Rh（D）血型鉴定及临床输血策略1 1RH血型的研究历史19世纪40年代发现了人类红细胞RH血型19世纪60年代,发现了RH血型不合的有效治疗方法19世纪80年代,成功分离了RH蛋白19世纪90年代,认识了RH基因结构20世纪90年代,清楚了RHD和RHCE的氨基酸序列2 2RH血型系统的发现1940年,发现多数人红细胞上有一种血型抗原物质,与恒河猴（Rhesus monkey)红细胞的抗原物质是相同的.1940年还发现,三例ABO血型相同，同种输血后却发生了严重的输血反应.同一年，一名O型孕妇产后大出血，输入O型丈夫的血液后发生了溶血性输血反应，这是人类由于妊娠产生的同种免疫作用的第一例报告这就表明除ABO血型系统外,还存在另外的血型系统.3 3RH血型系统的命名“Rh”是根据恒河猴英语单词的前两位字母而由来我们现在通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性RH系统还有C、c 、E 、e 四种抗原，也有用1、2、3、4、5来表示，D+红细胞有用RH1表示，而D-细胞用RH-1来表示，相应的等位基因用R1和R-1来表示4 4RH血型的意义临床意义很大!RH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有，比率为0.3%左右，在欧美等白种人中，比例较高为15%左右。RH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应，胎、母RH血型不合的妊娠有可能发生新生儿溶血病，严重者可导致新生儿死亡,或是使胎儿死于子宫内。RH血型的检查和ABO血型同等重要，已被列为血型的常规检查之一。5 5RH血型是如何遗传的?RH(-)基因是隐性基因。当RH阳性的父母都带有RH阴性基因，且同时遗传给后代时，其后代即表现为RH阴性。当双亲中有一人是RH(-)时，其子女为RH(-)的机会增大。6 6RHD(-)有何意义?正常RHD阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RHD阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RHD阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就可能发生严重的输血反应甚至造成死亡。RHD阴性的妇女怀有RH阳性的胎儿，胎儿的红细胞就会刺激母体产生抗-D抗体，当再次怀有RHD阳性的胎儿时，可以导致新生儿溶血性贫血而死亡。7 7RHD(-)者如何自我保护?RHD阴性者一般情况下尽量避免输入RHD阳性的血液，必须输注相同的RH阴性血，以免由于RHD血型不合而发生输血反应。80%的RHD阴性病人在输入200ml阳性红细胞后，在2-5个月后，血浆中可检测到抗体。RHD阴性的妇女应注意婚后避免流产，保证第一胎正常分娩，以防发生RH新生儿溶血病。有资料统计14.3%的多次妊娠的D阴性孕妇产生抗-D抗体，导致新生儿溶血病。8 8血站为RHD(-)者做哪些工作?常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者。对有流产史的RH阴性的妇女，在妊娠初期做一些关于RH血型系统的产前免疫检查。一旦发生RH新生儿溶血病，立即用RH阴性的同型血液进行换血治疗，挽救新生儿的生命。9 9关于关于RhDRhD表型表型1.RhD1.RhD阳性阳性 中国汉族：约中国汉族：约99.7%99.7% 白人：约白人：约85%85%2.RhD2.RhD阴性阴性 中国汉族：约中国汉族：约0.03%0.03% 白人：约白人：约15%15%3.3.弱弱D D（Weak D)Weak D)4.4.部分部分D D（Partial D)Partial D)5.Del5.Del型型现今的称谓：现今的称谓：D VariantD VariantD VariantD Variant（D D D D变异型）变异型）变异型）变异型）1010弱弱D D型型(Weak D)(Weak D)血清学表现为盐水介质阴性,IAT检测为阳性.D抗原数量的减少,但抗原表位数目基本不变.抗原的质量不变碱基突变形成，改变的氨基酸位于细胞膜层的中间或细胞膜层内1111部分部分D(Partial D)D(Partial D)红细胞缺少某些（部份）的抗原表位与正常抗原相比，抗原的质量发生了变化.(正常红细胞上抗原包含个表位）形成原因：基因单或多核苷酸碱基取代、杂交基因。所改变的氨基酸位于抗原分子的细胞膜外部分.1212部分的危险性部分的危险性许多部分的红细胞与抗直接反应，但有些需要用才能鉴定，细胞的反应强度不一样，取决于试剂的制造商部分的个体是可以产生抗，因此必须接收的血液，在日常工作中许多部分都被定为，往往在产生抗体以后才被发现1313DELDEL型型(D (D 放散型放散型) )盐水介质阴性,IAT检测阴性,但吸收放散试验阳性.红细胞上D抗原数目比弱还要少,红细胞上D抗原的质量也有变化的某些型红细胞抗原缺失某些表位，可以产生抗抗体.第九外显子碱基突变形成.1414典型的抗原密度比较典型的抗原密度比较抗原型别红细胞上抗原数正常阳性个体10.000 - 30.000部分型个体Weak D 型个体DEL 型个体1515各种实验对应的试剂各种实验对应的试剂血型血清学 分子生物学单克隆抗-D PCR试剂盒（商品化）IgM IgG 自行设计引物（难度大）IgM + IgG多克隆抗-D 如何用？何时用？能解决什么？如何用？何时用？能解决什么？D D抗原的检测方法抗原的检测方法1616RHDRHD血型鉴定流程血型鉴定流程盐水介质检测阳性阴性抗人球蛋白介质阳性阴性阳性加做直抗实验吸收放散实验阴性放散实验再次定型阳性阴性 DelPCR-SSP受检标本Weak D/Partial D测序1717RHDRHD基因进化基因进化RHAGRHceRHce和RHce复制体RHCE基因和RHD基因1818RHDRHD基因的进化基因的进化RHD基因的祖先基因是Rh 相关糖蛋白基因(RHAG 基因),该蛋白有一条N多糖链.RHAG和RHD、RHCE有38%的同源性，在红细胞上具有相同的拓扑结构，由位于6号染色体上的单个基因编码。RHAG不具有多态性，所以它不携带血型抗原，但是它对RHD和RHCE定向到膜上有重要作用。没有RHAG，RHCE和RHD都不能表达到红细胞膜上.在红系的分化中先表达RHAG,然后表达RHCE,再表达RHD.RHAG基因首先复制形成Rhce基因, 第二次复制发生在同一染色体短臂,形成“Rhce 复制体”,随后Rhce基因 和其复制体沿不同的途径进化,最终形成现今人类的RHD基因,而RHce 基因经过突变或与RHD基因发生交换形成常见的Rhce RHcE RHCe RHCE基因.1919RhDRhD基因结构基因结构RH基因结构目前已确定:位于染色体1p34.3-36.1,主要由RHD和RHCE两个基因组成.这两个基因的 3, 端相对,相隔约有 3万bp.在它们之间为小膜蛋白1基因(SMP1),即SMP1基因.在RHD基因两侧各有一段约9000bp 的侧翼序列片段,称为RH盒子(Rhesus box )序列,5端为上游R盒子(Upstream),长9142bp ,3端为下游R盒子(Downstream Rhesus box),长为9145bp ,上下游盒子方向相同,与RHD基因一致.RHD和RHCE基因各由10个外显子组成,二者有43个碱基有差异,其中第1、2 、8外显子序列基本一致，所以绝大多数RHD基因测定中，引物选择扩增RHD基因的3-7以及9-10外显子。通常只有D抗原阳性个体拥有一或二条RHD基因，而D阴性个体则缺失RHD基因，RHD阴性个体的RHD基因缺失发生在上下游盒子之间，并形式一个融合（Hybrid Rhesus box)。2020RHDRHD基因基因locuslocus2121RH RH 和基因结构图和基因结构图1p36.112222RHDRHD等位基因的形成等位基因的形成基因缺失：RHD基因完全缺失形成RHD(-)单倍体；基因交换：由于RHD基因和RHCE基因在RH座位上方向相反，二个同源基因之间发生交换的机率增大，通常RHCE基因为供者基因，RHD为受者基因；碱基变异：包括突变、缺失、mRNA拼接位点变异等。 2323近几年的研究发现近几年的研究发现 D基因结构存在种族差异,RhD(-)白种人中,D基因是完全缺失的.在黑人中,RHD（-）个体，D基因却完整存在，66%的D基因在第3内含子和第4外显子之间有37bp的插入片断，导致了抗原的不表达。黄种人中RhD(-)个体表现出明显的多态性.2424黄种人黄种人D D基因的多态性基因的多态性D基因完全缺失(10个外显子全部缺失)导致了D抗原的不表达.D基因的部分缺失,(有两边缺失和中间缺失)导致D抗原的不表达.D基因完整存在,(碱基突变),导致D抗原不表达.2525RHDRHD基因阳性、基因阳性、D D抗原阴性等位基因抗原阴性等位基因 基因交换形成的融合等位基因基因交换形成的融合等位基因2626RHDRHD基因阳性、基因阳性、D D抗原阴性等位基因抗原阴性等位基因 碱基变异形成的等位基因碱基变异形成的等位基因2727DelDel等位基因等位基因 2828All DEL alleles are associated with Ce2929RhDel型基因变异K409K又叫1227A,指第九外显子最后一个基因GA突变，也是第九外显子与第九内含子拼接位点的碱基突变，虽然位置氨基酸末改变，但是剪接点突变导致产生了不正常的抗原3030弱弱D D等位基因（种）等位基因（种）3131部分部分D D等位基因等位基因3232 中国人中国人RhDRhD分子背景分子背景3333中国人RhD分子背景D阳性个体的RHD基因与在其它民族中报道的正常RHD基因序列相同；真实D阴性中国人中以RHD-CE(2-9)-D2等位基因为主，比率为10.5%；同时还存在比率不低的个体因碱基变异导致RHD基因ORF错位，导致正常D抗原不能表达。在真实D阴性中国人中RHD基因总阳性率为15.8%3434中国人RhD分子背景中国人Del个体主要携带RHD 1227A等位基因(K409K)。该等位基因是Genbank收录的第一个Del等位基因 (GenBank记录AF390110)，但也是中国人中唯一发现的Del等位基因，而在欧洲人中除RHD1227A等位基因外，还观察到另外几种Del等位基因弱D表型个体目前发现主要是弱D15型、还发现了2例RHD 1227A等位基因携带者；部分D表型观察到DVa(Hus)和DVI III型。 3535中国人RHD等位基因3636RHDRHD基因分型技术的应用基因分型技术的应用血清学定型结果难以判定,为了防止某些弱D被误定为RH-,用分子生物学检测作为辅助手段；D抗原弱阳性个体的弱D型或部分D型别的鉴定；通过羊水预测胎儿的D表型；慢性多次输血患者、大量输血患者、同种免疫或自身免疫溶血性贫血患者、以及红细胞直接抗球蛋白实验阳性患者的D抗原表型的检测和纠正；对于中国人，鉴定Del表型 37373838中国人中国人RHDRHD的未来研究方向的未来研究方向 真实D阴性个体RHD基因序列研究，进一步了解产生中国人D抗原阴性的特性分子机制，发现更多的RHD等位基因 ：D抗原弱表现型个体的分子背景研究，用以了解中国人弱D和部分D表型的常见型及频率。目前在中国人中观察到的弱D型是弱型和二种部分D型，而国际上报道的弱D型确有很多种，而不同分子机制形成的其它部分D表型也很多3939中国人中国人RHDRHD的未来研究方向的未来研究方向有关Del研究，Del在中国人中比率非常高，综合近几年的文献，在经IAT确认的D阴性群体中平均为28.1%。尽管目前国家没有要求DEL型血液不能供应给临床,但是从理论上来讲,DEL型是有可能刺激机体产生抗体的。稀有血型的分子生物学研究和调查。 40401.RhD阳性/阴性，同型输注2.D2.D变异型的输血变异型的输血2.1弱D的围产期妇女被误定为D-，而给予了不必要的RHD免疫球蛋 白，同样是无害的2.2弱D血液被误定为D-,而输注给了D-患者，要注意，尽管弱D抗原免 疫原性较弱，但也可能使D-者致敏2.3弱D1.2.3型产生抗-D可能性较小，弱D11和15型已有产生抗-D的报 道，其他弱D产生抗体的风险不清楚。RHDRHD血型输血策略血型输血策略2.4部分D患者输入D+血液后，可能会产生针对其缺失抗原部分的抗-D41413.急救情况下的输血3.1正常成年男性或不需再生育女性3.2未生育女性：要高度重视，见临床输血技术规范临床输血技术规范第十条 对于Rh（D）阴性和其他稀有血型患者，应采用自身输血、同型输血或配合型输血。第十五条 输血科（血库）要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型（正、反定型），并常规检查患者Rh（D）血型（急诊抢救患者紧急输血时Rh(D)检查可除外），正确无误时可进行交叉配血。RHDRHD血型输血策略血型输血策略4242不同型输注产生抗不同型输注产生抗-D-D的频率的频率并非所有D-患者输入D+红细胞后都会产生抗-D自愿者反复免疫后产生抗-D的概率为80-90%住院D-患者输注D+血液后，产生抗-D的约为32%D-孕妇孕育D+胎儿后，产生抗-D的大约占10%（未公开资料）RHDRHD血型输血策略血型输血策略4343最安全的做法最安全的做法弱D/部分D血型的供者应当作为D+血液进行标注，输给D+患者弱D/部分D血型的受者应当作为D-血型对待，输注D-血液（有争议，但安全起见，应当给予阴性血液）缺点可能浪费了D-血液RHDRHD血型输血策略血型输血策略44444545