实验二实验二 中性粒细胞吞噬功能测定中性粒细胞吞噬功能测定 细菌计数法细菌计数法一、实验内容一、实验内容1. 细菌计数法细菌计数法测定测定中性粒细胞吞噬功能中性粒细胞吞噬功能 ( (小组做小组做) )2. 录相录相免疫反击战免疫反击战二、目的与要求二、目的与要求1.了解中性粒细胞生物学特性及其意义。了解中性粒细胞生物学特性及其意义。2.熟悉熟悉“细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能能”试验的原理、方法及用途。试验的原理、方法及用途。 实验原理实验原理 中性粒细胞中性粒细胞中性粒细胞中性粒细胞来源于骨髓造血干细胞；来源于骨髓造血干细胞；来源于骨髓造血干细胞；来源于骨髓造血干细胞； 占白细胞总数的占白细胞总数的占白细胞总数的占白细胞总数的60%60%60%60% 70%70%70%70%；生命周期短，不能分裂，靠生命周期短，不能分裂，靠生命周期短，不能分裂，靠生命周期短，不能分裂，靠“造血造血造血造血”补充；补充；补充；补充；胞核呈多叶状；胞质内有多种胞核呈多叶状；胞质内有多种胞核呈多叶状；胞质内有多种胞核呈多叶状；胞质内有多种颗粒颗粒颗粒颗粒；内含内含髓过氧化物酶、髓过氧化物酶、防御素、溶菌酶、组织蛋白酶、乳铁防御素、溶菌酶、组织蛋白酶、乳铁蛋白、碱性磷酸酶等。蛋白、碱性磷酸酶等。中性粒细胞特有，巨噬细胞没有这种酶，中性粒细胞特有，巨噬细胞没有这种酶，为中性粒细胞在细胞化学上的标志。为中性粒细胞在细胞化学上的标志。中性粒细胞通过中性粒细胞通过中性粒细胞通过中性粒细胞通过趋化、调理、吞入和杀菌趋化、调理、吞入和杀菌趋化、调理、吞入和杀菌趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，吞等步骤，吞等步骤，吞等步骤，吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物；噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物；噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物；噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物； 中性粒细胞产生中性粒细胞产生中性粒细胞产生中性粒细胞产生伪足伪足伪足伪足包围异物包围异物包围异物包围异物吞噬体吞噬体吞噬体吞噬体或或或或吞噬泡吞噬泡吞噬泡吞噬泡；吞噬吞噬吞噬吞噬呼吸爆发呼吸爆发呼吸爆发呼吸爆发产生大量过氧化物及超氧化物产生大量过氧化物及超氧化物产生大量过氧化物及超氧化物产生大量过氧化物及超氧化物等毒性效应分子等毒性效应分子等毒性效应分子等毒性效应分子杀死吞噬的细菌杀死吞噬的细菌杀死吞噬的细菌杀死吞噬的细菌等异物；等异物；等异物；等异物；同时，中性粒细胞本身也死亡，同时，中性粒细胞本身也死亡，成为成为脓细胞脓细胞。吞噬痢疾杆菌吞噬痢疾杆菌吞噬炭疽杆菌吞噬炭疽杆菌小小吞吞噬噬细细胞胞吞吞噬噬的的细细菌菌中性粒细胞：中性粒细胞：A.A.在抗化脓性细菌感染中起重要防御作用；在抗化脓性细菌感染中起重要防御作用；B.B.引起感染部位急性炎症反应；引起感染部位急性炎症反应；C.C.参与超敏反应（如参与超敏反应（如IIIIII型超敏反应），引型超敏反应），引起机体免疫病理损伤。起机体免疫病理损伤。 将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片染色，即能观察到染色，即能观察到染色，即能观察到染色，即能观察到被吞噬到中性粒细胞内但还未被吞噬到中性粒细胞内但还未被吞噬到中性粒细胞内但还未被吞噬到中性粒细胞内但还未被消化掉的细菌被消化掉的细菌被消化掉的细菌被消化掉的细菌。 检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅助判断机体非特异性免疫力的指标之一。助判断机体非特异性免疫力的指标之一。助判断机体非特异性免疫力的指标之一。助判断机体非特异性免疫力的指标之一。 细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能小吞噬实验小吞噬实验检测指标：检测指标：1. 吞噬百分率吞噬百分率100100个细胞中吞噬有细菌的细胞数个细胞中吞噬有细菌的细胞数个细胞中吞噬有细菌的细胞数个细胞中吞噬有细菌的细胞数人吞噬百分率正常参考值：人吞噬百分率正常参考值：人吞噬百分率正常参考值：人吞噬百分率正常参考值：62%76%62%76%100100 100%100%2. 吞噬指数吞噬指数100100个中性粒细胞吞噬的细菌总数个中性粒细胞吞噬的细菌总数个中性粒细胞吞噬的细菌总数个中性粒细胞吞噬的细菌总数人吞噬指数正常参考值：人吞噬指数正常参考值：人吞噬指数正常参考值：人吞噬指数正常参考值：1.321.721.321.72100100(1)(1)(1)(1)显显显显微微微微镜镜镜镜、香香香香柏柏柏柏油油油油、小小小小试试试试管管管管、EPEPEPEP管管管管、载载载载玻玻玻玻片片片片、酒酒酒酒精精精精棉球、吸管、水浴箱等。棉球、吸管、水浴箱等。棉球、吸管、水浴箱等。棉球、吸管、水浴箱等。(2)(2)(2)(2)肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。(3)(3)(3)(3)菌液制备：白色葡萄球菌菌液制备：白色葡萄球菌菌液制备：白色葡萄球菌菌液制备：白色葡萄球菌1818181824242424小时内汤培养物，小时内汤培养物，小时内汤培养物，小时内汤培养物，经经经经Mc Mc Mc Mc FarlandFarlandFarlandFarland比浊法调整浓度至比浊法调整浓度至比浊法调整浓度至比浊法调整浓度至6 6 6 69109109109109 9 9 9/ / / /mLmLmLmL，加加加加热热热热100 15100 15100 15100 15分钟杀死细菌，置分钟杀死细菌，置分钟杀死细菌，置分钟杀死细菌，置4444保存备用。保存备用。保存备用。保存备用。 实验材料实验材料(1)(1)(1)(1)仔细消毒后，每个班取仔细消毒后，每个班取仔细消毒后，每个班取仔细消毒后，每个班取5ml5ml5ml5ml静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。实验方法实验方法( ( ( (3)3)3)3)取出取出取出取出EPEP管，用吸管吹打混匀后，取管，用吸管吹打混匀后，取管，用吸管吹打混匀后，取管，用吸管吹打混匀后，取1 1滴滴滴滴“ “全血全血全血全血- -白色葡萄球菌混白色葡萄球菌混白色葡萄球菌混白色葡萄球菌混合液合液合液合液” ”置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。( ( ( (2)2)2)2) 取取取取2ml2ml2ml2ml抗凝血于抗凝血于抗凝血于抗凝血于EPEPEPEP管内，再加入管内，再加入管内，再加入管内，再加入1ml1ml1ml1ml备好的白色葡萄球菌菌液，备好的白色葡萄球菌菌液，备好的白色葡萄球菌菌液，备好的白色葡萄球菌菌液，充分混匀后，充分混匀后，充分混匀后，充分混匀后，置置置置3737水浴水浴水浴水浴20min20min，中途混匀，中途混匀，中途混匀，中途混匀1 1次。次。次。次。( ( ( (4)4)4)4)待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。瑞氏染色瑞氏染色瑞氏染液数滴覆盖血涂片上瑞氏染液数滴覆盖血涂片上瑞氏染液数滴覆盖血涂片上瑞氏染液数滴覆盖血涂片上 染色染色染色染色1min 1min 再加等量的再加等量的再加等量的再加等量的PH6.8 PBSPH6.8 PBS与染液混合，染色与染液混合，染色与染液混合，染色与染液混合，染色1015min 1015min 用蒸馏水冲洗用蒸馏水冲洗用蒸馏水冲洗用蒸馏水冲洗（平持玻片，在一端加水，使染料（平持玻片，在一端加水，使染料（平持玻片，在一端加水，使染料（平持玻片，在一端加水，使染料“ “漂走漂走漂走漂走” ” ） 自然干燥自然干燥自然干燥自然干燥显微镜油镜原理显微镜油镜原理 显微镜的放大倍数和分辨率显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数放大倍数 接物镜放大倍数接物镜放大倍数接目镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率显微镜的分辨率 表示显微镜辨析物体（两端）两点之表示显微镜辨析物体（两端）两点之 间距离的能力，可用公式表示为：间距离的能力，可用公式表示为： D=/2nsin(/2 ) D D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均：可见光的波长（平均0.550.55 m) m) n: n: 物镜和被检标本间介质的折射率。物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。：镜口角（即入射角）。油镜使用的原理油镜使用的原理 1. 香柏油的折射率与玻璃接香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。近，提高了视野的照明度。 2 . 提高了显微镜的分辨率提高了显微镜的分辨率显微镜油镜的使用方法显微镜油镜的使用方法 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标 本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看 清物象为止。清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的 油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用 擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。油镜观察油镜观察首先寻找中性粒细胞首先寻找中性粒细胞首先寻找中性粒细胞首先寻找中性粒细胞观察胞质中有无吞噬的细菌。如染观察胞质中有无吞噬的细菌。如染观察胞质中有无吞噬的细菌。如染观察胞质中有无吞噬的细菌。如染色正确，可见色正确，可见色正确，可见色正确，可见细胞核及被吞噬的细菌细胞核及被吞噬的细菌细胞核及被吞噬的细菌细胞核及被吞噬的细菌染成染成染成染成紫色紫色紫色紫色，而，而，而，而中性粒细中性粒细中性粒细中性粒细胞胞胞胞胞浆染成胞浆染成胞浆染成胞浆染成淡红色淡红色淡红色淡红色。计算计算计算计算吞噬百分率吞噬百分率吞噬百分率吞噬百分率和和和和吞噬指数吞噬指数吞噬指数吞噬指数(1)(1)(1)(1)人人人人类类类类白白白白细细细细胞胞胞胞的的的的吞吞吞吞噬噬噬噬活活活活性性性性在在在在37373737时时时时最最最最好好好好，温温温温度度度度过过过过高高高高过过过过低低低低均均均均会会会会使其吞噬能力减低。使其吞噬能力减低。使其吞噬能力减低。使其吞噬能力减低。 注意事项注意事项(2)(2)个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。个体差异、年龄、健康状况的不同，其吞噬能力亦不同。 ( (4)4)取取取取“ “细菌全血细菌全血细菌全血细菌全血” ”涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要涂片时，要混匀后再取；制作血涂片要求推出尾部，过厚或过薄，均不利观察。求推出尾部，过厚或过薄，均不利观察。求推出尾部，过厚或过薄，均不利观察。求推出尾部，过厚或过薄，均不利观察。 (3)(3)掌握好细菌与中性粒细胞的作用时间。掌握好细菌与中性粒细胞的作用时间。掌握好细菌与中性粒细胞的作用时间。掌握好细菌与中性粒细胞的作用时间。中性粒细胞对细菌的吞噬是一个非常迅速的过程，吞噬中性粒细胞对细菌的吞噬是一个非常迅速的过程，吞噬中性粒细胞对细菌的吞噬是一个非常迅速的过程，吞噬中性粒细胞对细菌的吞噬是一个非常迅速的过程，吞噬5min5min时吞噬率达时吞噬率达时吞噬率达时吞噬率达45%45%，10min10min时接近时接近时接近时接近80%80%，20min 20min 即达平台。即达平台。即达平台。即达平台。