1.概述概述2.生产前期研究生产前期研究3.生产菌改良生产菌改良4.生产工艺过程生产工艺过程5.发酵条件的控制发酵条件的控制6.提取和精制提取和精制1.Introduction2.Research in Lab3.Strain improvement4.Production processing5.Fermentation control6.Isolation & purification 抗抗 生生 素素 发发 酵酵 生生 产产 技技 术术Antibiotics Fermentation Production1抗生素抗生素是生物在其生产活动过是生物在其生产活动过程中所产生，并能程中所产生，并能在低微浓度下有选在低微浓度下有选择性地择性地抑制或杀灭抑制或杀灭其他微生物或肿瘤其他微生物或肿瘤细胞的细胞的有机物有机物。 Antibiotics Any organic substances produced by various organisms that have the power of arresting the growth of other microorganisms or of destroying them.1. 概述概述 Introduction2历史历史1929年，英国弗莱年，英国弗莱明发现青霉素明发现青霉素二战期间，大规模二战期间，大规模发酵生产发酵生产世界上最早用于临世界上最早用于临床的抗菌素床的抗菌素 History Penicillin was discovered by Fleming in 1929.World War II, fermented in large-scale The first major antibiotic to be commercialized1. 概述概述 Introduction3根据抗生素的作用机制分类根据抗生素的作用机制分类 (Modes of Action of Antibiotics) 抑制细胞壁合成抑制细胞壁合成 (Cell Wall Synthesis) ： 青霉素青霉素抑制细胞膜功能抑制细胞膜功能 (Cell Membrane Damage) ： 多烯类抗生素多烯类抗生素抑制蛋白质合成抑制蛋白质合成 (Protein Synthesis) ： 四环素四环素抑制核酸合成抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis) ： 丝裂霉素丝裂霉素 分类分类 Classification1. 概述概述 Introduction4复制复制翻译翻译转录转录5根据抗生素的化学结构分类根据抗生素的化学结构分类-内酰胺类内酰胺类 (-lactam)： 青霉素类青霉素类 (penicillins) 头孢菌素类头孢菌素类 (cephalosporins)氨基糖苷类氨基糖苷类 (aminoglycosides) ： 链霉素、庆大霉素链霉素、庆大霉素大环内酯类大环内酯类 (macrolides) ： 红霉素、麦迪加霉素红霉素、麦迪加霉素四四 环环 类类 (tetracyclines) ： 四环素、土霉素四环素、土霉素多多 肽肽 类类 (polymyxin) ： 多粘菌素多粘菌素 分类分类 Classification1. 概述概述Introduction6 HNONSCH3CH3HCOO-H-lactam ring -内酰胺内酰胺 环环Rnatural penicillin R =CH2-CO-7-内酰胺内酰胺 环环8两性霉素两性霉素Antibiotics are so complex they can only be synthesized in a living system9产生菌的筛选产生菌的筛选抗菌性试验抗菌性试验提取、精制、鉴定提取、精制、鉴定毒性试验毒性试验药理和临床试验药理和临床试验Screening of a strainAntimicrobial trialIsolation, purification and identificationToxicological trial Medicinal & clinical trial 2生产前期研究生产前期研究 Research in Lab10 Agar diffusion assayagar plate琼脂培养基琼脂培养基lawn of test bacteria测测 试试 菌菌 苔苔filter papers soakedwith test compounds含含 药药 物物 滤滤 纸纸zones of inhibition(no growth)抑菌圈抑菌圈11分分 析析 仪仪 器器Analytical instruments现代分析仪器：现代分析仪器：核磁共振核磁共振毛细管电泳毛细管电泳气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱质谱质谱Modern analytical instruments:Nuclear magnetic resonance (NMR)Capillary electrophoresis(CE)Gas chromatography (GC)High performance liquid chromatography (HPLC)Mass spectroscopy (MS) AutomationSensitivityAccuracy自动灵敏准确自动灵敏准确12人工诱变法：人工诱变法：紫外线紫外线、X-线、线、r-线线照射照射亚硝基胍亚硝基胍、亚硝酸、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等秋水仙素、氮芥等诱变剂处理诱变剂处理Conventional strain selectionPhysical mutagen eg. Ultraviolet RadiationChemical mutagen eg. Nitrosoguanidine (NTG)Improved strain can be selected empirically 3. 抗生素抗生素生产菌改良生产菌改良 Strain Improvement13基因工程Genetic Engineering 3. 抗生素抗生素生产菌改良生产菌改良 Strain ImprovementRecombinant DNA Technology （DNA重组技术）克隆克隆14Strain Improvement Scale-upStrain出发菌株出发菌株Agar plate平板技术平板技术Primaryshake flaskEvaluation摇瓶培养摇瓶培养Secondary shake flask evaluationdifferent media二级摇瓶培养二级摇瓶培养各种培养基各种培养基Lab fermentor evaluationProductionCondition小型发酵罐小型发酵罐模拟生产条件模拟生产条件Mastercell bankWorkingcell bankInoculumDevelopment菌种扩大培养菌种扩大培养Pilot plantEvaluation中试生产中试生产ProductionEvaluation生产生产60003003031Possiblerecycle1516Scale-up（比拟放大）比拟放大）models models EL Gadden Jr 200 m3Same productivity ?Limitations ?模模 拟拟17摇瓶发酵摇瓶发酵 Shake-flask fermentation10-50 ml in 125-500 ml flaskBatch onlyLimited control: temperatureSlow metabolizing carbohydrateAmbient pressureBuffers needed to control pHIn-process sampling difficultVolume decrease by evaporationSolid growth on side wallsAntifoam not neededAgitation limited: shaker speedNo control of dissolved oxygen装液量：10% (250ml)间歇培养温控受限制代谢碳水化合物慢常压缓冲液控制pH在线取样难容量减少瓶壁上结垢无需消泡搅拌受限制无法控制溶解氧18搅搅 拌拌 罐罐 发发 酵酵 Stirred tank fermentation10-100,000升容量间歇和补料培养连续控制：pH，温度需要铵盐或氨气2 大气压无需缓冲液在线取样易补料,容量增加 生长均匀一致需消泡多种搅拌 控制溶解氧:通气,加压10-100,000 liter vesselsBatch and feed possibleContinuous control: pH, temperatureAmmonium salts or ammonia neededPressure at two atmospheres possibleNo buffers necessary In-process sampling easyVolume increase by sugar feedVery uniform growthAntifoam often requiredWide variety of impellers and bafflesDissolved oxygen controlled by aeration, pressure19摇摇 瓶瓶 发发 酵酵 Shake-flask 装液量：10% (250ml)间歇培养温控受限制代谢碳水化合物慢常压缓冲液控制pH在线取样难容量减少瓶壁上结垢无需消泡搅拌受限制无法控制溶解氧10-100,000升容量间歇和补料培养连续控制：pH，温度需要铵盐或氨气2 大气压无需缓冲液在线取样易补料,容量增加 生长均匀一致需消泡多种搅拌 控制溶解氧:通气,加压搅搅 拌拌 罐罐 发发 酵酵 Stirred tank 20菌种 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品包装Strain Preparation of seed Fermentation Treatment of broth Isolation & purification Package of product4. 抗生素生产工艺过程抗生素生产工艺过程Antibiotics Production Processing21A scheme of the material flow in an antibiotic production 22A scheme of the material flow in an antibiotic production 连消连消发酵罐发酵罐缓冲罐缓冲罐种子罐种子罐23发酵生产原料发酵生产原料 Materials for FermentationCarbon source:Beet & cane molassesGlucose, lactose, starchEthanol, methanol GlycerolMaltose syrup, corn syrupCottonseed oil, peanut oil, soy oilLard oil Methyl oleate Tallow碳源碳源:甜菜和甘蔗糖蜜甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇乙醇，甲醇甘油甘油麦芽糖浆，玉米糖浆麦芽糖浆，玉米糖浆绵绵籽籽油，花生油，豆油油，花生油，豆油猪油猪油油酸甲酯油酸甲酯油脂油脂24氮源氮源:绵绵籽籽粉粉玉米粉和玉米浸出液玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面大豆粉和大豆面花生粉花生粉菜籽粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液牛血，酪蛋白水解液乳清乳清鱼粉鱼粉酵母酵母酵母膏酵母膏肉粉和骨粉肉粉和骨粉 Nitrogen source:Cotton seed meal Corn meal & steep liquorSoybean meal & flour Peanut meal Rapeseed mealBeef blood, Casein hydrolysate Whey Fish mealWhole yeastYeast extractMeat & bone meal 发酵生产原料发酵生产原料 Materials for Fermentation25 培培 养养 基基Media for Cell Growth & Final productionComponents Range % 组组 成成Glucose/ sucrose 3.0-5.0 葡萄糖/ 蔗糖Starch 淀粉 3.0-5.0Corn steep liquor 3.0-5.0Calcium carbonate 0.5-1.0 碳酸钙Phosphate 磷酸盐 0.1-0.5Ammonium sulphate 0.1-1.0 硫酸胺Urea 尿素 0.1-0.5Oil 油 0.1-0.5Fermentation 发酵培养基发酵培养基 Components Range % 组组 成成Glucose 0.5-1.0Starch 0.5-5.0Corn steep liquor 5.0-8.0 玉米浸提液Soy flour 1.0-5.0Phosphate 0.1-1.0Ammonium sulphate 0.5-1.0 and fed periodicallyOil 1.0 and fed continuouslyCorn syrup fed continuously 玉米糖浆 连续加料 Tank seed 种子培养基种子培养基26Stirred tank Fermentation 搅拌发酵搅拌发酵275. 发发 酵酵 控控 制制Fermentation Control Sample AnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressure probeLevel probepH probeTemp. probeDO probeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed28ScaleWeight SignalPump SpeedAmplifierControllerSupervisoryComputer Flow Rate Control 流量控制流量控制29发发 酵酵 控控 制制 Fermentation control30菌种菌种 (strain)：产黄青霉菌：产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)孢子培养孢子培养 (spore cultivation)：25 C, 6-7 d种子培养种子培养 (seed cultivation)： 25 C， 2-3 d 发酵培养发酵培养 (fermentation)： 22-26 C, 6-7 d加糖控制加糖控制 (sugar feeding)：残糖降至：残糖降至0.6 青青 霉霉 素素 发发 酵酵 (1) Penicillin Fermentation31补氮补氮 (nitrogen feeding)：氨控制在：氨控制在 0.01-0.05前体前体 (precursor)：残余苯乙酰胺：残余苯乙酰胺 0.05-0.08温度控制温度控制 (temperature)：前期：前期 25-26 C 后期后期 23 C通气与搅拌通气与搅拌 (aeration & stir)：1 : 0.8 VVM泡沫泡沫 (foam)：天然油脂：天然油脂, 如豆油如豆油 青青 霉霉 素素 发发 酵酵 (2) Penicillin Fermentation32Penicillin Fermentation Profile 变化曲线变化曲线33