一、病毒的分离标本的处理 蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等）病毒的分离 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒 “全程冷链全程冷链”1 1动物接种动物接种动物分离病毒法：乳小白鼠（物分离病毒法：乳小白鼠（3日日龄）优点：点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；缺点：缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差异；接种途径：接种途径：脑内接种脑内接种皮下接种皮内接种腹腔接种肌肉接种静脉接种实验动物的观察：实验动物的观察：动物的发育、活动力、食欲和粪便特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、瘫痪、抽搐等直至死亡有些实验还需测量动物的体温和体重（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变 组织培养分离法：培养分离法：没有没有隐性感染性感染没有免疫能力的抵抗力没有免疫能力的抵抗力接种量大接种量大培养条件易于控制培养条件易于控制加速病毒的分离加速病毒的分离过程程汉坦病毒敏感的培养坦病毒敏感的培养细胞胞l首先发现人肺癌细胞（A549）l其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等2 2组织培养组织培养细胞病变细胞病变（CPE ）：）：1、分布均匀的小颗粒状破坏病变；2、局灶状小颗粒状破坏；3、细胞圆化，呈局灶性葡萄状的堆积；4、细胞融合。圆缩；脱落；聚集；破碎；3鸡胚培养鸡胚培养优点：优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便；缺点：缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；4蚊虫分离病毒法蚊虫分离病毒法经口感染经口感染胸腔接种胸腔接种优点：优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大；缺点：缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；强调点强调点：实验室生物安全n实验室安全是重中之重，如果实验室的条件不具备，建议不要开展病毒分离工作；n在进行相关实验的时候一定要严格按步骤操作；n实验过程中一定要做好严格防护。1）蚀斑（蚀斑（plaque）测定）测定 可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU） 2）50%感染量或感染量或50%组织感染量（组织感染量（ID50或或TCID50）测定）测定（一）（一）病毒的数量与感染性测定病毒的数量与感染性测定 二、病毒的鉴定结晶紫染色中性红染色 1）病毒核酸类型的测定）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定）血清学鉴定 ELISA；IFA；（二）（二）病毒理化性质及血清学鉴定病毒理化性质及血清学鉴定阳性分离物上清阳性分离物上清提取提取总RNA反反转录合成合成cDNA直接直接测序或克隆序或克隆测序序PCR扩增增（三）（三）病毒分子生物学鉴定病毒分子生物学鉴定什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应n聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由由K. Mullis于于1983年建立年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列序列的相互作用。的相互作用。 PCR技术的工作原理技术的工作原理PCR操作过程操作过程1、预变性（预变性（Initial denaturation）：）： 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95加热3-5分钟；2、引物退火（引物退火（Primer annealing）：）：退火温度一般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有较大影响；3、引物延伸（引物延伸（Primer elongation）：）：引物延伸一般在72 进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩增片段长短而定；4、循环中的变性步骤：循环中的变性步骤：循环中一般95，30秒足已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；5、循环数：循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产生非特异条带；6、最后延伸：最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。PCR的各种变体的各种变体反向PCR（Inverse PCR，IPCR）不对称PCR（Asymmetric PCR）多重PCR荧光定量PCR（Q-PCR）反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）巢式PCR（NEST PCR）递减PCR（Touchdown PCR）可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反反转转录录PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是是一一种种简简单单、快快捷捷地地对对RNA进进行行定定性性、定定量量分分析析的的方方法法。它它是是以以mRNA为为模模板板，体体外外扩扩增增cDNA，再再以以cDNA为为模模板板进进行行特特定定基基因因转转录录产产物物的的PCR扩扩增增。RT-PCR技技术术一一般般用用于于RNA的的定定性性分分析析；如如果果设设置置阳阳性性参参照照，则则可可对对待待测测RNA样品进行半定量分析。样品进行半定量分析。该该方方法法适适合合对对待待测测样样品品进进行行初初步步筛筛选选，目目前前已已广广泛泛被被实实时时定定量量PCR替代。替代。1反转录反转录PCRTrans反转录酶系列 常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 实实 时时 定定 量量 PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是是定定量量分分析析mRNA的的最最通通用用、最最快快速速、最最简简便便的的方方法法，该该方方法法是是对对PCR反反应应进进行行实实时时监监测测，具具有有很高的灵敏度和特异性。很高的灵敏度和特异性。2实时定量实时定量PCRSYBR Green实实时时定定量量PCR分分析析原原理理示示意意图图 *目前有目前有5种技术用于实时定量种技术用于实时定量PCR 其其中中最最经经济济、简简便便的的技技术术是是利利用用荧荧光光染染料料（如如SYBR Green ）与与双双链链DNA分分子子结结合合发发光光的的特特性性，指指示示扩扩增增产产物的增加；物的增加； 其其他他4种种方方法法都都是是以以荧荧光光染染料料标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸为为探探针针与与正正确确的的扩扩增增子子杂杂交交，包包括括5核核酸酸酶酶法法（即即人人们们熟熟知知的的TaqManTM）、分分子子信信标标、ScropionsTM和和探探针针杂杂交交法法，它它们们拥拥有有更更强强的的特特异异性性，可可以以避避免免对对PCR后后溶溶解解曲曲线线的的需需求求，以以及及后后续续的的Southern杂杂交交或或对对扩扩增增子子的的测测序序鉴鉴定定，但是但是成本较高成本较高。3.DNA芯片技术芯片技术nDNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡在固相支持物上有序固化寡核苷酸或核苷酸或DNA探针，与待测探针，与待测荧光标记样品进行杂交；荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传较和分析，得出样品的遗传信息信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。基因芯片工作流程基因芯片工作流程三、生物信息学是预测基因组结构和功三、生物信息学是预测基因组结构和功能的重要手段能的重要手段n数据库的建设：数据库的建设：汇集汇集了大量了大量DNA序列、蛋白序列、蛋白质信息质信息预测基因、基因产物的预测基因、基因产物的结构、功能；分析基因结构、功能；分析基因-基因、基因基因、基因-产物、产物产物、产物-产物之间的相互作用或产物之间的相互作用或联系；描述细胞或整体联系；描述细胞或整体水平的基因表达谱；推水平的基因表达谱；推测系统发生关系。测系统发生关系。人类X染色体图谱NCBI数据库数据库NCBI首先创建首先创建GenBank数据库数据库 于于19911991年年开开发发了了Entrez数数据据库库检检索索系系统统，该该系系统统整整合合了了GenBank、EMBL、PIR和和SWISS-PROT等等数数据据库库的的序序列列信信息息以以及及MEDLINEMEDLINE有有关关序序列列的的文文献献信信息息，并并通通过过相相关关链链接接，将将他他们们有机地结合在一起有机地结合在一起NCBI还还提提供供了了其其他他数数据据库库，包包括括在在线线人人类类孟孟德德尔尔遗遗传传( (OMIM）、三三维维蛋蛋白白结结构构的的分分子子模模型型数数据据库库（MMDB）、人人类类基基 因因 序序 列列 集集 成成 （ UniGene） 、 人人 类类 基基 因因 组组 基基 因因 图图 谱谱（GMHG）、生物门类（）、生物门类（Toxonomy） 等数据库等数据库p 引物设计- Primer Premier5.0p PCR扩增和序列测定p 序列拼接DNAStar：SeqManp BLAST-序列比对确定病原p ClustalX -序列比对 p BioEdit - 综合序列分析软件p MEGA5-系统发生分析p MegAlign-相似性分析p GeneDoc-序列差异分析、保守性分析常用分子生物学软件常用分子生物学软件