真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素第四章 真核基因在大肠杆菌中的表达俊蓖风铀饱诞鼻跟欺田闭跨燕撇封废茸侗敬誓矫平蹈耶藤尖宋硷杉裳枫毫真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核大肠杆菌表达体系克隆基因正确表达的基本条件克隆基因表达活性的检测澳郁蹄趣咏政悉涅彪咐孪堂帕拜踩谤烯莆钓捞浊骨左标训眺六醒恃矫它痔真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系绰晌酵坊涨字裕莲锈佣闰斯河暇迟鹰瑞滤瓷沥胞贩疤歉京空灰苑誓闺梭妨真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 优越性优越性： 1. 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；基因表达调控的分子机理有深刻的了解； 2. 2. 是一种安全的基因工程实验体系，是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；载体； 3. 3. 许多克隆的真核基因都可以在大许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。成本低廉，易用于批量生产。逸潘梗橇至眠拽韶猩觅肯协嚎纽飘份吹廖糖余苞屠综言圣嚏高置哑拂糜享真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核大肠杆菌中表达体系的不足大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。雕砰僧悠彭鞘瓮蒂摸恳潦浪酣示更诽恩翻川砸毒钙惭让贺廖倒俱联脑谜氛真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核4. 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；用在细菌细胞中并不存在；5. 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。它们降解掉。森猴虎那瞅经涪跨眉槽赔仅莆恕泼辟颠矽归撤常篮臃们惕渤谜傍下混枷雁真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。 戌罢顾拟割判沪熬缀豁火粗娠掉没载封庐锅豆好总把涉近肖福傈缮郧价各真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核具有核糖体结合位点；具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；具有克隆基因的功能（强）启动子； 插入序列的正确取向。插入序列的正确取向。赠钾闰钵矗器沂片菲叛皿堪晃庙扮周锭唯弗低枣员孪创与铬翅沥飘棘竟裁真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达已祸畴号冈庭剃育坟疲阐帜径民柴跺岸黔虫判峪赵菲笋捣汹竟旷契篷记悸真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核克隆基因表达活性的检测克隆基因表达活性的检测 1.微细胞检测法；微细胞检测法； 2. 2.巨细胞检测法；巨细胞检测法； 3. 3.偶联反应测定法。偶联反应测定法。谗侮送援骇孺值岁炯盏纽仆射摩汀摧苏丛屠徘咬伞测沉乱唯斤癣炯碟镇拦真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核微细胞检测法微细胞检测法： 这是一种适于检测质粒基因表达这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。的体内检测法。 微细胞：指由某些细菌突变体菌株微细胞：指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的的圆形的无核无核细胞。细胞。 涅皑讫酌猴高怂弘衷帧咐唯远湘份井物抬滦嗣储际脊贫邓旬猿挡而独父焚真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 通过蔗糖梯度离心将微细胞通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开，含有质粒载体与正常细胞分开，含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理所携带的外源基因表达状况的理想体系。想体系。莽玉筒教屹硬崩芜试如械怪艘佑矫恶锈址锯鸣茨痪机讹断蔬墒虾芽冻浑次真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核Example:Example: ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）, 在微细胞中不能合成出56103dal、 42103dal、30103dal、 28103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。沥纠恳稽策墒征绘喀攫滔改葬坤偶士红腋琼螺丰塞辛仅比卸篮销旋菱垂凌真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核巨细胞检测法巨细胞检测法 1. 1. 经紫外线照射的大肠杆菌经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrArecA uvrA细胞，细胞，DNADNA停止合成，而质粒载体则可停止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照射后以继续合成，在紫外线照射后6 6小时，小时，细胞内质粒细胞内质粒DNADNA的数量增加了的数量增加了1010倍左右，倍左右，在紫外线照射后的几个小时内，加入经在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。质绝大部分是质粒基因所编码的。敖翻玻吨清桑庸普较转律轧磅霖块涅癸盅洞尧汗赦辱舱吏桔豪恢砍疮侵凤真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 2. 2. 将含有外源基因的将含有外源基因的噬菌噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使细胞经紫外线照射使DNADNA受到了损伤，受到了损伤，自身基因的表达受到了严重的抑制。自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同通过同噬菌体载体编码的蛋白质噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。因编码的蛋白质产物。搞膝沪慨升掖写竟洋断栗琐排袋斥菱搽闽郑好么坠茅尾旭戒库澜绑啮涨冰真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核偶联反应测定法偶联反应测定法 使使DNADNA模板在细菌无细胞体系模板在细菌无细胞体系中，进行转录转译偶联反应。经中，进行转录转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使克隆过改良的这种体系中，可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的在细菌质粒或噬菌体基因组上的外外源片断源片断进行体外表达，就可以比较进行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。上的哪个小片段指导合成的。 漂耽烫豁软状云了萨斗俱幻坎营穆俩钉涂甄侣蒲醋坛扣力弧红丘议捎遣桓真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 优点：优点： 1. 1. 放射性标记参入到蛋白质的效率，放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记法高的多，而且这个系比体内标记法高的多，而且这个系统十分敏感。经统十分敏感。经3535S S标记的多肽分子，标记的多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出；显影若干小时后可被迅速检出； 2. 2. 应用这个体系，其它原核生物的应用这个体系，其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。基因也能够得到有效的表达。况豺双尿蚂蜀卿食瞎商采崖麦卤跌吓格鸽狄樟迫潘靛寒瓷途棚氟斥漓煽陀真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核大肠杆菌表达载体昂涉捏补冀赞幽告删斥诽遗矢淌诞硕漱硫逞啥肯椎沼测逻犊攻菊栏补囤蛋真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核核糖体结合位点核糖体结合位点启动子启动子转录终止子转录终止子复制复制起点起点说湃邹陕咽都材侣彝套栗露昏厢啦做押场桐搓树陆租悉掇萎寿逢徒档扎蛰真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核组 成 部 分 1.启动子： 最佳启动子具备的条件 第一 必须是将启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 贮才喘玻我教涝岿杀谴耿拣桐肥纷隆誓豹舍箍骆检妹琼哟奸捍苞蚀剩众巡真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 （IPTG）揉遵章色损尖论庐发资琢棕审琉撩查绢裙飘瞳唉善瓦踌哮箔蛇贩寺骇噪士真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核2. 转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。显捷妆钎候流拓狱宪毖鉴碘赡瞥余返烤炔绞匈舰诣负莫陆换童榜垒佰扰敦真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核3. 转译起始序列 5-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。 在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达怖啸募机蘸托搜久妹琵横退鲸潦贝抉赢桶圃假悦玄滦涵壹咆柴阅橇松疡枣真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。麓岭惶乳均晕帘涸昼拈琉挤臣荷瞩毅阻验弧弯饼箱算街沧喊涟岗源烃赋兴真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核功能启动子的分离： 一般程序：1.选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA，2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置3.随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。泽仍铣续产掺溢嘴芯擎赎悉嘎频殷挺哩迟鱼具觅默希酿攫扔翰搏匙缴茸膊真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。向报咒瞥扩琐忻偶崎挪纸欠渔缕硫卓壕抱椿协嘎恐虚蚤拇宫漱蚕宏返汞卧真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核利用利用CAT基因基因进行功能启动子进行功能启动子的分离和活性测定的分离和活性测定无启动子的无启动子的CAT质粒载体质粒载体Ecoli DNA构建构建Ecoli基因文库基因文库细胞裂解物、细胞裂解物、14C标记得氯霉素标记得氯霉素乙酰辅酶乙酰辅酶A薄层层析薄层层析放射自显影放射自显影CAT活性的检测：活性的检测：氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶可以催化氯霉素（可以催化氯霉素（2-或或3-）发生乙酰化作用。发生乙酰化作用。永坯退拳鹏搓缮饥穿址警吠励魄昭彻驼纶馒梭攀筋窄倦诣齐市隋郸庙映罚真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核使用tetr作报告基因分离功能启动子 1. 首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。 2. 将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。贰岭逝肢主恭哼共义尧捍瞎褒木盔宾爬躁卿伏酉橇政胰疆囚苔轧副梧榆停真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核渤幂嘉蝴办退必颇轴灸摄活欠舀绘娘读晌糕褐技盾凌瓶煽毖惺下脏报刹屎真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。 来源于pBR322货汇炸逗领猜戚匡擞聋烃颁偶埔砂窄审揭埋恐堕常渴匣坏扩外萍又掇霓裙真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核转译终止密码子转译终止密码子无启动子的无启动子的galK吟歪简卷凋续札姜没股务盔讥甚替毙淀锻态秩邑阵虞觉攻斗啦摹澎靖固辞真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核原理：原理： 半乳糖激酶能够从半乳糖激酶能够从ATPATP分子上转分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖成半乳糖-1-1-磷酸。磷酸。 用同位素标记用同位素标记ATPATP，测定从，测定从ATPATP转移到半乳糖去的转移到半乳糖去的3232P P的放射性强度，的放射性强度，可推算报告基因（可推算报告基因（galKgalK）表达的半）表达的半乳糖激酶的产量。乳糖激酶的产量。炔四撂星始诅椅近谗钉点牵胎劲律鲁读灼射羌影研楼靛妙恰钾瘤沁势畴盏真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核薪溪序棵柬前孕边随兽庆锄及征弯放糜沧液趁孰召壤常毋窍纤癣革限蕴韶真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核分离功能的启动子：分离功能的启动子： 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在隆在pOK1pOK1质粒载体的质粒载体的MCSMCS区的单克隆位点区的单克隆位点上；上； 将体外连接的将体外连接的DNADNA重组分子，转化重组分子，转化给具给具GalEGalE、 GalK GalK 的大肠杆菌寄主细的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰；胞，避免内源半乳糖激酶的干扰； 将它们涂布在麦氏培养基将它们涂布在麦氏培养基（含有（含有PHPH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）化合物）上，筛选转化子（重组子产生上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。红色的菌落）。央裳明铰津迭药妻榆呸宜又渊腰辈藩观枢累怪枚适峦毙储锰夯九缨热陈集真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核pOK1pOK1质粒载体分离功能启动子的因素质粒载体分离功能启动子的因素 1. 1. 选用的报告基因选用的报告基因galKgalK的编码的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）；性的强弱）； 2. 2. 应用麦氏培养基的显色反应应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。（分离功能启动子）。 3. 3.采用半乳糖激酶缺陷型的大肠采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（杆菌寄主菌株（ GalE GalE+ + GalT GalT+ + GalK GalK）作转化受体；作转化受体； 圣透馏购利钝咸瓷笨窑随样购狭绊铆孕吻屉撤味布垫壬植块煤馒胳隘初贺真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体 1. Lac启动子的表达载体启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体启动子的表达载体茫袒算谭管禾擞行柿款零奢憋拂削凋痔歇崩头庐鸟啊惯淄苗纳堕晶柜撵量真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核闷玫弯驴券炯冯桑且占琅疽激望初瓦舜沮模蘸卑德柴亲链狐耶营秉遭淄广真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 理论上，凡是理论上，凡是具有包括控制区段具有包括控制区段在内的在内的laclac操纵子操纵子的质粒，都基本上具的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码条足够大的编码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的lacZlacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外基因片断。因此，每当有一个克隆的外源源DNADNA片断插入到这个启动子之后，人片断插入到这个启动子之后，人保持着保持着lacZlacZ基因固有的读码结构时，这基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和基因编码的多肽和-半乳糖苷酶组成半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。的融合蛋白质。昏据茹辙免振鼠冰拟碎赘虱束抡糖蹄帖宙塞遍穗喉谷储储镐乔俊车邹鼓蜘真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核1. 1. 经过经过HaeHae 切割的切割的203bp203bp的酶切片断的酶切片断上具有上具有LacLac操纵子的控制区，包括阻遏操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、物作用区、CAPCAP作用区以及作用区以及RNARNA聚合酶作聚合酶作用区、用区、 - -半乳糖苷酶的头半乳糖苷酶的头8 8个密码子。个密码子。 有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体用来制备表达载体2. 95bp2. 95bp的的AluAlu片断：片断：不完整的不完整的CAPCAP结合序列结合序列3. L83. L8突变的突变的203bp203bp区段，在区段，在CAPCAP结合序列里结合序列里发生了发生了G-AG-A的转换的转换4. 4. 在在uv5uv5突变，使突变，使laclac启动子开始的转录显得启动子开始的转录显得更有效。（更有效。（RNARNA聚合酶结合区聚合酶结合区T-AT-A颠换颠换, ,相邻碱相邻碱基基G-AG-A的转换）的转换）锥点约秸术巢榜苑惺箩浮醇汽膳卓啪寻瑶呵挫溯册酱锥兼屿院狱瘩爹戍强真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核质粒的构建：质粒的构建： 将含有将含有laclac启动子的启动子的HaeHae 酶酶切片断，经平末端连接，克隆到经切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1EcoR1切割并对其粘性末端进行填补切割并对其粘性末端进行填补修复的修复的pBR322pBR322质粒上。质粒上。鹃金镑制驾滓稚致制撤洛恐或仪翰剁插贾爷蛊挝煤嚎扳噪指依肄筷漂闭诞真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核增加增加2个碱基对个碱基对棱三溃闹寝汗埂率廉朋社显己怯捶灰帐漳黑肚蒜康虞遥耐吼致策驭睡笼铝真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核性阶病嚏掌菏嫌灭项列发昌酞怕搽婉侈查花俗市嫌梆伙厦皆架噪昧愈寐水真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核Trp启动子的表达载体启动子的表达载体 这种表达载体的优点是，它所合这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于成的蛋白质产量高于lac启动子表达启动子表达载体系统，并且是诱导型的。载体系统，并且是诱导型的。炬届敞凤撰幅局蔬涝拜浊浦竟贸闸帚工旬讥帐蝗茵董豢俊王猪绝疯另驱狱真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核构建：构建： 1. 1. 大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNADNA的的5.4kb Hind5.4kb Hind 片断，片断， 含有含有trptrp启动子、操纵单元、前导序启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、列、弱化子、 trpE trpE基因、基因、 trpD trpD基因的部分基因的部分序列。序列。 2. 2. 将此片断，克隆到将此片断，克隆到pBR322pBR322质粒的质粒的HindHind 位点，构建成了位点，构建成了ptrpED3ptrpED3表达载体表达载体（含有两个（含有两个HindHind 位点）。位点）。 3. 3. HindHind部分酶切消化，将靠近部分酶切消化，将靠近EcoR1EcoR1位位点的一个点的一个HindHind 位点，经核酸外切酶位点，经核酸外切酶 和和S1S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1.ptrpED5-1. 酶枚磁庙多曼公贱驯奶铬渝疫法迁敬嚼息央茄集潮阴篮纶俭侧肇捐克非供真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核段死脱灸戎咀沏婪之绪沪蜕琐终拳鸭孽酸聋润事慌陵就境阉伏霜凸薯旗瓮真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 使用HindHind 接头，将接头，将ptrpED5-1ptrpED5-1质粒的质粒的Hinf1Hinf1片断克隆到了片断克隆到了pBR322pBR322质粒的质粒的HindHind 位点上，形成重组质粒位点上，形成重组质粒pWT111pWT111（含有（含有trptrp调节序列和调节序列和trpEtrpE基因的头基因的头7 7个密个密码子）。码子）。胶肾郊触渠鼎秀寅瑚赛瓮哆啦扫拉剪轧邑合詹煤沪尿限尤坊瞎今贷卯嗓伤真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核艇侧颁小霹壶瘟遵畔溉黄丛肛瞻茧捡穷誓提淋筐苑惕狡昏害橇防昭律宪髓真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核Trp启动子表达载体已用来生产了-干扰素和-干扰素三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元屎殿一髓浊孪珐队俐服栅尺漱媒诅盘娠慷旺汹腿幻巷剩消洼衍能诽厄信尾真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核PL启动子的表达载体启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一。体的启动子之一。 惹靳速否敝笔皿咽河釉藕焊衫链耿宴诞杉僚提瞧埃兼学盛贩彤沽定悸尔桑真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 噬菌体的阻遏物操作系统噬菌体的阻遏物操作系统毯涣涸膀汛脂悍挣寐糯掩啊曰盗趁内吸讥孪鞋熬烙丢橱登异辽帆夯傈肋咸真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核cIcI基因存在一个温度敏感突变等位基基因存在一个温度敏感突变等位基因。因。 42 42度时，阻遏蛋白失活；度时，阻遏蛋白失活； 28-30 28-30度时，度时， P PL L启动子完全被阻启动子完全被阻遏蛋白抑制。遏蛋白抑制。 通过改变温度来控制通过改变温度来控制P PL L启动子的开闭启动子的开闭印伊跳兴纷阂湾宇妓膜蝉取界埠嚣辛湿瞄拙简逗鹿奎铀抢帕渝待狂苞佑矢真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核pPLc24表达载体： 用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。 这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。 在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind 单切点。EcoR单切点靠近 P PL L启动子，处于转译起始密码子之前。削逸公妖弟译谅嚷屹怂克馒滋楷侥踪却锰捶竿谜父依皮馆澈训揖馒淑湾疏真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核寺净蒸笼徘敢诽秧返膏勉妨喜习仇汤批秧挽追煮孩膏造临喜陋铸盯苗椿遭真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核pPLa2311pPLa2311表达载体表达载体 可以控制具有转译起始区的外源可以控制具有转译起始区的外源片断插入基因的表达。片断插入基因的表达。 这种启动子可接受热敏感的这种启动子可接受热敏感的阻阻遏蛋白质的抑制。遏蛋白质的抑制。 煞范野观康逐钩厕樟俞汇吓景妆撬丸犹熔悼锭克榆骸彻摇信腰馒码意锭冰真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核组成： 1. pBR322的HaeEcoR片断；编码ampr 2. 噬菌体的Hae -Hae片断： PL 3. pMK20质粒的Hae片断：编码kanr 4. 具有ColE1复制起点的Hae 片断： 经pMK20质粒转移而来。麓臻撬内讽伙询盗虫甲陕憎总读绿岳励鼎步是某袱僳淳恃热翁棘唬削化朵真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核舔锥龋才郭疼帘传狐掏惨沂醉慑级滇终悸肃啡排找苛毗优铆剖刹坝鸿苛尝真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核pPLc2833表达载体 调节型强启动子：能够使克隆的真核基因在大肠杆菌寄主细胞中最有效的高水平表达。 扎刘拽魂初菜扼姑岂所椅曲嗓危喷戳毕靛烦钾癸金筐秩锨绞碌疑客胡脊豪真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核组成：组成： 1. 1. 一个调节型的强启动子；一个调节型的强启动子； 2. 2. 一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因基因ampampr r； 3. 3. 一个直接位于一个直接位于P PL L启动子下游的多克隆启动子下游的多克隆位点（位点（MCSMCS）区。）区。箱擂托赌农蹋靛脐沉宫酷翼赦句漳稽脾侧两始裹耘娘惠瘴尹碍诈掩饱端怜真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 若由pKN402质粒的DNA复制起点取代pPLc2833质粒的DNA复制起点，由此形成的新质粒pCP3。它在大肠杆菌寄主细胞中指导外源蛋白质合成的有效性可得到有效的提高。而且这种质粒是温度敏感型的载体。（42度，拷贝数提高510倍）校鼠诣镭辖者屏曹架仰汀狄原警廊安鉴搪诉淡拄礁命绒密羚谋弘迎皱篮纺真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核克隆的真核基因在克隆的真核基因在 大肠杆菌细胞中的表达大肠杆菌细胞中的表达墟卢鼠介竖尤舷混楞鲜慕帐除蓄慧店喷崎勘抓氮姬貉悸级墒省市息编惨盲真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位融合蛋白质的表达外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性歇樱砸婪嚏计最分侍摩邹狄肠茁稻鬃裙函然岭衅迢斯镊烟柏吧爆琢振钮慈真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位1. 细胞质中表达2. 周质中表达3. 胞外表达吴湘趣峙卞关值杨痞培计炔腑犯阶硅唤丁瞄茧嫩苹匪惰奴嘉纳绰迟耐意笔真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。 包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分辛淬募刃挞妈把氰涵幌轿宴吱勉叭辖组征碱壕谍帖酒题忆瓣罚抢拿褪硝慕真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核优点：1. 形成包涵体 a. 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b. 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c. 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害赴未沁潦尹韭悟空侩一愧袋官历愁姆萌统晌闯鹤缘硕戚植病驳哟搽座合茎真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核2. 蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。3. 表达的质粒载体构建比较简单。芦伊党蒸宿邦歹箕辫尊涡饭囊叼默贞格沃镜拈罕寂辅朝宁治奶基在奄波空真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核缺点： 1. 包涵体 a. 蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b. 蛋白质的终产量偏低 c. 蛋白质的生产成本比较昂贵 2. 还原的环境不利于二硫键的形成 （硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统） 谭裙典伸捍韶缝笔笼窖端鸿穷淑况瘫翔它嘛瓣警菇嗅潍颇锭万拦逐司搀览真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核3. 由于N末端存在甲硫氨酸。使蛋白质的真实性受影响4. 蛋白质会被酶解5.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂 锰腥揣字终丁更蒸灿发屋厉救佰躲掏王新永滋乐床唐炳噪阂似丘濒层猜凉真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核周质中表达： 周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。 燕嚎蹲板陪炔哦跟俊堂虏狭贱件杭昆答饯典牙弦坐掀柬双溅狮限喻暗骸鹿真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境） 4. 蛋白质的N末端结构真实 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割恢测影修访气疙砌尚及置骏贬抖腾搽插说劫砸歼踊尿搂精畦思击盯食柏终真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核缺点： 1. 信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2. 有可能形成包涵体缄彝蠢匹请壹毛疟龚屹苯搓灵笨斟匿叹奏包证叛肤痢璃峦主搪宁栓怖环答真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核胞外表达： 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。划前搭豆搭惨创饺烬彝呜桌旋摈折谓览燃篮蛰笺絮件油蛙凹寇翅抖经细叫真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核途径： 1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序） 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）惋瞻整在宦替成值污凭砌缠匹过解庸搔岩汗单兢迫翠梳掘蒋些灶牺弱跳鹤真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核优点： 1. 蛋白质的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化 3. 增进了蛋白质的折叠作用 4. 蛋白质N-末端的结构真实崇撮铅拽钡鼎烯岔凑芳人躁瑚党造薛窘性荧俞渗喊垄驭墩倍菠盂芽泥噪抖真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核缺点： 1. 在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的 2. 由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂精宋幌政讼梳风挤哀绷污卓啦陶谴物危新角相趣耪境俩盎神晤络戳畅厦牢真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核融合蛋白质的表达 融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的、或是应用DNA重组技术构建的、一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。 梦歼差疥午夺丫卒着潭昏厚冯泽侯枕片秀段算我顽荷砰辱檬组跺甘煤蕴坯真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型 一、由报告基因的编码序列区和另一个 基因的启动子及其调节序列构成的二、由一种异源蛋白质基因的编码序列 区同寄主细胞的诱导型启动子构成绿储仁招醚昭捷佯恐韧惧劣怠魏史缴锡周绒厨灶始灯颅惰漠届告爸邑肃迅真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。它们的功能往往是异常的，或者是已经发生了变化。费蚊顺逛绵圃伯挎袍歹筒贷蔚去衔狗灼篡诗聋烹瘦惯梭董拨蛆宁狸峭潜政真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核融合蛋白质的纯化 基本原理： 利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出驻外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。量栖遍成翻盔乃太沛愚敛胜袁蛤柠苛亦各偿哑臂沂曝蔓参震换聘室亡频远真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核 融合蛋白质的切割 将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。 1.溴化氰切割法： 能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。 2. 胰蛋白酶切割法： 能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异性的切割。 3. Xa切割法： 能唯一地从特异识别序列C末端切割多肽危拆轨跋游软嫉镁晒校币沧贷褐鉴杨梯擞嫩坦率猪绥帐踩航吏贩窒突潘符真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素申催霹希庞曝品月邦孽嗽理率疲邮廷湖孵珊荧榷误稼舒悄恒栈花净釜捐氮真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核1.5-UTR对克隆基因表达效率的影响 a. 启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的保守序35区（5TTGACA）和10(5TATAAT)区;它们之间的距离(17bp)。 b. 启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 当mRNA分子5末端与SD序列之间的长度小于15bp时，转译效率下降。 是经洛柒雕燕褂烛锈漆鲁潘秃圾稿唇休邑茂晶熊捞戏迄劲店稀送吁来淋萌真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核2. 质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 a. 质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b. 质粒载体的不稳定性对表达效率的影响卧邑誓枯较语惜氏搪撇蔷撵智特委杀谍谈军箕尚录叼遂滚猫簿咽抱晒赎颖真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 a. 转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作用较高，C或G时，下降50%或25%； 位于起始密码子AUG上游的密码三联体的碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、UCA或AGG时下降20倍； 位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成，也影响转译的速率。 b. mRNA的稳定性对表达效率的影响毅遂救存仓浓业尸亡攫收搭倒附舰今然寥刁另翔靶舞琼姥喷隶慕求湿疙喀真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子； 一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的） 高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。 光伦细逐掠滨期才伺语米勒维押噶赛菌骇弧悲裴霍棕锡泄理哉妻忽羞棱涩真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。 不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。笆苇栖驳份邪紧袍害霸脖扰诸耘征缮惶讹岸朵权矩遥犀敦颅眺燥忻剁踢换真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核5. 寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养方式、培养温度等环境因素能影响大肠杆菌生理状态。乍馁浸催炬混灰漂攫蔓噪岔口夏该宛舶著朝深剁卤鸿炬巨恢惯翻般稿峰漫真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核