第二节第二节 细胞工程细胞工程1生物工程工程技术细胞工程细胞工程细胞工程细胞工程细胞工程细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理是指应用细胞生物学和分子生物学的原理是指应用细胞生物学和分子生物学的原理是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。“白菜白菜甘蓝甘蓝”具有生长具有生长期短，耐热性强和易于贮期短，耐热性强和易于贮存等优点存等优点 2生物工程工程技术1958年，美国年，美国Steward在用野生胡萝在用野生胡萝卜游离韧皮部细胞进行卜游离韧皮部细胞进行体外培养的标本中，观体外培养的标本中，观察到已经高度分化的细察到已经高度分化的细胞可以重新分裂，而回胞可以重新分裂，而回复至胚性细胞状态。复至胚性细胞状态。 细胞工程的举例细胞工程的举例3生物工程工程技术1997年克隆羊年克隆羊“多莉多莉”诞生诞生 4生物工程工程技术5生物工程工程技术一、细胞的全能性一、细胞的全能性概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞使后代细胞形成完整个体的潜能形成完整个体的潜能。 原因是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的原因是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质全套遗传物质及发育为完整个体所及发育为完整个体所必需的全部基因必需的全部基因。 受精卵的全能性最高受精卵的全能性最高在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态离体状态。 生殖细胞（尤其是卵细胞）生殖细胞（尤其是卵细胞）体细胞比生殖细胞低很多体细胞比生殖细胞低很多6生物工程工程技术细胞分化与细胞全能性之间的关系细胞分化与细胞全能性之间的关系7生物工程工程技术n n一个受精卵发育成一个新个体，细胞除了一个受精卵发育成一个新个体，细胞除了经过有丝分裂使细胞数目增多以外，还必须经过有丝分裂使细胞数目增多以外，还必须经过细胞分化，使细胞在形态、结构和生理经过细胞分化，使细胞在形态、结构和生理功能上均发生稳定性的差异，形成不同的细功能上均发生稳定性的差异，形成不同的细胞和组织。胞和组织。n n细胞分化是一个渐变过程，在胚胎发育的早细胞分化是一个渐变过程，在胚胎发育的早期，细胞外观上尚未出现明显变化前，细胞期，细胞外观上尚未出现明显变化前，细胞分化前途就已经决定，以后依次渐变，不能分化前途就已经决定，以后依次渐变，不能逆转，因此分化是一种持久的、稳定的变化。逆转，因此分化是一种持久的、稳定的变化。 细胞分化与细胞全能性细胞分化与细胞全能性8生物工程工程技术n n由于体细胞是通过有丝分裂繁殖的，一般已分化由于体细胞是通过有丝分裂繁殖的，一般已分化由于体细胞是通过有丝分裂繁殖的，一般已分化由于体细胞是通过有丝分裂繁殖的，一般已分化的细胞都有一套与受精卵相同的染色体，携带有本的细胞都有一套与受精卵相同的染色体，携带有本的细胞都有一套与受精卵相同的染色体，携带有本的细胞都有一套与受精卵相同的染色体，携带有本物种的全部遗传信息，因此分化的细胞有发育成完物种的全部遗传信息，因此分化的细胞有发育成完物种的全部遗传信息，因此分化的细胞有发育成完物种的全部遗传信息，因此分化的细胞有发育成完整新个体的潜能，这就是细胞的全能性，因此，在整新个体的潜能，这就是细胞的全能性，因此，在整新个体的潜能，这就是细胞的全能性，因此，在整新个体的潜能，这就是细胞的全能性，因此，在合适的条件下，有些分化的细胞具有恢复分裂、重合适的条件下，有些分化的细胞具有恢复分裂、重合适的条件下，有些分化的细胞具有恢复分裂、重合适的条件下，有些分化的细胞具有恢复分裂、重新分化发育成完整新个体的能力。新分化发育成完整新个体的能力。新分化发育成完整新个体的能力。新分化发育成完整新个体的能力。n n细胞具有全能性和全能性表达是两个不同的概念。细胞具有全能性和全能性表达是两个不同的概念。细胞具有全能性和全能性表达是两个不同的概念。细胞具有全能性和全能性表达是两个不同的概念。体内分化的植物细胞具有全能性，但在体内不能体内分化的植物细胞具有全能性，但在体内不能体内分化的植物细胞具有全能性，但在体内不能体内分化的植物细胞具有全能性，但在体内不能表达，需在一定条件下离体培养才能表达。表达，需在一定条件下离体培养才能表达。表达，需在一定条件下离体培养才能表达。表达，需在一定条件下离体培养才能表达。 体内所有细胞中受精卵全能性最高，卵细胞比体内所有细胞中受精卵全能性最高，卵细胞比体内所有细胞中受精卵全能性最高，卵细胞比体内所有细胞中受精卵全能性最高，卵细胞比体细胞潜在的全能性高，分化的植物细胞比分化的体细胞潜在的全能性高，分化的植物细胞比分化的体细胞潜在的全能性高，分化的植物细胞比分化的体细胞潜在的全能性高，分化的植物细胞比分化的动物细胞全能性易表达，但需一定条件下离体培养。动物细胞全能性易表达，但需一定条件下离体培养。动物细胞全能性易表达，但需一定条件下离体培养。动物细胞全能性易表达，但需一定条件下离体培养。 9生物工程工程技术二、植物细胞工程二、植物细胞工程 植物细胞工程的理论基础是：植物细胞工程的理论基础是： 植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交10生物工程工程技术离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞 脱分化（又叫去分化）脱分化（又叫去分化）愈伤组织愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化 再分化 的呈无定形状态的薄壁细胞）根或芽等器官根或芽等器官植物体植物体1、植物组织培养、植物组织培养关键步骤关键步骤 :进行灭菌处理进行灭菌处理 ； 植物激素：细胞分裂素与生长素之间的浓度植物激素：细胞分裂素与生长素之间的浓度比可以调控植株组培过程中芽和根的形成。比可以调控植株组培过程中芽和根的形成。 当细胞分裂素与当细胞分裂素与生长素浓度比高生长素浓度比高时，有利于芽的时，有利于芽的发生；浓度比低发生；浓度比低时，有利于根的时，有利于根的发生。发生。 愈伤组织再分化愈伤组织再分化过程应先诱导生过程应先诱导生芽，再诱导生根芽，再诱导生根 条件：适宜的养料、激素、温度和无菌条件条件：适宜的养料、激素、温度和无菌条件11生物工程工程技术过程名称过程名称过程名称过程名称过程过程过程过程形成体特征形成体特征形成体特征形成体特征条件条件条件条件脱分化脱分化脱分化脱分化由外植体成为由外植体成为由外植体成为由外植体成为愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织排列疏松、高排列疏松、高排列疏松、高排列疏松、高度液泡化的薄度液泡化的薄度液泡化的薄度液泡化的薄壁细胞、色浅壁细胞、色浅壁细胞、色浅壁细胞、色浅1 1、离体、离体、离体、离体2 2、提供营养、提供营养、提供营养、提供营养物质物质物质物质3 3、提供激素、提供激素、提供激素、提供激素4 4、无菌、无菌、无菌、无菌再分化再分化再分化再分化由愈伤组织成由愈伤组织成由愈伤组织成由愈伤组织成为幼苗或胚状为幼苗或胚状为幼苗或胚状为幼苗或胚状结构结构结构结构有根、芽或有有根、芽或有有根、芽或有有根、芽或有生根发芽的能生根发芽的能生根发芽的能生根发芽的能力力力力营养生长营养生长营养生长营养生长生殖生长生殖生长生殖生长生殖生长发育成完整的发育成完整的发育成完整的发育成完整的植物体植物体植物体植物体由根、茎、叶、由根、茎、叶、由根、茎、叶、由根、茎、叶、花、果、种子花、果、种子花、果、种子花、果、种子组成组成组成组成栽培栽培栽培栽培植物组织培养比较表植物组织培养比较表12生物工程工程技术1.快速繁殖快速繁殖2.培育无病毒植物培育无病毒植物3.生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等4.制作人工种子制作人工种子5.转基因植物的培育转基因植物的培育 植物组织培养技术的应用植物组织培养技术的应用人工种子是指通过植物组织培养技术人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。繁殖的一种结构。 人工种子有许多优点人工种子有许多优点:首先，它解决了有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。首先，它解决了有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。第二，人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。第二，人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。第三，人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以第三，人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以 添加各添加各种附加成分，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有种附加成分，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。第四，用人工种子播种可以节约粮食。第四，用人工种子播种可以节约粮食。 13生物工程工程技术概念：概念：概念：概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）快速繁殖技术）快速繁殖技术）快速繁殖技术）原理：原理：原理：原理：植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性优点：优点：优点：优点：繁殖率高，可大批量生产繁殖率高，可大批量生产繁殖率高，可大批量生产繁殖率高，可大批量生产 取材少取材少取材少取材少 培养周期短培养周期短培养周期短培养周期短 保持优良性状保持优良性状保持优良性状保持优良性状快速繁殖快速繁殖14生物工程工程技术作物脱毒作物脱毒n n病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差量降低，品质变差n n分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有甚至没有n n采用茎尖进行组织培养采用茎尖进行组织培养15生物工程工程技术人工种子n n结构：结构：结构：结构：n n人工薄膜人工薄膜人工薄膜人工薄膜+ + + +胚状体（不定芽、顶芽、腋胚状体（不定芽、顶芽、腋胚状体（不定芽、顶芽、腋胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）芽）芽）芽）n n优点：优点：优点：优点：n n不受气候、季节、地域的限制不受气候、季节、地域的限制不受气候、季节、地域的限制不受气候、季节、地域的限制n n保留优良性状保留优良性状保留优良性状保留优良性状n n时间短，占地少时间短，占地少时间短，占地少时间短，占地少n n技术：技术：技术：技术：n n组织培养组织培养组织培养组织培养n n原理：原理：原理：原理：n n细胞全能性细胞全能性细胞全能性细胞全能性16生物工程工程技术2、植物体细胞杂交、植物体细胞杂交 植物体细胞杂交是植物体细胞杂交是用两个来自于不同植用两个来自于不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把，并且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。杂种细胞培育成新的植物体的方法。 因为不同种生物之间存在着生殖隔离，因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的这一点的 。17生物工程工程技术3、植物体细胞杂交、植物体细胞杂交如何去壁？如何去壁？酶解法去壁酶解法去壁纤维素酶纤维素酶果胶酶果胶酶人工诱导原生质体融合有物理法和人工诱导原生质体融合有物理法和化学法两大类：化学法两大类： 物理法是利用离心、振动、电刺物理法是利用离心、振动、电刺激促使原生质体的融合；激促使原生质体的融合； 化学法是用聚乙二醇（化学法是用聚乙二醇（PEG）等试剂作为诱导剂诱导融合。等试剂作为诱导剂诱导融合。 18生物工程工程技术植物细胞融合植物细胞融合植物细胞培养植物细胞培养植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体原生质体A原生质体原生质体B原生质体融合（诱导膜融合、原生质体融合（诱导膜融合、核融合在杂种细胞第一次有丝核融合在杂种细胞第一次有丝分裂时进行）分裂时进行）杂合的原生质体杂合的原生质体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞细胞分裂细胞分裂分化发育分化发育愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株纤维素酶、纤维素酶、果胶酶果胶酶植物体细胞杂交植物体细胞杂交19生物工程工程技术原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体融合（人工诱导）原生质体融合（人工诱导） 杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）组织）杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生与鉴定20生物工程工程技术(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交植物体细胞杂交过程示意图21生物工程工程技术白菜白菜白菜白菜甘蓝甘蓝甘蓝甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝白菜甘蓝植物体细胞杂交案例植物体细胞杂交案例植物体细胞杂交应用22生物工程工程技术常见的植物细胞培养有：常见的植物细胞培养有： 1、花粉培养、花粉培养n n花粉或花粉洗涤后在培养基上剪碎，培花粉或花粉洗涤后在培养基上剪碎，培养形成愈伤组织，分化形成根茎，生长养形成愈伤组织，分化形成根茎，生长为单倍体花粉植株，经加倍成为普通植为单倍体花粉植株，经加倍成为普通植株株 花粉培养是目前育种重要手段之一花粉培养是目前育种重要手段之一23生物工程工程技术2、原生质体培养、原生质体培养n n去壁（纤维素酶、果胶酶）去壁（纤维素酶、果胶酶）n n细细胞胞原原生生质质体体愈愈伤伤组组织织根根、茎茎植株。植株。n n细细胞胞融融合合，基基因因转转移移必必须须要要在在原原生生质质体体上上进行。进行。二、细胞融合：（二、细胞融合：（cell fusion） 创创立立于于60年年代代，指指在在一一定定的的条条件件下下将将两两个个或或多多个个细细胞胞融融合合为为一一个个细细胞胞的的工工程程，细细胞胞融融合合又又称称细细胞胞杂杂交交（cell hybridyixation）杂杂种种细细胞胞的的形形成成范范围围较较广广，不不仅仅动动、植植物物种种内内或或种种间间可可杂杂交交，而而且动、植物之间也可杂交。且动、植物之间也可杂交。24生物工程工程技术如如：1970年年蕃蕃茄茄与与马马铃铃薯薯之之间间的的原原生生质质体体融融合合 成成 功功 及及 杂杂 种种 植植 株株（pomato)的育成。的育成。 以色列抗寒番茄的育成以色列抗寒番茄的育成25生物工程工程技术植物组织培养的过程植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）脱分化（又叫去分化）愈伤组织愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化再分化根或芽等器官根或芽等器官植物体植物体植物组织培养的条件：植物组织培养的条件： 适宜的养料和激素，适宜的适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件温度和无菌条件26生物工程工程技术27生物工程工程技术4、植物细胞培养的应用、植物细胞培养的应用利用植物细胞培养进行药物生产利用植物细胞培养进行药物生产太平洋紫杉细胞生产抗癌药物太平洋紫杉细胞生产抗癌药物- -紫杉醇、人参细胞培养人紫杉醇、人参细胞培养人参皂苷和人参多糖、毛地参皂苷和人参多糖、毛地黄细胞培养转化毛地黄毒黄细胞培养转化毛地黄毒苷苷典型案例：紫杉醇生产典型案例：紫杉醇生产C C4747HH5151NONO1414 分子量：分子量：分子量：分子量：853.92 853.92 28生物工程工程技术案案 例例 1紫杉醇紫杉醇(Paclitaxel)(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药，是一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻一新发现的有丝分裂抑制剂，其作用机理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和止微管正常生理聚集，抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而纺锤体的形成，从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。凋亡。19671967年美国化学家年美国化学家WallWall和和WaniWani等首先从太平洋紫等首先从太平洋紫 杉（短叶红豆杉，杉（短叶红豆杉，Taxus.brevifoliaTaxus.brevifolia）树皮中提取）树皮中提取出来。该药于出来。该药于19901990年进入年进入期临床试验，期临床试验，19921992年年底获美国底获美国FDAFDA批准上市。批准上市。 29生物工程工程技术紫杉醇存在于红豆杉属植紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中，物的树皮、叶及茎中， 其中其中树皮中的含量最高，大约从树皮中的含量最高，大约从1200012000株成年紫杉树中才能株成年紫杉树中才能提取提取1KG1KG的紫杉醇，而且紫的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界杉的生长周期很长，在世界分布很少。分布很少。 紫杉醇的国际市场价格为紫杉醇的国际市场价格为450450美元美元/g/g30生物工程工程技术日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在23天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。31生物工程工程技术案案 例例 2利用植物细胞培养生产天然色素利用植物细胞培养生产天然色素紫草宁紫草宁紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又因为其疮的治疗药物，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素漂亮的紫红色而作为高级色素使用。使用。紫草宁产生于亚洲的多年生紫草宁产生于亚洲的多年生 植物植物紫草的根部紫草的根部 。但紫草资源严重。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（绝，在我国，紫草（Arnebia Arnebia euchromaeuchroma) )列入了国际二级保列入了国际二级保护植物护植物32生物工程工程技术33生物工程工程技术紫草的人工栽培成活率低，而且直接紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。提取紫草宁的无法满足市场需求。化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且化学合成紫草宁的工艺非常复杂，且最终产率只有最终产率只有0.70.7，生产成本昂贵。，生产成本昂贵。紫草宁在国际市场上售价高达紫草宁在国际市场上售价高达70007000美美元元/kg/kg34生物工程工程技术n n1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。n n1981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获得了紫草宁衍生物。n n日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。n n我国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究，在进行大量的研究之后得出，在适当的条件下，培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中的含量高10倍。35生物工程工程技术二、动物细胞工程二、动物细胞工程 其中，动物细胞培养技术是其他其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞工程技术的基础。动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段常用的技术手段动物细胞培养动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞核移植和胚胎移植和胚胎移植动物细胞融合动物细胞融合生产单克隆抗体生产单克隆抗体36生物工程工程技术动物细胞培养动物细胞培养n n动物细胞培养就是从动动物细胞培养就是从动动物细胞培养就是从动动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组物机体内取出相关的组物机体内取出相关的组物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细织，将它分散成单个细织，将它分散成单个细织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的胞，然后，放在适宜的胞，然后，放在适宜的胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞培养基中，让这些细胞培养基中，让这些细胞培养基中，让这些细胞生长和增殖。生长和增殖。生长和增殖。生长和增殖。37生物工程工程技术动物细胞培养动物细胞培养10代左右幼龄动物组织幼龄动物组织剪碎剪碎胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理细胞培养（原代培养）细胞培养（原代培养）传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系50代后原代培养：原代培养：原代培养：原代培养：单个细胞传至十单个细胞传至十单个细胞传至十单个细胞传至十代左右代左右代左右代左右传代培养：传代培养：传代培养：传代培养：将原代细胞从培将原代细胞从培将原代细胞从培将原代细胞从培养瓶中取出，分装养瓶中取出，分装养瓶中取出，分装养瓶中取出，分装到两个或两个以上到两个或两个以上到两个或两个以上到两个或两个以上的培养瓶中继续培的培养瓶中继续培的培养瓶中继续培的培养瓶中继续培养。养。养。养。细胞株：细胞株：细胞株：细胞株：1010到到到到4040、5050代的细代的细代的细代的细胞，遗传物质没发胞，遗传物质没发胞，遗传物质没发胞，遗传物质没发生改变。生改变。生改变。生改变。细胞系：细胞系：细胞系：细胞系：超过超过超过超过5050代的细胞，代的细胞，代的细胞，代的细胞，遗传物质发生改变，遗传物质发生改变，遗传物质发生改变，遗传物质发生改变，可无限增殖。可无限增殖。可无限增殖。可无限增殖。38生物工程工程技术动物细胞生长特性动物细胞生长特性n n细胞贴壁：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。毒、易于贴附。n n细胞的接触抑制：细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。这种现象称为细胞的接触抑制。 39生物工程工程技术动物细胞培养条件动物细胞培养条件1 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2 2、营养、营养、营养、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等清等清等清等）3 3、温度和、温度和、温度和、温度和PHPH 温度温度温度温度36.536.5+ +0.50.5度，度，pH7.2pH7.27.47.44 4、气体环境、气体环境、气体环境、气体环境 O O2 2和和和和COCO2 2（95%95%空气和空气和空气和空气和5% CO5% CO2 2 ）40生物工程工程技术动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用n n生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等克隆抗体等克隆抗体等克隆抗体等n n健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。用于植皮。用于植皮。用于植皮。n n用于检测有毒物质用于检测有毒物质用于检测有毒物质用于检测有毒物质n n用于生理、病理、药理等方面的研究，为治用于生理、病理、药理等方面的研究，为治用于生理、病理、药理等方面的研究，为治用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据疗和预防疾病提供理论依据疗和预防疾病提供理论依据疗和预防疾病提供理论依据41生物工程工程技术动物细胞融合动物细胞融合 物理法物理法化学法化学法生物法生物法方法方法丧失感染活性丧失感染活性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）紫外线紫外线仙仙台台病病毒毒42生物工程工程技术融融合合过过程程示示意意图图43生物工程工程技术2、动物细胞培养的应用、动物细胞培养的应用 1 1、 许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。克隆抗体等，都可以借助于动物细胞的大规模培养来生产。2 2、用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养，可以获得大量自、用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养，可以获得大量自、用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养，可以获得大量自、用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养，可以获得大量自身的皮肤细胞，为大面积烧伤的病人移植。身的皮肤细胞，为大面积烧伤的病人移植。身的皮肤细胞，为大面积烧伤的病人移植。身的皮肤细胞，为大面积烧伤的病人移植。3 3、培养的动物细胞用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加、培养的动物细胞用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加、培养的动物细胞用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加、培养的动物细胞用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。4 4、医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药、医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药、医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药、医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。 44生物工程工程技术单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念n n单:单个细胞n n克隆:无性繁殖n n抗体:化学性质单一、特异性强45生物工程工程技术单克隆抗体的制备及技术原理单克隆抗体的制备及技术原理 什么叫单克隆抗体什么叫单克隆抗体 （monoclonal antibody) ？ 首首先先从从生生物物体体的的免免疫疫反反应应谈谈起起，当当外外源源性性物物质质在在人人体体或或动动物物血血液液中中出出现现时时，机机体体中中有有一一些些淋淋巴巴细细胞胞便便会会作作出出反反应应，产产生生一一些些特特殊殊的的免免疫疫球球蛋蛋白白，叫叫抗抗体体，而而那那些些外外源源性性物物质质称称抗抗原原，抗抗体体与与抗抗原原能能发发生生特特异异结结合合，从从而而清清除杂物除杂物免疫反应，达到保护肌体的作用。免疫反应，达到保护肌体的作用。46生物工程工程技术n n抗抗原原不不同同，它它所所诱诱发发的的抗抗体体也也不不一一样样，如如细细菌菌或或病病毒毒表表面面存存在在着着几几种种抗抗原原，因因此它们就会对应诱发出几种不同的抗体。此它们就会对应诱发出几种不同的抗体。 过过去去：人人们们为为了了得得抗抗体体，根根据据上上述述原原理理，反反复复注注射射某某种种抗抗原原到到动动物物（如如：兔兔、羊羊、马马），然然后后从从其其血血清清中中分分离离所所需需的的抗抗体体，长长期期以以来来，用用经经典典方方法法得得到到的的抗抗体体，存存在两个严重的缺点：在两个严重的缺点：1、抗抗体体不不均均质质，是是一一种种抗抗体体的的混混合合物物，特特异性差；因而称为多克隆抗体。异性差；因而称为多克隆抗体。2、产产量量有有限限，“克克隆隆”Clone，意意为为“纯纯系、无性繁殖系系、无性繁殖系”。 47生物工程工程技术 单单克克隆隆抗抗体体，是是由由一一个个杂杂交交瘤瘤细细胞胞及及其其后后代代所所产产生生的的抗抗体体，且且单单一一，特特异异和和纯纯化的特性，故有极重要的作用。化的特性，故有极重要的作用。 这这 项项 课课 题题 由由 1975年年 被被 两两 名名 免免 疫疫 专专 家家Georges Koehler 和和 Cesar Milstein 解解决决的。的。1984年获得诺贝尔医学奖。年获得诺贝尔医学奖。 杂杂交交的的原原理理：能能产产生生单单一一抗抗体体的的淋淋巴巴细细胞胞与与有有增增殖殖能能力力的的骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞进进行行融融合合，形形成成杂杂交交瘤瘤细细胞胞，又又称称杂杂交交瘤瘤，由由于于这这些些杂杂交交中中细细胞胞进进行行继继续续分分泌泌继继承承了了双双亲亲的的遗遗传传物物质质，因因而而它它们们不不仅仅能能表表现现出出淋淋巴巴瘤瘤细细胞胞分分泌泌单单一一抗抗体体的的能能力力，而而且且还还能能表表现现出出骨骨髓髓细细胞胞在在体体外外大大量量繁繁殖殖的的本本领领，这这样样，杂杂交交瘤瘤变变成成了了一一座座制制造造单单克克隆抗体的理想工厂。隆抗体的理想工厂。48生物工程工程技术n n制备单克瘤隆抗体的具体方法有三步制备单克瘤隆抗体的具体方法有三步（一一）抗抗原原注注射射到到小小鼠鼠体体内内进进行行免免疫疫，取取出免疫细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合。出免疫细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合。（二二）用用选选择择培培养养基基，选选出出杂杂交交瘤瘤细细胞胞，逐逐一一克克隆隆或或扩扩增增，从从中中挑挑出出能能产产生生抗抗体体的杂交瘤细胞。的杂交瘤细胞。（三三）将将杂杂交交瘤瘤细细胞胞放放在在培培养养瓶瓶中中扩扩大大培培养养基基注注射射到到动动物物的的体体液液中中作作为为腹腹水水癌癌生生长，再分离纯单克隆抗体。长，再分离纯单克隆抗体。49生物工程工程技术单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 抗原注入小鼠体内抗原注入小鼠体内骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞分离B淋巴细胞淋巴细胞细胞融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞选择培养细胞注入小鼠体内培养体内培养培养基体外培养体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体单克隆抗体能产生抗体能产生抗体能无限增殖能无限增殖既能产生抗体又既能产生抗体又能无限增殖能无限增殖50生物工程工程技术单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备51生物工程工程技术52生物工程工程技术单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用 单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。敏度高，优越性非常明显。 人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是在单抗上连接抗癌药物，制成就是在单抗上连接抗癌药物，制成“生物生物导弹导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。53生物工程工程技术3、动物细胞融合、动物细胞融合与与植植物物原原生生质质体体融融合合的的基基本本原原理理相相同同，诱诱导导融融合合的的方方法类似。法类似。 常用的融合剂有：常用的融合剂有： 聚乙二醇、聚乙二醇、 灭活的病毒等。灭活的病毒等。 应用：制备单克隆抗体。应用：制备单克隆抗体。 54生物工程工程技术4、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备 注入小鼠注入小鼠细胞融合细胞融合分离分离抗原注入小鼠体内抗原注入小鼠体内B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养选择培养细胞选择培养细胞培养基培养基体内培养体内培养体外培养体外培养从腹水提取从腹水提取从培养液提取从培养液提取单克隆抗体单克隆抗体能产生能产生的特定的特定抗体抗体 能在体外培养条能在体外培养条件下大量增殖件下大量增殖 在灭活的仙台病毒或在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融聚乙二醇的诱导下融合合 55生物工程工程技术单克隆抗体的应用 1、单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方、单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方 面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。优越性非常明显。2、人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是在单抗上连接抗癌药物，制成在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。了癌细胞，又不会伤害健康细胞。56生物工程工程技术5、哺乳动物的胚胎移植、哺乳动物的胚胎移植 哺乳动物如牛、羊等，妊娠时间长，每胎产子数少，哺乳动物如牛、羊等，妊娠时间长，每胎产子数少，繁殖速度比较慢。利用哺乳动物的繁殖速度比较慢。利用哺乳动物的胚胎移植技术胚胎移植技术，可以，可以快快速繁殖优良动物品种速繁殖优良动物品种，为畜牧业的发展带来了光明的前景。，为畜牧业的发展带来了光明的前景。同时，这一技术也可以用于解决人类不育症问题。同时，这一技术也可以用于解决人类不育症问题。 胚胎移植的过程：胚胎移植的过程：良种母牛良种母牛激素激素多排卵多排卵体外体外受精受精胚胎胚胎胚胎植入胚胎植入的母牛子的母牛子宫内宫内用这种方法得到的小牛叫做用这种方法得到的小牛叫做试管牛试管牛。利用胚胎移植技术。利用胚胎移植技术可以使每头良种母牛一年繁殖牛犊上百头。可以使每头良种母牛一年繁殖牛犊上百头。试管牛试管牛57生物工程工程技术植物组织培养与动物细胞培养的比较植物组织培养与动物细胞培养的比较比较项目比较项目比较项目比较项目原理原理原理原理培养基培养基培养基培养基结果结果结果结果培养目的培养目的培养目的培养目的植物植物植物植物组织培养组织培养组织培养组织培养细胞的细胞的细胞的细胞的全能性全能性全能性全能性固体固体固体固体; ;营养物质，营养物质，营养物质，营养物质，激素激素激素激素培育成植株培育成植株培育成植株培育成植株快速繁殖，快速繁殖，快速繁殖，快速繁殖，培育无病毒培育无病毒培育无病毒培育无病毒植株等植株等植株等植株等动物动物动物动物细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞的细胞的细胞的细胞的增殖增殖增殖增殖液体；液体；液体；液体；营养物质，营养物质，营养物质，营养物质，动物血清动物血清动物血清动物血清培育成细胞培育成细胞培育成细胞培育成细胞系或细胞株系或细胞株系或细胞株系或细胞株获得细胞的获得细胞的获得细胞的获得细胞的产物或细胞产物或细胞产物或细胞产物或细胞等等等等58生物工程工程技术植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较细胞融合细胞融合原理原理融合方法融合方法诱导手段诱导手段用途用途植物体细胞植物体细胞杂交杂交细胞膜的流细胞膜的流动性动性去除细胞壁去除细胞壁后诱导原生后诱导原生质体融合质体融合离心、电刺激、离心、电刺激、振动、显微操振动、显微操作、聚乙二醇作、聚乙二醇等试剂诱导等试剂诱导克服远克服远源杂交源杂交不亲和，不亲和，获得杂获得杂交植株交植株动物细胞融动物细胞融合合细胞膜的流细胞膜的流动性动性使细胞分散使细胞分散后诱导细胞后诱导细胞融合融合同上，再加上同上，再加上灭活的病毒或灭活的病毒或PEG诱导诱导制备单制备单克隆抗克隆抗体的技体的技术之一术之一59生物工程工程技术n n作作 业：业：n n1、生物工程技术有哪些新进展？n n2、什么是基因工程？主要有哪些步骤？有什么应用价值？n n3、什么是细胞工程？主要有哪些步骤？有什么应用价值？60生物工程工程技术