PCR特异性扩增特异性扩增DNA片段片段 北京四中北京四中 赵晓刚赵晓刚课标标准课标标准具体内容标准具体内容标准活动建议活动建议尝试尝试PCRPCR（ Polymerase Chain Reaction）技术的基）技术的基本操作和应用本操作和应用用某一片段进行用某一片段进行PCRPCR扩增扩增实验目的实验目的 1 1、PCRPCR技术扩增特异性技术扩增特异性DNADNA2 2、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测一、实验室准备一、实验室准备二、实验准备二、实验准备三、教学组织三、教学组织一、实验室准备一、实验室准备1、PCR仪仪（1）美国）美国MJ RESEARCH Minicycler （2）德国）德国Eppendorf产品产品 一、实验室准备一、实验室准备2、移液器、移液器（1）德国德国Eppendorf（2）芬兰芬兰 Thermo Scientific Finnpipette一、实验室准备一、实验室准备3、灭菌锅、灭菌锅一、实验室准备一、实验室准备4、离心机、离心机一、实验室准备一、实验室准备5、电泳仪、电泳仪北京六一仪器厂北京六一仪器厂川布兰公司川布兰公司一、实验室准备一、实验室准备二、实验准备二、实验准备三、教学组织三、教学组织二、实验准备二、实验准备（课前）（课前）（一）（一）PCRPCR准备工作准备工作1 1、人性别鉴定试剂盒、人性别鉴定试剂盒（克隆（克隆Y Y染色体染色体SRYSRY基因）基因）组成成分含量加ddH2O量ddH2O220L10Xbuffer+MgCl230LdNTP mixture7L引物引物0.1OD40L引物引物0.1OD40L Taq DNA聚合酶聚合酶5L（1 1）在引物管中各加入）在引物管中各加入40L ddH40L ddH2 2O O，充分溶解，充分溶解 ，离心备用，离心备用（2 2）4 4位同学一组，上课前位同学一组，上课前1515分钟，每个实验台上摆放好一个两面分钟，每个实验台上摆放好一个两面板（上面要摆上板（上面要摆上2 2个灭菌的个灭菌的0.2mL0.2mL离心管离心管），一个冰盒（含上表试剂），一个冰盒（含上表试剂），2 2支移液器，一盒灭菌支移液器，一盒灭菌10L10L吸头，一把剪刀，一个废液缸（烧杯）吸头，一把剪刀，一个废液缸（烧杯），1 1记号笔。记号笔。4人一组的仪人一组的仪器和试剂器和试剂2.2.学生操作学生操作10Xbuffer10Xbuffer 4L 4LdNTP mixturedNTP mixture0.8L0.8L引物引物 1L 1L引物引物 1L 1LddHddH2 2O O12.6L12.6LTaq DNATaq DNA聚合聚合酶 0.6L 0.6L 1uL12.4uL教师与提供试剂公司进行协调，技术人员做预实验教师与提供试剂公司进行协调，技术人员做预实验3.PCR3.PCR程序设计程序设计 循环温度时间循环次数预变性9430s变性9420s25次退火5220s延伸7220s保温7230s（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准备（二）电泳相关实验准备1、琼脂糖凝胶电泳试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒组成成分组成成分分装量分装量琼脂糖40.25gDNA Marker30L50电泳缓冲液20mL核酸荧光染料80L6Loading Buffer80L0.5mL的离心管1包（25个/包）（1 1）将）将5050电泳缓冲液稀释成电泳缓冲液稀释成1 1电电泳缓冲液（即泳缓冲液（即20mL 5020mL 50电泳缓冲液电泳缓冲液中加入中加入980mL 980mL 蒸馏水，稀释成蒸馏水，稀释成1L1L的的1 1电泳缓冲液）电泳缓冲液）（2 2）制备）制备2 2块胶备用块胶备用（3 3）将）将6 6loading bufferloading buffer和核酸荧光染料各取和核酸荧光染料各取30L30L，充分混匀，然后取充分混匀，然后取2424个个0.2mL 0.2mL 离心管，每管分离心管，每管分2L2L的混合的混合物，物，置于置于学生的学生的两面板上两面板上备用备用一、实验室准备一、实验室准备二、实验准备二、实验准备三、三、教学组织（教学组织（2节课时间）节课时间）三、教学组织三、教学组织（2节课时间）节课时间）（一）第（一）第1节课节课1 1、PCRPCR条件和原理条件和原理（10min10min）2 2、移液器的使用、移液器的使用（5min5min）3 3、配置反应体系、配置反应体系（10min10min）4 4、PCRPCR程序设计和反应程序设计和反应5 5、教师将反应后体系、教师将反应后体系-20-20保存保存三、教学组织三、教学组织（2节课时间）节课时间）（二）第（二）第2节课节课1 1、电泳原理、电泳原理（5min5min）2 2、胶的制备、胶的制备（5min5min）3 3、染色、点样、染色、点样（5min5min）4 4、电泳约、电泳约20min20min（继续按进度讲课或学生观摩）（继续按进度讲课或学生观摩）5 5、观察、观察（下课前（下课前5min5min）三、教学组织三、教学组织 （仅供参考）（仅供参考）问题问题1.1.体内体内DNADNA复制的条件？复制的条件？问题问题2.2.体内体内DNADNA复制的特点复制的特点？问题问题3.3.如果只复制特定如果只复制特定DNADNA片片段（段（Gene2Gene2）呢？）呢？一、一、PCRPCR的原理和条件（的原理和条件（10min10min）( (一一) )、PCRPCR的原理和条件的原理和条件1.1.原理原理 变性变性 退火退火 延伸延伸 2.2.条件条件 模板模板DNADNA 引物（保证复制的精确起始）引物（保证复制的精确起始） 4 4种脱氧核糖核苷三磷酸种脱氧核糖核苷三磷酸 DNADNA聚合酶聚合酶(二)、PCR实验操作1.实验目的 PCRPCR扩增人类性别决定基因扩增人类性别决定基因SRYSRY，并检测，并检测2.2.实验材料和器具实验材料和器具 2.12.1男生男生2 2根带有明显毛囊的头发根带有明显毛囊的头发 女生女生2 2根作对照根作对照2.2 2.2 移液器、吸头、移液器、吸头、 离心管离心管 每取一种试剂更换枪头每取一种试剂更换枪头,每位同学尝试用移液器一次每位同学尝试用移液器一次 2.3 2.3 人性别鉴定试剂人性别鉴定试剂3.3.配制反应体系配制反应体系（10min10min）A A10Xbuffer 4LdNTP mixture0.8L引物 1L引物 1LddH2O12.6LTaq DNA聚合酶 0. .6L 循环温度时间循环次数1预变性9430s2变性9420s25次3退火5220s4延伸7220s5保温7230s4.PCR程序设计（10分钟）B5、教师将反应后体系、教师将反应后体系-20保存保存作业：作业： 已知已知DNA聚合酶合成聚合酶合成DNA的速度是的速度是1000碱基碱基/min,克隆克隆1500bp基因，基因，75min理论上能合成该基理论上能合成该基因的数目约是？（已知变性因的数目约是？（已知变性30S，退火，退火30S） 230 思考：思考：PCRPCR实验结束后如何鉴定实验结束后如何鉴定是否克隆到是否克隆到SRYSRY基因呢？基因呢？ 三、电泳三、电泳 1.1.原理原理 琼脂糖凝胶电泳常用于琼脂糖凝胶电泳常用于DNADNA、 RNA RNA大片段的分离，大片段的分离，核酸磷酸基团核酸磷酸基团 带负电荷可向阳极移动，在电场驱动力带负电荷可向阳极移动，在电场驱动力和凝胶阻力作用下，不同分子量的核酸分子迁移率不和凝胶阻力作用下，不同分子量的核酸分子迁移率不同。同。 2.2.实验操作实验操作2.2 2.2 染色、点样染色、点样B B2.3 2.3 电泳电泳(20min)(20min)观察观察C C2.1 2.1 制胶制胶A ATHANKSTHANKS