受体的放射性配体结合分析受体的放射性配体结合分析radioligand binding assay of receptors, RBA1v受体受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用相互作用并引起特异性生引起特异性生物效应物效应的物质。v受体与其配体配体（ligand）结合后，通过受体特定的信号传导系统，引起细胞的特定反应，是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。2v受体的放射性配体结合分析受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of receptors，RBA）是用放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异性结合反应，从而对受体进行定性或定量分析。放射性配体+受体分子受体配体 复合物分离B与F测定，计算受体数量及亲和力3v定量定量RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知一定数量的组织或细胞与该放射性配体结合的受体数量受体数量，即结合结合位点数位点数。配体与受体的亲和力亲和力以结合反应的平衡解离常数表示。v定性定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型类型、结合方式结合方式（单位点系统或多位点系统）、受体与配体相互作作用特点用特点等。4一、RBA的主要优点v1、高灵敏度高灵敏度v2、特异性强、专一性好特异性强、专一性好v3、受体制剂的多用性受体制剂的多用性5二、受体的分类二、受体的分类v膜受体v核受体6（一）膜受体v由胞膜外、胞膜内、跨膜区组成。按跨膜区又可分为：v1、G蛋白偶联受体（神经递质、前列腺素等）v2、单一跨膜区有激酶活性受体（细胞因子）v3、单一跨膜区无激酶活性受体（生长因子、INS）v4、离子通道型受体（Na+、K+、Cl-、Ca+等）78v2 2、核受体、核受体 v受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是由4001,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质。氨基端是高度可变区氨基端是高度可变区，与转录的特异性有关。中间是中间是DNADNA结合区结合区，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基羧基端为激素结合区端为激素结合区。 v糖皮质激素受体类、性激素受体类、甲状腺激素受体类。9三、受体与其配基作用的特点三、受体与其配基作用的特点v1可饱和性v2可逆性v3、特异性和亲和力v4生物效应的一致性 v5. 需具有内源性配体 10v1 1可饱和性可饱和性v每个细胞所含的受体数目有限，故配体与受体的结合反应具有可饱和性，呈高亲和力和低容量。v2 2、可逆性、可逆性v配体与受体的结合是可逆的，当受体周围配体浓度降低，结合反应就逆向进行，即配体与受体解离，解离后的配体是原形，不起代谢变化。11v3、特异性特异性和亲和力亲和力v受体有特异识别配体的作用，只有严格构型和构象的配体才能选择性地与某受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织的专一性。受体的亲和力表明其与配体的结合能力，高亲和力说明受体配体结合牢固。平衡解离常数在10-9mol/L以上的被认为高亲和力受体。12v4生物效应的一致性生物效应的一致性v受体的主要功能是介导配体的生物效应，如一种蛋白质与某种物质结合而不介导特定生物效应，则此蛋白质不能称之为受体。v5. 5. 需具有内源性配体需具有内源性配体v受体都需有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白质分子具有类似受体的特性，但未找到内源性配体，则称之为孤儿受体，不能认为是真正的受体。13四、单位点系统四、单位点系统RBA的基本原理的基本原理v1 1、简简单单单单位位点点系系统统受受体体配配体体相相互互作作用用的的基基本本规律规律v 不少受体与配体结合的系统只存在一种结合位点，即简单单位点系统，其基本规律符合质量作用定律质量作用定律。质量作用定律质量作用定律14 1=1RL， 2=2RL平衡时：平衡时：1RL= 2RL则平衡解离常数：则平衡解离常数： KD=2/1=R.L/RL KD是是平平衡衡解解离离常常数数,为为平平衡衡亲亲和和常常数数KA的的倒倒数数，单单位位为为mol/L，KD越越大大表表示示亲亲和和力越低。力越低。 15设设 受受 体体 和和 配配 体体 的的 初初 始始 浓浓 度度 为为 RT和和LT,R=RT-RL，L=LT-RL，则：，则：v经整理后得：经整理后得：v RL2 RLRT + LT + KD + RTLT= 0 对对特特定定配配体体和和某某一一固固定定量量的的特特定定受受体体，RT和和KD均均是是定定值值，于于是是RL仅仅随随LT而而变，二者呈双曲线函数关系。变，二者呈双曲线函数关系。16v2 2、饱和曲线、饱和曲线v简简单单单单位位点点系系统统RBA应应能能得得到到典典型型的的饱饱和和曲曲线线。以以RL为为纵纵坐坐标标，LT为为横横坐坐标标，得得到到RL随随LT变变化化的的曲曲线线。配配体体的的浓浓度度从从零零开开始始上上升升时时，复复合合物物浓浓度度先先是是上上升升很很快快，以以后后逐逐渐渐变变慢慢，最最后后绝绝大大部部分分受受体体都都与与配配体体结结合合，即受体饱和了。此就是即受体饱和了。此就是饱和曲线。饱和曲线。v饱饱和和曲曲线线趋趋向向水水平平则则说说明明大大部部分分受受体体已已与与配配体结合体结合。1718（1）总结合）总结合（total binding，TB）v受体与标记配体结合时，测量得到的放受体与标记配体结合时，测量得到的放射性还含有一部分（反应管壁吸附、杂射性还含有一部分（反应管壁吸附、杂蛋白吸附、分离不完全等）未与受体结蛋白吸附、分离不完全等）未与受体结合的标记配体的放射性，需将此部分减合的标记配体的放射性，需将此部分减去才能得到特异结合计数。去才能得到特异结合计数。19（2）非特异结合）非特异结合（non-specific binding，NSB）v放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成分结合，称之为分结合，称之为NSB。主要来自杂蛋白、反应器壁、。主要来自杂蛋白、反应器壁、分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小，分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小，不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量呈线不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量呈线性关系。性关系。v常做一系列平行管，条件与常做一系列平行管，条件与TB相同，多加相同，多加200 1000倍非标记配体以取代标记配体与受体结合，测倍非标记配体以取代标记配体与受体结合，测得的即得的即NSB。 20（3）特异结合）特异结合（specific binding，SB）v受体与标记配体结合的放射性计数，无法直受体与标记配体结合的放射性计数，无法直接获得。常用相同浓度的接获得。常用相同浓度的TB减去减去NSB求得。求得。21TBSBNSB22五、离体五、离体RBA的基本方法的基本方法 制备待测受体的离体标本制备待测受体的离体标本加放射性配体温育一定时间加放射性配体温育一定时间终止反应、分离结合与游离部分终止反应、分离结合与游离部分测定结合部分的放射性测定结合部分的放射性数据处理、求出有关参数数据处理、求出有关参数23（一）基本试剂及制备（一）基本试剂及制备v1、受体样本、受体样本v2、放射标记配基、放射标记配基v3、非标记配基、非标记配基241、待测受体标本的制备、待测受体标本的制备 v用用于于离离体体RBA的的标标本本大大体体可可分分为为组组织织切切片片、完完整整细细胞胞悬悬液液、经经初初步步分分离离的的细细胞胞组组分分及及经经增增溶溶或或进进一一步步纯纯化的受体蛋白等。化的受体蛋白等。25v1）组织切片）组织切片v为保持受体活性，常用冷冻组织切片，厚度550 m，将其贴于涂有明胶的玻片上，在温育缓冲液中与标记配体进行反应。反应后洗去游离部分。可刮下切片测量其放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体分布。26v2）完整细胞悬液的制备）完整细胞悬液的制备v血血细细胞胞可可用用通通常常分分离离血血中中有有形形成成分分的的方方法法分分离离。 从从组组织织中中分分离离细细胞胞一一般般是是用用胶胶原原酶酶处处理理组组织织，再再将将游游离的细胞分离出来。离的细胞分离出来。v用用完完整整细细胞胞进进行行RBA的的主主要要优优点点是是可可同同时时观观察察配配体体与与受受体体结结合合的的情情况况和和细细胞胞的的生生物物效效应应，得得到到的的结结果果更更能能反反映映受受体体的的生生理理特特性性。此此外外，还还可可直直接接给给出出平平均均每每个个细细胞胞的的受受体体数数目目。缺缺点点是是在在处处理理过过程程中中有有时时可可能能导导致致细细胞胞表表面面生生理理活活性性的的改改变变。有有时时受受体体在在细细胞胞中中的的含含量量很很低低，则则需需用用较较大大量量的的细细胞胞才才能能作作一一次次实验。实验。27v3）细胞组分的分离）细胞组分的分离v组织匀浆多数RBA使用细胞组分进行分析。其优点是：去除了大部分杂蛋白和内源性配体，减少NSB或其他因素的干扰；受体蛋白得到初步浓缩，受体制剂的富集可获得可靠的实验结果。28组织匀浆组织匀浆沉淀：完整细沉淀：完整细胞、核受体胞、核受体上清液上清液8003500g, 1015 min沉淀：线粒沉淀：线粒体，膜受体体，膜受体上清液上清液10,000300,000g, 1015 min沉淀：微沉淀：微粒体粒体上清液：上清液：浆受体浆受体10,000300,000g, 1015 min292、放射标记配基、放射标记配基1 1）高亲和力、高特异性）高亲和力、高特异性2 2）高稳定性）高稳定性3 3）高比活度）高比活度4 4）高放化纯）高放化纯303 3、非标记配基、非标记配基v用来设立用来设立NSB，可以与标记配基同一物质，可以与标记配基同一物质，也可不同，但必须与受体结合有高亲和力。也可不同，但必须与受体结合有高亲和力。31（二）温育条件（二）温育条件v1、缓冲液、缓冲液 v2、时间与温度、时间与温度 32（三）分离（三）分离v分离的目的是分离的目的是将将已形成的已形成的放射性复合物与游放射性复合物与游离的放射性配体分开离的放射性配体分开，测定其复合物放射性。，测定其复合物放射性。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度，度，低温低温和和快速快速是最有效的措施。是最有效的措施。v常用的分离方法有常用的分离方法有：v1、平衡透析法；平衡透析法；v2、离心法、离心法v3、过滤法、过滤法 33六、定量六、定量RBA的数据处理的数据处理 v定定量量RBA主主要要是是通通过过测测得得的的样样品品的的数数据据及及所所用用标标记记配配体体的的量量和和比比活活度度，通通过过数数学学模模型型进进行行运运算算，得得出出受受体体的有关参数的有关参数RT、KD等。等。341、单点法、单点法v仅取一个浓度点的标记配体，标记配体的量仅取一个浓度点的标记配体，标记配体的量可使受体饱和并略有剩余（过量）。可使受体饱和并略有剩余（过量）。v该法操作简便，标本用量少，但只能给出受该法操作简便，标本用量少，但只能给出受体的最大结合位点数（体的最大结合位点数（RT），无法得了该配），无法得了该配体与受体的亲和力（体与受体的亲和力（KD）。）。35单点法单点法RBARBA的数据处理的数据处理v(1)从实验所得到的总结合从实验所得到的总结合TB减去非特异性减去非特异性结合结合NSB的平均放射性计数（的平均放射性计数（cpm）得到特得到特异性结合异性结合RL的的cpm。v(2)根据仪器测量效率将根据仪器测量效率将RL的的cpm换算成换算成dpm, 用配体的比活度再换算成用配体的比活度再换算成mol。v(3)受体与配体的结合按受体与配体的结合按1：1形成复合物，则形成复合物，则RL的的mol即为受体结合位点的即为受体结合位点的mol数。数。36v(4)另另取取一一定定量量的的样样品品测测蛋蛋白白含含量量或或细细胞胞数数，即即可可算算成成一一定定量量蛋蛋白白或或一一定定细细胞胞数中数中RT的的mol数数,即为即为RT。v(5)还还可可进进一一步步将将mol换换算算成成分分子子数数（1 mol=6.021023个个分分子子），从从而而得得到到单单位位细胞或单位蛋白的受体结合位点数。细胞或单位蛋白的受体结合位点数。37此式中受体与配体为此式中受体与配体为1：1关系，如受体与配关系，如受体与配体以体以1：2关系形成复合物，则上式应被关系形成复合物，则上式应被2除。除。对于完整细胞，则按细胞数进行计算，以对于完整细胞，则按细胞数进行计算，以mol/106细胞或受体位点数细胞或受体位点数/106细胞表示。细胞表示。 38例例v实验室进行外周血实验室进行外周血WBC的的GCR分析，测得分析，测得TB为为4500cpm，NSB为为2500cpm，3H-Dex的的SA为为1.851012Bq/mmol，蛋白量为，蛋白量为1mg，液闪的，液闪的Eff=30%vSB=TB-NSB=4500-2500=2000cpmv2000/（0.3601.8510121）=60fmol/mg39v1mol=6.021023分子分子v60fmol/mg= 6010-156.021023=3.61010受体受体/mg蛋白蛋白若：若：WBC细胞数为细胞数为7.5106个，则个，则RT=3.61010/ 7.5106=4800受体受体/细胞细胞402、多点法、多点法v多多点点法法实实验验可可分分简简单单单单位位点点和和双双（多多）位位点点两两部部分分。常常用用多多点点饱饱和和曲曲线线法法：即即每每一一受受体体标标本本做做688个个标标记记配配体体浓浓度度点点（多多位位点点所所需需浓浓度度点点更更多多），标标记记配配体体的的用用量量应应覆覆盖盖受受体体的饱和区和不饱和曲，以得到饱和曲线。的饱和区和不饱和曲，以得到饱和曲线。v数数据据处处理理是是将将数数学学模模型型直直线线化化，再再将将测测得得数数据据进进行行直直线线拟拟合合，求求出出所所需需参参数数。计计算算机机普普及及后后，人人们们用用计计算算机机进进行行曲曲线线拟拟合合，以以减减少少直线化带来的误差。直线化带来的误差。41vScatchardScatchard作图作图v简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条直线。v以RL/L对RL作图，即为Scatchard作图。在简单单位点系统，应得一直线。斜率是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于RT值。 4243v例：例： 实验室做外周血实验室做外周血WBC的的GCR多点分析，多点分析，3H-Dex的的SA为为38.0Ci/mmol，放化纯为，放化纯为99%，配成工作浓度，配成工作浓度10uCi/ml.441 1、加样程序、加样程序WBC/GCR 3H-DexWBC/GCR 3H-Dex多点多点RBARBA编号编号3H-DexDex(ul)PBS补足体补足体积积ul细胞细胞ululnMTB1104.3890500NSB1104.38585500TB2208.7780500NSB2TB32510.9575500NSB32510.9512.562.5500TB43013.1670500NSB4TB54017.5460500NSB54017.541540500TB65021.9350500NSB65021.932525500452 2、测量结果、测量结果WBC/GCR 3H-DexWBC/GCR 3H-Dex多点多点RBARBA测量结果测量结果编号编号3H-Dex（ul)TB（cpm）NSB（cpm）T(cpm)110178656914453022027992890603253322137536132543036274335905404235211757812065047402690722650463 3、建立、建立NSBNSB的回归方程的回归方程v以以NSB管的管的cpm对对3H-Dex的体积数（的体积数（10、20、25、3040、50）建立回归方程，得到：）建立回归方程，得到： Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997） 将未做的将未做的NSB管对应的管对应的3H-Dex体积（体积（20、40）代入方程，得到）代入方程，得到NSB各管值。各管值。 （10、571）；（）；（20、1097）；（）；（25、1359）；）；（30、1622）；（）；（40、2148）；（）；（50、2673）474、计算、计算B、F和和B/F3H-Dex（ul)SB（cpm）F（cpm）B/F1012151427440.0085122017022862610.0059462519633580030.0054833020054299630.0046634020875738850.0036375020677179100.002879485、换算、换算B相对应的相对应的3H-Dex 物质量物质量 比放比放= SA为为38.0Ci/mmol，放化纯为，放化纯为99%，Eff=42%1、38Ci/mmol=38uCi/nmol=1.406106Bq/nmol2、1nmol=1.406106Bq0.99=1.4202106Bq3、1cpm=1/(0.4260)=0.03968Bq =0.03968/(1. 4202106Bq)=0.0282fmol49换算换算B对应的对应的fmol数数v1215cpm-34.26（fmol）v1702cpm-48.00 （fmol）v1963cpm-55.36 （fmol）v2005cpm-56.54（fmol）v2087cpm-58.85 （fmol）v2067cpm-58.30 （fmol）v以以B对应的对应的fmol数为横坐标，数为横坐标，B/F为纵为纵坐标进行坐标进行Scatchard作图作图506、Scatchard作图作图517、计算、计算RT和和KDvy=0时，对应的为时，对应的为RT 即即 RT=0.01542/0.0001972=78.195fmol 如果细胞数为如果细胞数为7.5106个，则个，则 RT=6276个受体个受体/细胞细胞v截距截距=RT/KD，故，故KD=RT/截距截距 截距为截距为X=0时的时的y值，故：值，故： KD=RT/0.01542=5.07nM52六、六、RBA的应用价值的应用价值v1、受体与疾病、受体与疾病 2、受体与肿瘤、受体与肿瘤 3、受体在药物研究中的应用价值、受体在药物研究中的应用价值1）在在药药物作用机制中的作用物作用机制中的作用 2）在在观观察察药药物毒副作用中的物毒副作用中的应应用用 53v4、受体、受体-配体介导的靶向诊断与治疗配体介导的靶向诊断与治疗 54思考题v1、什么是受体？什么是RBA？RBA的优点？v2、受体的分类、受体与配体作用于特点？v3、什么是饱和曲线、TB、NSB、SB？v4、单点法RBA的数据处理。55