代动物的特征及应用 1 1遗传和表型上的一致性遗传和表型上的一致性 2 2杂交优势杂交优势 3 3杂合的遗传组成杂合的遗传组成 4 4作为某些疾病研究的模型作为某些疾病研究的模型 一、微生物和寄生虫感染的危害性一、微生物和寄生虫感染的危害性 1 1影响实验结果影响实验结果 实验动物的微生物和实验动物的微生物和寄生虫感染可不同程度干扰实验结果，从寄生虫感染可不同程度干扰实验结果，从而影响研究工作的准确性和可靠性，甚至而影响研究工作的准确性和可靠性，甚至得出错误的结论。隐性感染常导致动物生得出错误的结论。隐性感染常导致动物生理生化指标的改变，使实验得不到应有的理生化指标的改变，使实验得不到应有的结果。或因实验处置，动物抵抗力下降，结果。或因实验处置，动物抵抗力下降，使隐性感染显性化，导致疾病的发生。使隐性感染显性化，导致疾病的发生。 第二节第二节实验动物微生物与寄生虫学实验动物微生物与寄生虫学质量控制质量控制2 2影影响响动动物物生生产产 某某些些烈烈性性传传染染病病如如鼠鼠痘痘、兔兔出出血血症症、犬犬细细小小病病毒毒性性肠肠炎炎等等的的流流行行，可可导导致致动动物物大大批批死死亡亡或或质质量量下下降降，从从而而给给动动物物的的生生产产和和实实验验的的正正常常进进行行带带来来严重影响。严重影响。3 3威威胁胁人人类类健健康康 许许多多人人兽兽共共患患性性疾疾病病对对饲饲养养和和研研究究人人员员的的健健康康构构成成威威胁胁。特特别别是是那那些些在在动动物物呈呈隐隐性性感感染染、而而对对人人类类呈呈致致死死性性感感染染的的病病原原微微生生物物（如如流流行行性性出出血血热病毒），应引起我们高度重视。热病毒），应引起我们高度重视。4 4污污染染实实验验材材料料 如如病病原原微微生生物物污污染染了了细细胞胞培培养养物物、肿肿瘤瘤移移植植物物或或以以动动物物组组织织和和细细胞胞为为生生产产原原料料的的生生物物制制品品，不不仅仅干干扰扰实实验验，而而且且还还可可将将病病原原扩扩散散，以以至至危危害害人人类类的健康。的健康。 5. 5.实验动物感染寄生虫后不仅虫体对机体造成实验动物感染寄生虫后不仅虫体对机体造成一定的损害，而且动物机体也对虫体产生反应，一定的损害，而且动物机体也对虫体产生反应，使动物机体的生理、生化及免疫学指标发生改使动物机体的生理、生化及免疫学指标发生改变，从而影响实验结果。变，从而影响实验结果。1 1）掠夺宿主的营养：）掠夺宿主的营养：2 2）体外寄生虫对动物的骚扰：）体外寄生虫对动物的骚扰：3 3）对宿主机体产生机械性损伤：）对宿主机体产生机械性损伤：4 4）对宿主产生毒性作用：）对宿主产生毒性作用：5 5）对宿主生理、生化和免疫系统的影响。）对宿主生理、生化和免疫系统的影响。二、实验动物常见感染性疾病二、实验动物常见感染性疾病 重要的人兽共患病 主要的烈性传染病 常见的微生物和寄生虫感染1 1、重要的人兽共患病、重要的人兽共患病（1 1） 流行性出血热流行性出血热（2 2） 弓形虫病弓形虫病（3 3） 淋巴细胞脉络从脑膜炎淋巴细胞脉络从脑膜炎（4 4） 沙门菌病沙门菌病（5 5） 狂犬病狂犬病（6 6） 猴猴B B病毒感染病毒感染（7 7） 猴结核病猴结核病疾病疾病病原病原媒介动物媒介动物人类临床症状人类临床症状传染途径传染途径猴疱疹病毒感染猴疱疹病毒感染(B-Virusinfection)cercopithecineHerpesvirusType1猕猴类猕猴类肌肌痛痛、发发热热、头头痛痛；迅迅速速发发展展的的上上行行性性麻麻痹痹；感感觉觉异异常常、复复视视、运运动动失失调调、潴潴尿尿、抽抽搐搐、吞咽困难，直至死亡吞咽困难，直至死亡唾液唾液(咬伤咬伤)、抓伤、抓伤出出 血血 热热 (Korean hemorrhagic fever)HantaanVirus大鼠、小鼠大鼠、小鼠肌肌痛痛、咳咳嗽嗽，发发热热、腹腹泻泻、出出血血、蛋蛋白白尿尿、肾肾脏脏损损害害，严严重重致死致死吸吸入入感感染染、啮啮齿齿类类动动物物咬伤、伤口污染咬伤、伤口污染淋淋巴巴细细胞胞脉脉络络丛丛 脑脑膜膜炎炎病病毒毒感感染染症症 (LCM)Lyphocytic choriomeningitis virus小鼠、仓鼠小鼠、仓鼠类类似似流流行行性性感感冒冒的的症症状状，头头痛痛、肌肌痛痛、发发热热、恶恶心心、呕呕吐吐、喉喉痛、畏光。痛、畏光。接接触触感感染染(接接触触小小鼠鼠粪粪便便和和尿尿液液)；吸吸入入；咬咬伤伤，或或由由节节肢肢动动物物如如蚊蚊子子、蟑螂传播蟑螂传播狂犬病狂犬病 (Rabies)Rhabdovirus所有哺乳类所有哺乳类头痛、肌痛、发热、恐水、狂头痛、肌痛、发热、恐水、狂妄、抽搐、昏厥、死亡妄、抽搐、昏厥、死亡咬伤、皮肤伤口或黏膜咬伤、皮肤伤口或黏膜感染含狂犬病毒的唾液感染含狂犬病毒的唾液结核病结核病(Tuberculosis)Mycobacteriumtu-berculosis犬、猫、猴犬、猫、猴 咳咳嗽嗽、生生痰痰、咳咳血血、体体重重减减轻轻、无无力力疲疲倦倦、发发热热、发发冷冷、恶恶病病质质 吸吸入入传传染染，或或经经口口腔腔、伤口及消化道感染伤口及消化道感染 弓形虫病弓形虫病toxoplasmosis猫猫、猪猪、羊羊、狗、鼠等狗、鼠等导致自然流产、死胎、早产和导致自然流产、死胎、早产和新生儿严重感染新生儿严重感染，后天：局限，后天：局限性感染以淋巴结炎最为多见性感染以淋巴结炎最为多见；全身性感染多见于免疫缺损者全身性感染多见于免疫缺损者（爱滋病、恶性肿瘤）（爱滋病、恶性肿瘤）先天性弓形虫病系通先天性弓形虫病系通过胎盘传染过胎盘传染，后天获后天获得性弓形虫病主要经口得性弓形虫病主要经口感染感染沙沙 门门 氏氏 菌菌 病病 (Salmonellosis)Salmonellatyphimu-riumSenteritidis鼠鼠类类、犬犬、猫、灵长类猫、灵长类急急性性肠肠胃胃炎炎，腹腹痛痛、腹腹泻泻、恶恶心、发热、厌食心、发热、厌食经由食物、饮水感染经由食物、饮水感染2 2、主要的烈性传染病、主要的烈性传染病（1 1）鼠痘）鼠痘（2 2）兔出血症（兔瘟）兔出血症（兔瘟）疾病疾病病原病原症状症状传播方式传播方式控制控制小小鼠鼠脱脱脚脚病病(ectromelia)Mousepoxvirus脚、尾、鼻出现皮疹和溃疡，脚、尾、鼻出现皮疹和溃疡，严重出现尾坏死脱落。严重出现尾坏死脱落。皮皮肤肤伤伤口口、呼呼吸吸道道、消化道消化道兔兔 出出 血血 症症RabbithemorrhagicdiseaseRabbithemorrhagicdiseasevirus病兔精神沉郁，食欲不振或病兔精神沉郁，食欲不振或废绝，饮欲增加，被毛零乱、废绝，饮欲增加，被毛零乱、无光泽，兔耳耷拉。幼兔多无光泽，兔耳耷拉。幼兔多呈急性型，通常看不到临床呈急性型，通常看不到临床症状，突然死亡。症状，突然死亡。 病病兔兔的的排排泄泄物物及及污污染染物物等等，空空气气传传播播是主要传播方式。是主要传播方式。3 3、常见的微生物和寄生虫感染、常见的微生物和寄生虫感染（1 1）鼠肝炎病毒感染）鼠肝炎病毒感染（2 2）仙台病毒感染）仙台病毒感染（3 3）鼠肺支原体病）鼠肺支原体病（4 4）嗜肺巴斯德杆菌病）嗜肺巴斯德杆菌病（5 5）小鼠呼肠孤）小鼠呼肠孤3 3型病毒感染型病毒感染（6 6）球虫病）球虫病（7 7）犬细小病毒感染）犬细小病毒感染（8 8）犬瘟热）犬瘟热三、实验动物的微生物和寄生虫控制国家标准三、实验动物的微生物和寄生虫控制国家标准 不不同同等等级级啮啮齿齿类类、兔兔、犬犬和和猴猴等等实实验验动动物物要要求求排排除除的的细细菌菌、病病毒毒应应根根据据国国家家技技术术监监督督局局制制定定的的有有关关实实验验动动物物微微生生物物学学等等级级及及监监测测标标准准(GB14922.22001)(GB14922.22001)。有有关关实实验验动动物物寄寄生生虫虫学等级及监测标准是学等级及监测标准是(GB14922.12001)(GB14922.12001) 。 四四、实验动物的微生物学和寄生虫学质量监测、实验动物的微生物学和寄生虫学质量监测 （一）监测的意义（一）监测的意义 实实施施微微生生物物学学与与寄寄生生虫虫学学监监测测，是是保保证证实实验验动动物物质质量量及及标标准准化化的的必必要要手手段段。通通过过监监测测可可掌掌握握动动物物群群中中病病毒毒、细细菌菌、寄寄生生虫虫的的流流行行情情况况，及及时时诊诊断断感感染染性性疾疾病病，发发现现并控制其传播，以保证实验动物的健康。并控制其传播，以保证实验动物的健康。 （二）监测的内容（二）监测的内容 不不同同级级别别实实验验动动物物的的微微生生物物和和寄寄生生虫虫监监测测内内容容不不同同。国国家家 技技 术术 监监 督督 局局 制制 定定 了了 标标 准准 (GBl4922.12001(GBl4922.12001和和GBl4922.22001) GBl4922.22001) 。 （三）检验方法（三）检验方法 目目前前国国标标推推荐荐使使用用的的方方法法学学和和详详细细检检验验程程序序。病病原原菌菌以以分分离离培培养养鉴鉴定定为为主主，病病毒毒以以检检测测抗抗体体为为主主，寄寄生生虫虫以以镜检为主。镜检为主。实验动物微生物及寄生虫监测监测程序：监测程序：1. 微生物检测程序 分离血清，检查病 毒抗体或其它病原的抗体 气管分泌物，肠内容物 脏器分离细菌 真菌检查动物编号外观检查麻醉皮肤取样取血无菌解剖检测检测报告（四）检验程序（四）检验程序（四）检验程序（四）检验程序2. 寄生虫检测程序 弓形虫检测 体外寄生虫检测 体内寄生虫检测 体外寄生虫检测动物编号外观检查麻醉拔毛或梳毛取血挤压或刀片刮取皮层物取样检测检测报告解剖、脏器、肠内容物、粪便取样取样要求与监测规则：取样要求与监测规则：1. 1. 普通动物、清洁级动物和无特定病原体动物普通动物、清洁级动物和无特定病原体动物 每三个月至少检测一次。每三个月至少检测一次。2. 2. 无菌动物每年至少检测一次。无菌动物每年至少检测一次。3. 3. 每每2-42-4周检测一次粪便标本。周检测一次粪便标本。实验动物不同生产繁殖单元取样数量实验动物不同生产繁殖单元取样数量群体大小，只取样数量5005只10只20只 每个隔离器检测2只取样应在每一生产繁殖单元的不同方位（如四角和中央）取样应在每一生产繁殖单元的不同方位（如四角和中央）选取动物。动物的送检容器应按动物级别要求编号和标选取动物。动物的送检容器应按动物级别要求编号和标记，包装好后安全送达检测实验室，并附送检测单，写记，包装好后安全送达检测实验室，并附送检测单，写明送检动物的品种品系、级别、数量和检测项目。明送检动物的品种品系、级别、数量和检测项目。检测项目的分类检测项目的分类国标对必须检测和必要时检测作了限定性说明：国标对必须检测和必要时检测作了限定性说明：“必须检测项目必须检测项目：是指在进行实验动物质量评价时：是指在进行实验动物质量评价时必须检测的项目。必须检测的项目。必要时检测项目必要时检测项目：是指从国外：是指从国外引进实验动物时、怀疑有本病流行时、申请实验引进实验动物时、怀疑有本病流行时、申请实验动物生产许可证和实验动物质量合格证时必须检动物生产许可证和实验动物质量合格证时必须检测的项目测的项目”。监测方法：监测方法：1. 1. 实验动物病毒检测：实验动物病毒检测：1 1）血清学诊断：血清学诊断：血凝抑制试验（血凝抑制试验（HIHI）；酶联免疫吸附试）；酶联免疫吸附试验（验（ELISAELISA）。）。2 2）病原学检查：病原学检查：a.a.接种细胞培养物观察接种细胞培养物观察CPECPE出现（鼠痘、鼠肝炎）；血出现（鼠痘、鼠肝炎）；血吸附试验（仙台病毒）；免疫酶试验（吸附试验（仙台病毒）；免疫酶试验（LCMLCM病毒）。病毒）。连续三次传代未有病毒迹象为阴性。连续三次传代未有病毒迹象为阴性。b.b.接种敏感动物，观察发病、抗体产生、病理改变、接接种敏感动物，观察发病、抗体产生、病理改变、接种动物病毒再分离。种动物病毒再分离。c.c.动物组织细胞传代培养。动物组织细胞传代培养。3 3）病毒颗粒、抗原和核酸的检出病毒颗粒、抗原和核酸的检出a.a.光镜检查病理改变或包涵体的存在。光镜检查病理改变或包涵体的存在。b.b.电镜检查组织内或排泄物中的病毒颗粒。电镜检查组织内或排泄物中的病毒颗粒。c.c.PAGEPAGE、PCRPCR检查病毒核酸。检查病毒核酸。d.d.免疫法检查组织内、排泄物中的病毒抗原。免疫法检查组织内、排泄物中的病毒抗原。2. 2. 实验动物细菌检测：实验动物细菌检测：1 1）正常动物主要取）正常动物主要取气管或鼻咽分泌物气管或鼻咽分泌物和和盲肠内容物盲肠内容物作细作细菌培养。菌培养。2 2）发病动物对发生病变的各组织和脏器做细菌检查。）发病动物对发生病变的各组织和脏器做细菌检查。3 3）细菌监测多采用）细菌监测多采用病原学病原学方法。方法。3. 3. 实验动物寄生虫检测：实验动物寄生虫检测：1 1）体内寄生虫检查）体内寄生虫检查a.a.直接涂片：适于肠道蠕虫虫卵、肠道原虫及血液内直接涂片：适于肠道蠕虫虫卵、肠道原虫及血液内寄生虫。寄生虫。b.b.虫卵收集：虫卵收集：饱和生理盐水漂浮饱和生理盐水漂浮；沉淀集卵沉淀集卵，用于吸，用于吸虫卵；虫卵；透明胶纸粘取透明胶纸粘取，用于蛲虫虫卵；，用于蛲虫虫卵；尿液检查尿液检查，用于鼠膀胱线虫卵；用于鼠膀胱线虫卵；尸体剖检尸体剖检。c.c.2 2）体外寄生虫检查）体外寄生虫检查d.d.被毛检查被毛检查e.e.透明胶纸粘取透明胶纸粘取f.f.皮刮取法皮刮取法 （五）报告（五）报告 规规定定了了实实验验动动物物质质量量判判定定原原则则，即即：经经检检测测，如如有有一一只只动动物物的的一一项项指指标标不不符符合合该该级级别别标标准准要要求求，则则判判为为不不符符合合该该级级别别标标准准。根根据据检检验验结结果果，由由检检验验人人员员及及其其负负责责人签发检测报告。人签发检测报告。第三节第三节 实验动物遗传学质量控制实验动物遗传学质量控制 实验动物的遗传质量控制主要包括两个方实验动物的遗传质量控制主要包括两个方面内容，一是科学地进行引种、繁殖和生产，面内容，一是科学地进行引种、繁殖和生产，即对生产过程进行控制；二是建立定期的遗传即对生产过程进行控制；二是建立定期的遗传监测制度，对产品的质量进行控制。遗传质量监测制度，对产品的质量进行控制。遗传质量控制的重点是近交系和封闭群动物。控制的重点是近交系和封闭群动物。 遗传监测的目的是为了证实各品系应具有遗传监测的目的是为了证实各品系应具有的遗传特性，以及是否发生遗传突变和遗传污的遗传特性，以及是否发生遗传突变和遗传污染等，以确保被监测的样品符合该品系的要求。染等，以确保被监测的样品符合该品系的要求。 实验动物遗传质量监测应作为常规工作，实验动物遗传质量监测应作为常规工作，在某种程度上讲，实验动物遗传质量比微生物在某种程度上讲，实验动物遗传质量比微生物质量对动物实验结果的影响更大。质量对动物实验结果的影响更大。 遗传是会发生改变的我们为什么长的不同呢？我们为什么长的不同呢？一、遗传改变的原因一、遗传改变的原因1 1、近交系遗传改变的原因、近交系遗传改变的原因v残余的杂合性，尽管我们采用严格的兄妹交配，残余的杂合性，尽管我们采用严格的兄妹交配，2020代后还是存在代后还是存在1.41.4的残余杂合性，杂合子的残余杂合性，杂合子个体在受精率、繁殖率和生活力上均远远超个体在受精率、繁殖率和生活力上均远远超过纯合子遗传型个体，其在群体中地扩散引过纯合子遗传型个体，其在群体中地扩散引起群体遗传变异。起群体遗传变异。1.4v人为失误造成外来的基因组杂交成一个近交人为失误造成外来的基因组杂交成一个近交系，产生遗传污染系，产生遗传污染 可以避免可以避免v染色体片段存在重复，缺失，易位，倒位，染色体片段存在重复，缺失，易位，倒位，基因位点存在突变，若这些变异在繁育过程基因位点存在突变，若这些变异在繁育过程中固定下来，会引起群体遗传改变。（染色中固定下来，会引起群体遗传改变。（染色体结构的改变）体结构的改变）v遗传突变，来自遗传突变，来自DNADNA序列的序列的变化，这种变化可能是某核变化，这种变化可能是某核苷酸碱基的置换、缺失或插苷酸碱基的置换、缺失或插入。（是在基因水平上遗传入。（是在基因水平上遗传物质中任何可检测的能遗传物质中任何可检测的能遗传的改变）的改变）v各种品系分布到各地长期隔各种品系分布到各地长期隔离繁育，造成品系特性发生离繁育，造成品系特性发生很大变异很大变异2 2、封闭群（远交群）遗传改变的原因、封闭群（远交群）遗传改变的原因 最主要的是选择压最主要的是选择压 同近交系一样，遗传污染和基因突变都能同近交系一样，遗传污染和基因突变都能造成远交群的遗传差异，但远交群等位基因分造成远交群的遗传差异，但远交群等位基因分布改变的主要原因在于选择。布改变的主要原因在于选择。 原因：原因：理论上要保持一个远交群所有基因理论上要保持一个远交群所有基因频率的相对比例没有变化，最恰当的核心繁育频率的相对比例没有变化，最恰当的核心繁育群应有群应有10001000个动物。个动物。 但事实上我们不可能做到这一点，特别但事实上我们不可能做到这一点，特别是近代，人们为了控制微生物污染，采用剖是近代，人们为了控制微生物污染，采用剖腹产和悉生生物学技术定期地重建新的群体。腹产和悉生生物学技术定期地重建新的群体。在重建过程中，群体骤然变小，近交系数必在重建过程中，群体骤然变小，近交系数必将上升，因而导致杂合性下降，这也意味着将上升，因而导致杂合性下降，这也意味着某些基因被固定下来。在不同的单位这种对某些基因被固定下来。在不同的单位这种对位点的不同固定，往往导致了同一品种动物位点的不同固定，往往导致了同一品种动物等位基因分布的改变。等位基因分布的改变。无主观意识的定向选择 二、实验动物的繁殖方法二、实验动物的繁殖方法 （一）近交系动物的繁殖方法（一）近交系动物的繁殖方法 1 1、引、引 种：引种动物应来自近交系的基础群种：引种动物应来自近交系的基础群 2 2、基础群：目的是保持近交系自身的传代、基础群：目的是保持近交系自身的传代 繁衍和繁衍和 提供种源提供种源 3 3、血缘扩大群：种动物来自基础群、血缘扩大群：种动物来自基础群 4 4、生产群：目的是生产供应动物，种子来、生产群：目的是生产供应动物，种子来 自基础群或血缘扩大群自基础群或血缘扩大群（二）封闭群动物的繁殖方法（二）封闭群动物的繁殖方法1 1、引种：引种动物数量要足够多，小型啮、引种：引种动物数量要足够多，小型啮齿类动齿类动 物引种数目一般不少于物引种数目一般不少于2525对。对。2 2、繁殖：封闭群应足够大，尽量避免近亲、繁殖：封闭群应足够大，尽量避免近亲交配。交配。 近交系动物国际命名的规则是根据动物在来源、历史和培育经过而命名的。近交系动物国际命名的规则是根据动物在来源、历史和培育经过而命名的。除一些历史较长已经广泛使用并获得认可的品系外，近交系、亚系和支系除一些历史较长已经广泛使用并获得认可的品系外，近交系、亚系和支系的命名按下面原则进行。的命名按下面原则进行。 1 1、普通近交系的命名、普通近交系的命名 (1) (1)一般均用一般均用1 1至至4 4个大写英文字母表示。如个大写英文字母表示。如A BA AKR STARA BA AKR STAR (2) (2)有些品系可由大写英文字母为首，结合数字加以命名。如有些品系可由大写英文字母为首，结合数字加以命名。如C3H C57BLC3H C57BL (3) (3)非正规的命名，如果已为国际广泛认同者，可保留沿用，如非正规的命名，如果已为国际广泛认同者，可保留沿用，如129129、6l56l5等，等， (4) (4)近交代数表示，一般在品系符号后括号里写上代数，并在代数前加写近交代数表示，一般在品系符号后括号里写上代数，并在代数前加写“F”“F”如如A(F78)A(F78)。 (5) (5)品系命名符号书写要全，应使用公布的全称，不能随便缩写，尤其写论文品系命名符号书写要全，应使用公布的全称，不能随便缩写，尤其写论文报告，在材料方法里一定要把品系命名符号写全。例如报告，在材料方法里一定要把品系命名符号写全。例如C57C57这个缩写意味着这个缩写意味着七、八个特征不同的品系；只写七、八个特征不同的品系；只写C57BLC57BL也包括也包括C57BL/1C57BL/1、C57BL/6JC57BL/6J、C57BL/6N C57BL/10JC57BL/6N C57BL/10J等特征不同的亚系。等特征不同的亚系。 （三）实验动物命名（三）实验动物命名 2 2、重组近交系的命名、重组近交系的命名重组近交系的命名是在两个祖系名称缩写中间加重组近交系的命名是在两个祖系名称缩写中间加大写字母大写字母X X。同一系列中不同的近交系可在其。同一系列中不同的近交系可在其后顺加连字号，再加数字表示。例如后顺加连字号，再加数字表示。例如AKRAKR和和C57BL/10C57BL/10杂交培养的一系列重组近交系可命名杂交培养的一系列重组近交系可命名为为AKXBAKXB3 3、亚系的命名方法是在原品系的名称后加一道、亚系的命名方法是在原品系的名称后加一道斜线，斜线后标明亚系的符号，如斜线，斜线后标明亚系的符号，如DBA/2DBA/2、C57BL/6J C57BL/6J 等。有些近交系的不同亚系之间遗等。有些近交系的不同亚系之间遗传差异较大，对实验处理的反应不同，在实验传差异较大，对实验处理的反应不同，在实验报告或论文中应注明所使用的亚系名称。报告或论文中应注明所使用的亚系名称。 4 4、封闭群的命名、封闭群的命名 封闭群由封闭群由2 24 4个大写英文字母命名，种群名称前标个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过面的字母小写，一般不超过4 4个字母。保持者与种群个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。例如：名称之间用冒号分开。例如：N:NIHN:NIH表示由美国国立表示由美国国立卫生研究院（卫生研究院（N N）保持的）保持的NIHNIH封闭群小鼠。封闭群小鼠。 某些命名较早，又广为人知的封闭群动物，名称与某些命名较早，又广为人知的封闭群动物，名称与上述规则不一致时，仍可沿用其原来的名称。如：上述规则不一致时，仍可沿用其原来的名称。如：WistarWistar大鼠，日本的大鼠，日本的ddyddy小鼠等。小鼠等。 三、实验动物遗传学质量监测三、实验动物遗传学质量监测 ( (一一) )检测目的检测目的 是是检检查查是是否否发发生生遗遗传传变变异异、是是否否混混入入其其它它动动物物血血缘缘或或发发生生了了错错误误的的交交配配等等，以以确确保保检检测测群群体体符符合合该该遗遗传传群群体体的的要要求。求。( (二二) )实验动物遗传学监测的一般性原则实验动物遗传学监测的一般性原则 1. 1.整体性原则整体性原则 2. 2.必要性原则必要性原则 3. 3.连续性原则连续性原则四、实验动物遗传质量监测国家标准基本内容四、实验动物遗传质量监测国家标准基本内容（一）主题内容与适用范围（一）主题内容与适用范围（二）实验动物的遗传分类及命名（二）实验动物的遗传分类及命名（三）实验动物的繁殖方法（三）实验动物的繁殖方法 （四）近交系动物的遗传质量监测（四）近交系动物的遗传质量监测五、实验动物遗传学监测的常用技术方法五、实验动物遗传学监测的常用技术方法（一）近交系动物的遗传质量检测（一）近交系动物的遗传质量检测原原理理：由由一一个个基基因因和和多多个个基基因因决决定定的的任任何何特特征征都都能能用用来来检测一个品系。检测一个品系。1.1.生化标志基因生化标志基因(Biochemical markers) (Biochemical markers) 检测法检测法 近近交交系系小小鼠鼠生生化化基基因因位位点点有有1313个个，近近交交系系大大鼠鼠的的生化基因位点有生化基因位点有9 9个。个。2.2.免疫标志（免疫标志（Immunogenetic markersImmunogenetic markers）检测法）检测法 （1 1）皮肤移植法（）皮肤移植法（Skin graftingSkin grafting） （2 2）混合淋巴细胞反应法）混合淋巴细胞反应法 （3 3）血清学反应法）血清学反应法 （4 4）肿瘤移植法）肿瘤移植法 3 3形态学标记（形态学标记（Extermal manifestationsExtermal manifestations）检测法）检测法（1 1）毛色基因测试（）毛色基因测试（Coat color gene testingCoat color gene testing） （2 2）下颌骨分析）下颌骨分析 4.4.细胞遗传学标记（细胞遗传学标记（Cytogenetic markersCytogenetic markers）检测法）检测法5.5.分子生物学标记（分子生物学标记（DNA markersDNA markers）检测法）检测法（1 1）限制性酶切片段长度多态性（）限制性酶切片段长度多态性（RFLPRFLP）（2 2）DNADNA指纹指纹（3 3）微卫星）微卫星DNADNA的多态性的多态性（4 4）小卫星）小卫星DNADNA（5 5）随机扩增多态性）随机扩增多态性DNADNA（RAPDRAPD）（6 6）单核苷酸多态性（）单核苷酸多态性（SNPSNP）形态学方法1.1.毛色基因检测毛色基因检测 遗传群体发生遗传变异有时产生明显可遗传群体发生遗传变异有时产生明显可见的表型特征。见的表型特征。 近交系的毛色基因近交系的毛色基因品系毛色基因品系毛色基因Aa.b.cDBA/2a.b.C.dABA.B.c.DNCA.b.C.D.S.AKRa.B.cNHa.B.C.D.p.s.ALA.b.cKKa.B.c.D.S.BALB/ca.b.cNZBa.B.C.BLA.B.CNZWA.b.c.CBAA.b.C.D.p.SWRA.B.c.CPB-Fa.b.c.D.p.101Aw.B.C.CPB-FTA.B.C.129Aw.B.cch.p.C3Ha.B.C.615a.b.C.DC57BLa.B.C.TA1a.b.c.DC57BL/6a.B.C.SSBa.b.c.DC57La.b.C.* A-野生色、 aa非野生色 、Aw-白腹野生色 、B-黑色、 bb褐色、 C-有色 、 cch 青紫兰色、cc白化、 D-深色 、dd 淡色 、In-铅灰、 in黑灰、 S-无色斑、 ss有色斑。许多遗传变异并不涉及毛色的变化，现已很少用许多遗传变异并不涉及毛色的变化，现已很少用 2. 2.下颌骨形态分下颌骨形态分析法析法 动物的骨骼形动物的骨骼形态具有高度的遗传性，态具有高度的遗传性，而各种骨骼的形态、而各种骨骼的形态、大小及其出现的差异大小及其出现的差异均可作为鉴定品系的均可作为鉴定品系的方法。方法。下颌骨形态分析图下颌骨形态分析图 1972，英国实验动物中心Festing提出近交系动物遗传监测的免疫学方法在同一物种的不同个体之间，细胞膜表面抗原、在同一物种的不同个体之间，细胞膜表面抗原、免疫球蛋白和其它血清蛋白存在着不同类型，称免疫球蛋白和其它血清蛋白存在着不同类型，称为同种异型，从而成为同种异型抗原。同种异型为同种异型，从而成为同种异型抗原。同种异型是由遗传基因决定的，因此而被选择作为遗传监是由遗传基因决定的，因此而被选择作为遗传监测的标记。测的标记。微量细胞毒法是根据特异性抗体与细胞表面的同微量细胞毒法是根据特异性抗体与细胞表面的同种异型抗原结合，在存在适当的补体时，能杀死种异型抗原结合，在存在适当的补体时，能杀死细胞的原理而进行的测试方法。皮肤移植试验的细胞的原理而进行的测试方法。皮肤移植试验的原理是由于个体间组织相容性抗原不同，受体对原理是由于个体间组织相容性抗原不同，受体对供体的组织细胞产生免疫排斥，导致植物坏死。供体的组织细胞产生免疫排斥，导致植物坏死。免疫标记探测法免疫标记探测法 1. 1.皮肤移植，主要用于探测组织相容性基皮肤移植，主要用于探测组织相容性基因的差异，它是一个敏感、使用广泛的方因的差异，它是一个敏感、使用广泛的方法，以尾部皮肤移植法为好法，以尾部皮肤移植法为好 小鼠组织相容性位点的分布小鼠组织相容性位点的分布2.2.红细胞凝集试验（检测红细胞抗原和某些红细胞凝集试验（检测红细胞抗原和某些H-2H-2抗原）抗原）3.3.细胞毒试验（检测细胞毒试验（检测H-2H-2抗原、抗原、IaIa抗原和白抗原和白细胞抗原）细胞抗原）其它免疫学方法生化标记法生化标记法 依据生化基因的产物（绝大多数是异依据生化基因的产物（绝大多数是异构蛋白和酶）在特定电场内携带的电荷不构蛋白和酶）在特定电场内携带的电荷不同，采用电泳的方法将它们区分，这些电同，采用电泳的方法将它们区分，这些电泳带型称之为生化基因标记。我们可以根泳带型称之为生化基因标记。我们可以根据电泳带型即蛋白质的表现型推断被检测据电泳带型即蛋白质的表现型推断被检测小鼠的基因型，建立各种近交系的遗传概小鼠的基因型，建立各种近交系的遗传概貌，定期对它们进行遗传监测。貌，定期对它们进行遗传监测。常规遗传监测中的首选方法常规遗传监测中的首选方法K：肾脏e：溶血素或红细胞 l：肝脏s：脾脏 p限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性DNA( RFLP)DNA( RFLP)随机扩增多态性随机扩增多态性DNA(RAPD)DNA(RAPD)微卫星微卫星DNADNA标记标记线粒体线粒体DNA (mtDNA) DNA (mtDNA) 多态性多态性单核苷酸多态性分析单核苷酸多态性分析(SNPs) (SNPs) 基因芯片分析基因芯片分析 分子生物学遗传监测方法分子生物学遗传监测方法分子标记相对于传统的生化标记具有操分子标记相对于传统的生化标记具有操作简便作简便, ,多态性丰富等优点多态性丰富等优点, , 如何推动如何推动高效的遗传多态性检测手段应用于实验高效的遗传多态性检测手段应用于实验动物管理中去动物管理中去, ,是我们实验动物学工作是我们实验动物学工作者应该思考的问题。者应该思考的问题。（二）封闭群实验动物遗传检测（二）封闭群实验动物遗传检测 1 1、目的：对封闭群动物的遗传检测，就是对动物群体的、目的：对封闭群动物的遗传检测，就是对动物群体的遗传结构进行分析。其目的是通过遗传分析了解动物群遗传结构进行分析。其目的是通过遗传分析了解动物群体的遗传概貌，得知不同种动物间或动物不同群体间的体的遗传概貌，得知不同种动物间或动物不同群体间的遗传差异、遗传距离、在进化中的关系等。它对动物的遗传差异、遗传距离、在进化中的关系等。它对动物的分类，品系资源的保存、开发和利用，对动物的选种、分类，品系资源的保存、开发和利用，对动物的选种、选育具有指导意义。还可确保群体的杂合性和基因库的选育具有指导意义。还可确保群体的杂合性和基因库的完整。完整。需计算基因频率需计算基因频率 2 2、方法：、方法： （1 1）生化标记检测）生化标记检测 通过计算基因频率来了解基因平衡通过计算基因频率来了解基因平衡 状态。状态。 （2 2）染色体标记检测）染色体标记检测 了解一些染色体的带型多态性。了解一些染色体的带型多态性。 （3 3）形态学）形态学 进行下颌骨形态的多变量分析。进行下颌骨形态的多变量分析。六、遗传质量标准六、遗传质量标准1 近交系动物的遗传质量标准近交系动物的遗传质量标准近交系动物必须符合以下要求：近交系动物必须符合以下要求：(1(1）具有明确的品系背景资料，包括品系名称、近）具有明确的品系背景资料，包括品系名称、近交代数、遗传组成、主要生物学特性等，并能充分交代数、遗传组成、主要生物学特性等，并能充分表明新培育的或引种的近交系动物符合近交系定义表明新培育的或引种的近交系动物符合近交系定义的规定。的规定。 (2 (2）用于近交系保种及生产的繁殖系谱及记录卡应）用于近交系保种及生产的繁殖系谱及记录卡应清楚完整，繁殖方法科学合理。清楚完整，繁殖方法科学合理。(3(3）经遗传检测（生化标记基因检测法，皮肤移植）经遗传检测（生化标记基因检测法，皮肤移植法，免疫标记基因检测法等）质量合格。法，免疫标记基因检测法等）质量合格。2 2 封闭群动物的遗传质量标准封闭群动物的遗传质量标准由于封闭群动物的遗传组成不如近交系稳定，由于封闭群动物的遗传组成不如近交系稳定，目前尚没有统一的质量标准，但基本要求如下：目前尚没有统一的质量标准，但基本要求如下：(1(1）作为繁殖用原种的封闭群动物必须遗传背）作为繁殖用原种的封闭群动物必须遗传背景明确，来源清楚，有较完整的资料（包括种景明确，来源清楚，有较完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）。性等）。(2(2）保持封闭群条件，无选择，以非近亲交配）保持封闭群条件，无选择，以非近亲交配方式进行繁殖，每代近交系数上升不超过方式进行繁殖，每代近交系数上升不超过1 1。(3(3）具有一定的种群规模，保持封闭群的主要）具有一定的种群规模，保持封闭群的主要生物学特性。生物学特性。思考题：思考题：1 1、实验动物微生物与寄生虫检测的程序？、实验动物微生物与寄生虫检测的程序？ 2 2、根据微生物和寄生虫控制我国实验动物分为、根据微生物和寄生虫控制我国实验动物分为哪几个等级？哪几个等级？ 3 3实验动物按遗传学是如何分类的？实验动物按遗传学是如何分类的？4 4简述实验动物（近交系、亚系、封闭群、杂简述实验动物（近交系、亚系、封闭群、杂交群）命名原则是什么？交群）命名原则是什么？5 5为什么要进行实验动物的遗传监测？遗传监为什么要进行实验动物的遗传监测？遗传监测的方法主要有哪些？测的方法主要有哪些？