第第1515章章 核酸物理化学性质核酸物理化学性质一、核酸的水解 核核酸酸可可被被水水解解的的位位点点有有磷磷酸酸酯酯键键和和糖糖苷苷键键，其中糖苷键更易被水解。其中糖苷键更易被水解。 55端端3端端CGA核酸的酸水解 嘌嘌呤呤碱碱的的糖糖苷苷键键比比嘧嘧啶啶碱碱的的糖糖苷苷键键对对酸酸更更不不稳稳定定，对对酸酸最最不不稳稳定定的的是是嘌嘌呤呤与与脱脱氧氧核核糖糖之之间间的的糖糖苷苷键键。DNA在在pH1.6于于37对对水水透透析析可可完完全全除除去去嘌嘌呤呤碱；在碱；在pH2.8于于100加热加热1h，也可完全除去嘌呤碱，也可完全除去嘌呤碱。 核酸的碱水解 RNA的的磷磷酸酸酯酯键键易易被被碱碱水水解解，产产生生核核苷苷酸酸。 DNA的的磷磷酸酸酯酯键键则则不不易易被被碱碱水水解解。这这是是因因为为RNA的的核核糖糖上上有有2OH，在在碱碱作作用用下下形形成成磷磷酸酸三三酯酯。磷磷酸酸三三酯酯极极不不稳稳定定，随随即即水水解解，产产生生核核苷苷2，3环环磷磷酸酸酯酯。该该环环磷磷酸酸酯酯继继续续水水解解产产生生2核核苷苷酸和酸和3核苷酸。核苷酸。 DNA一一般般对对碱碱稳稳定定，若若在在1mol/L NaOH中中加加热热至至100 4h，可可以以得得到到小小分分子子的的寡寡聚聚脱脱氧氧核核苷苷酸。酸。核酸的酶水解 水水解解核核酸酸的的酶酶种种类类很很多多。非非特特异异性性水水解解磷磷酸酸二二酯酯键键的的酶酶为为磷磷酸酸二二酯酯酶酶，如如蛇蛇毒毒磷磷酸酸二二酯酯酶酶和和牛牛脾脾磷磷酸酸二二酯酯酶酶。专专一一水水解解核核酸酸的的磷磷酸酸二二酯酯酶酶称称为为核核酸酸酶酶。另另外外还还有有非特异水解糖苷键的糖苷酶。非特异水解糖苷键的糖苷酶。 核酸酶的分类按按底底物物专专一一性性分分类类：作作用用于于RNA的的称称为为RNA酶酶（ribonuclease，RNase）；作作用用于于DNA的的称称为为DNA酶（酶（deoxyribonuclease，DNase）。）。按按 对对 底底 物物 作作 用用 的的 方方 式式 可可 分分 为为 核核 酸酸 内内 切切 酶酶（endonuclease）和和核核酸酸外外切切酶酶（exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。少数核酸酶既可内切又可外切。核酸酶的分类核核酸酸外外切切酶酶有有53方方向向切切割割的的，也也有有35方方向向切切割割的的，分分别别称称为为53外外切切酶酶和和35外外切切酶酶。还还有有对对特特定定核核苷苷酸酸序序列列部部位位进进行行切切割割的的。如如:限限制制性核酸内切酶性核酸内切酶 二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质具有芳香环结构特点具有芳香环结构特点能发生酮式能发生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亚氨式互变亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 _ _主要是环内氨基的贡献主要是环内氨基的贡献1 1、碱基的解离、碱基的解离 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到则结合到N7上上2、核苷的解离、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离3.3.核苷酸的解离核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性磷酸基使核苷酸具有很强的酸性DNADNA等电点为等电点为4 44.54.5；RNARNA等电点为等电点为2 22.52.5三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键碱基含有共轭双键最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。磷即相当于摩尔核苷酸。 ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径：比色杯内径OD260的应用：的应用：1. DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低3.判断判断DNA是否变性是否变性四、核酸的变性、复性与杂交四、核酸的变性、复性与杂交( (一一) ) 核酸的核酸的变性变性（denaturation） 1 1、DNA的变性的变性： 在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解开成两条单链的过程。开成两条单链的过程。 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2 2、变性的实质、变性的实质降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 高温（一般高温（一般7575） 热变性热变性 强酸、碱强酸、碱 酸碱变性酸碱变性 甲醛甲醛（Agarose中中RNA ） 尿素尿素（PAGE中中DNA ）3 3、变性因素、变性因素 ODOD260260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失4、变性后理化性质变化、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有的变性引起的性质变化没有DNA明显明显完全变性后核酸紫外吸收值增加：完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然天然DNA 2540%、RNA 约约1.1%实质：碱基暴露实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称象称增色效应增色效应DNA变性变性5、DNA热热变性的特征变性的特征变性过程是变性过程是“跃变式跃变式”的，而非渐的，而非渐变变解解链链曲曲线线：连连续续加加热热DNADNA，以以温温度度对对A A260260作图，所得的曲线称为解链曲线作图，所得的曲线称为解链曲线。指增色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间之间 Tm：DNA变变性性时时，OD260达达到到最最大大值值的的50%时时的的温温度度称称为为DNA的的解解链链温温度度或或融融解解温度温度(Tm)。大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。（1 1）DNA的均一性：的均一性：（2）GC含量：含量： 经验公式：经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44（3）介质中的离子强度：）介质中的离子强度： Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：( (二二) )核酸的核酸的复性复性（renaturation）变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链单链重新缔合成双链复性复性。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing) 。DNA复性复性分子量越大复性越难；分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易；DNA复性也与它本身组成和结构有关复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列（具有很多重复序列DNA，复性快）。，复性快）。减色效应减色效应（低色效应）（低色效应）复性时紫外吸收减少的现象复性时紫外吸收减少的现象( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子 SouthernSouthern杂交杂交 Northern Northern杂交杂交 Western Western杂交杂交