长期毒性试验长期毒性试验 目的意义目的意义基本内容和要求基本内容和要求有关问题有关问题Mechanic? Innovative ?目的意义目的意义 毒性剂量毒性剂量 Toxic dosage安全范围安全范围 Safety margin 毒性反应毒性反应 Toxic reaction: 性质、程度、性质、程度、量毒关系、产生时间，达峰时间量毒关系、产生时间，达峰时间, 持续时持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性积性、耐受性 毒性反应靶器官毒性反应靶器官 Target organ 毒性反应是否可逆毒性反应是否可逆 ReversibilityProceduresAnimals Housing Test articleRoute Dosage and groupAdministration duration ObservationProcedures 1- animals rodent non-rodent rat beagle dog mouse mongrel dog monkey基本内容和要求基本内容和要求 - 动物动物二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬(Beagle犬犬), 必要时用猴必要时用猴动物应写明供应单位及邮编，品系及生产合格证动物应写明供应单位及邮编，品系及生产合格证号号大鼠大鼠6-8周龄，体重差异不超过平均体重的周龄，体重差异不超过平均体重的20。3个月以上可选个月以上可选5-6周龄大鼠周龄大鼠Beagle犬犬4-12月龄月龄各半各半 Procedures 2- housingDiet, T, humidity, light, ventilationRat: 5 /cage or separated， acclimation 1wDog: TB test, anthelmintic acclimation: 1-2w / 1mProcedures 3- test articletest article / solvent / excipient name, batch No. , source, specification, purity, preserve condition, etc same quality criterion基本内容和要求基本内容和要求 - 给药途径给药途径与临床给药途径一致与临床给药途径一致混入饲料或饮水中灌服时混入饲料或饮水中灌服时l保证受试药分布均匀保证受试药分布均匀l在配制饲料或溶于饮水后仍旧稳定在配制饲料或溶于饮水后仍旧稳定l计量准确计量准确临床临床iv 时时, 大鼠给药周期大鼠给药周期1月，可用月，可用ip代替，代替，im或或sc应应变换注射部位变换注射部位必要时改变给药途径必要时改变给药途径基本内容和要求基本内容和要求 - 剂量及剂量及分组分组三个给药组三个给药组, 单位单位: mg(ml,IU) /kg 或或 /m2以不等浓度等容量给药以不等浓度等容量给药低剂量组低剂量组-高于有效剂量，不出现毒性反应高于有效剂量，不出现毒性反应中剂量组中剂量组-产生轻微或中等度毒性反应产生轻微或中等度毒性反应高剂量组高剂量组-产生明显或严重的毒性反应，或个产生明显或严重的毒性反应，或个 别动物死亡别动物死亡空白对照空白对照-溶媒或其它赋形剂，若溶媒或赋形溶媒或其它赋形剂，若溶媒或赋形 剂有毒性时则增加正常对照组剂有毒性时则增加正常对照组基本内容和要求基本内容和要求 - 剂量及分组剂量及分组 5 g/kg, iv 2g/kg仍仍无毒性反应和死亡或仅个别有毒性反应无毒性反应和死亡或仅个别有毒性反应, 可只可只做一个做一个50ACD(犬用犬用30ACD)的剂量组的剂量组 Procedures 6- ad. duration Tab.Correspond duration of clinical ad. with animal ad. clinical ad. durationanimal ad. duration 13d 14d 1w 1m 4w 3m 1m 6mduration 3m ad. 6 day weekly(mon. to sat. )Procedures 7- Observations Clinical Examinations rodent non-rodent signs of ill health +pupil , T behavioral changes breath, sialosis reaction to treatment vomitingDead or moribund animal: necropsy within 1hProcedures 7- Observations Hematology Red blood cell count(RBC) Hemoglobin(Hb) Erythrocyte indices (MCV, MCH, MCHC) Hematocrit(Hct) Platlet count White blood cell count and percent differential Coagulation time(CT) Reticulocyte count, Bone marrow smearProcedures 7- ObservationsClinical chemistry Alanine aminotransferase (ALT)（丙）丙） Aspartate aminotransferase (AST)（草）草） Alkaline phosphatase (ALP) Total bilirubin（Tbill） Blood urea nitrogen（BUN） Creatinine（Cr） Total protein（TP） Albumin（Alb） Glucose (Glu) Total cholesterol （Tch） Procedures 7- ObservationsUrinalysis Color and appearance pH glucose ketones urobilinogen blood specific gravity nitrite protein bilirubin WBC microscopy of centrifuged depositProcedures 7- Observations Pathology Organ weight assessment: heart liver thyroid lobes and spleen lung parathyroids kidneys brain (lobes weighed pituitary adrenals together) ovaries testescalculate organ weights relative to body weight , paired organs weigh together Procedures 7- Observations Pathology Histopathological examination: heart liver spleen lung kidney brain adrenals pancreas stomach duodenum jejunum ileum colon cecum（盲）盲） pituitary thymus spinal cord prostate testes uterus ovaries optic nerve injection site bone and marrow(sternum) urinary bladder lymph nodes(mesenteric) thyroid lobes( and parathyroids)Procedures 7- Observations Pathologytissues(c+h embedding dead+ sectioningtarget) staining examination基本内容和要求基本内容和要求 - 检测指标检测指标心电图心电图导联导联大动物长期毒性必须做大动物长期毒性必须做 主要观察指标：主要观察指标：心率、心率、P波电压、波电压、P-R间间期、期、R波电压、波电压、QRS时间、时间、ST段、段、T波电波电压和压和Q-T间期间期Procedures 7- ObservationsRecoveryObservation : 1/31/2 animal, 24w Late toxic reaction and reversibility Items : same as treatment periodNot reversible?Procedures 7- Observations Frequency of lab. investigations rat 3m Non-rodentlast ad. interim twice pretreatmentrecovery end last ad. once every 1-1.5m recovery end last ad. recovery end基本内容和要求基本内容和要求 - 资料整理资料整理 首首页页写写明明: 负负责责者者的的姓姓名名、职职称称、实实验验开开始始及及结结束束日日期期、实实验验承承担担单单位位、研研究究室室负负责责人人和和资资料保存单位料保存单位试试验验指指导导者者、课课题题负负责责人人、病病理理学学检检查查、血血液液生生化化指标测定、血液学指标测定及给药观察者指标测定、血液学指标测定及给药观察者第二页书写试验摘要第二页书写试验摘要第三页开始写正文、引言、材料与方法、结果第三页开始写正文、引言、材料与方法、结果合理的统计图、表合理的统计图、表有差异的指标应进行统计处理有差异的指标应进行统计处理应客观地描述尸检及组织病理学检查结果应客观地描述尸检及组织病理学检查结果对各种异常现象可用半定量的方式表述，揭示量对各种异常现象可用半定量的方式表述，揭示量-时关系时关系 Problems Pretest Dosage Animal & Housing Route Duration Observation Parameters Data handling ArchivesProblems 1- pretestWhat depend on?Overseas pre-clinical / clinical dataAcute toxicity , pharmacodynamics and pharmacokinetics or intended clinical doseHow long? 2w - 1mRecombinant article: antibody?Problems 2- dosage LD50 MTD MBS ACD 3m 6m 1/10 1 10Cmax 50100 30 50 1/50 1/3 5Cmax 3050 1525 1/100 1/10 Cmax 1020 510 half for dog and monkey有关问题有关问题2-剂量剂量表表 常用动物等效剂量折算表常用动物等效剂量折算表 项项 目目 人人 犬犬 猴猴 兔兔 豚鼠豚鼠 大鼠大鼠 小鼠小鼠成年时体重成年时体重(kg) 70 12 4 1.5 0.4 0.2 0.02换算常数换算常数(k) 12.3 11.6 11.8 12 10.5 10.5 10每公斤用药量折算每公斤用药量折算(mg/kg) 1 1.5 2.2 3.1 4.3 5.4 11.0体表面积折算等效剂量比体表面积折算等效剂量比 1 0.32 0.16 0.07 0.031 0.018 0.0026有关问题2-剂量由由于于溶溶解解度度(注注射射剂剂)关关系系, 剂剂量量无无法法再再增增加加时时,应应允允许许以以最最大大可可溶溶浓浓度度和和最最大大允允许许容容量量给给药药一一些些腔腔道道用用药药、血血浆浆代代用用品品的的高高剂剂量量也也应应采采用类似方法用类似方法防止犬与大鼠剂量倒置防止犬与大鼠剂量倒置必要时增加阳性对照组必要时增加阳性对照组Problems 3- animal rodent non-rodentWistar Beagle dog(4-12m)Sprague Dewley monkey (3y)6-8wbody weight CV1月，月，长毒可改用长毒可改用ip注射，注射，im或或sc可可采用四肢多点轮流注射采用四肢多点轮流注射 临床有用药后加上照光临床有用药后加上照光(血血卟啉类激光卟啉类激光)或或X-照射照射(CM-Na光敏剂光敏剂-射线射线)，动物上只，动物上只给药没有其他条件，观察到的毒性较加照光给药没有其他条件，观察到的毒性较加照光后的毒性低后的毒性低 有关问题4-给药途径给药途径特殊情况下可改变给药途径特殊情况下可改变给药途径 胆道给药溶解胆结石胆道给药溶解胆结石肿瘤局部注射给药肿瘤局部注射给药(肝瘤注射肝瘤注射)舌下给药舌下给药腔腔道道给给药药(阴阴道道、关关节节腔腔注注射射、硬硬膜膜或或脊脊髓髓腔腔给给药、滴耳药药、滴耳药)内内病病外外治治、穴穴位位给给药药(肝肝脐脐贴贴药药或或其其他他穴穴位位给给药药,)艾炙加中药艾炙加中药药酒治病、中药加烤电药酒治病、中药加烤电雾化吸入雾化吸入抗肝癌导向药物动脉注射抗肝癌导向药物动脉注射Vd可改用可改用iv代替，反之则否代替，反之则否Problems 5,6- observations Western Chinese Recombinant 34 times 2 times antibody 6mToxic reaction: properties, degree, dose-toxicity relationship, initiating time，peak time, lasted time, late reaction toxicity, accumulating toxi-city, tolerance everyday or 6 days a week?Problems 7- parametersPossible Toxic Reactionspharmaco- chemical pretesting publishedlogical effcts structure results dataProblems 7- parametersOverloadingReticulocyte countAST ALP BUN AlbProblems 7- parametersTissue: free of fathalf rationed： no changes(-) 0, suspected （）0.5，mild（），（）， median（+），）， severe （+)Local inflammation, WBC infiltration, local bleeding , haemostasis, suspected cell degeneration self-infected, sacrifice induced有关问题7-测试方法测试方法 测试方法必须公认，有文献依据测试方法必须公认，有文献依据新的测试方法要经同行专家认可新的测试方法要经同行专家认可对于某一指标的不同测试方法，应交待清对于某一指标的不同测试方法，应交待清楚选择的理由楚选择的理由方法选择原则是简便、快速、灵敏、准确方法选择原则是简便、快速、灵敏、准确有关问题7-测试次数测试次数 能反映动态变化能反映动态变化 一般行为活动宜每天观察记录一般行为活动宜每天观察记录食量宜每天称重食量宜每天称重大鼠体重宜每周一次，按体重给药大鼠体重宜每周一次，按体重给药其它生理指标每半月至月一次其它生理指标每半月至月一次大动物心电图用大动物心电图用II导联，至少给药前、给药导联，至少给药前、给药期间、给药后及停药结束各测一次期间、给药后及停药结束各测一次发现有阳性指标应加大观察密度发现有阳性指标应加大观察密度 有关问题7-测试次数测试次数大动物生化检测，给药前大动物生化检测，给药前2次、给药期间次、给药期间-次，停药时及实验结束各次，停药时及实验结束各1次，这样就可看出次，这样就可看出动态变化，并能了解是否可逆，不仅可以进行动态变化，并能了解是否可逆，不仅可以进行组间比较，也可进行自身对照组间比较，也可进行自身对照大鼠长毒未强调动态观察，只是指出必要时给大鼠长毒未强调动态观察，只是指出必要时给药期可测一次，主要是因为生化指标较多，采药期可测一次，主要是因为生化指标较多，采血量大血量大有关问题7-停药观察停药观察 时间的长短取决于给药周期，一般可时间的长短取决于给药周期，一般可1/3 - 1/2给给药周期，或药周期，或2-6周周了解毒性反应在停药后能否恢复了解毒性反应在停药后能否恢复观察有否迟发性毒性反应，特别是神经系统毒观察有否迟发性毒性反应，特别是神经系统毒性反应性反应 Problems 8- data handlingRation data: xs, international unitvs control and dosed group, vs d0Statistics: t test or F test，Ridit analysisP0.05：significance?有关问题9-资料整理资料整理 raw data, documentation, records, protocol (and amendments thereto), specimens, reserve samples, control article, final report(signed)原始资料应保存完好，我国规定原始资原始资料应保存完好，我国规定原始资料至少保存至生产后年料至少保存至生产后年Innovative Animal Dosage Parameters Route Data handling 确实做好预试确实做好预试 pretest周密设计剂量周密设计剂量 dosage 精心饲养动物精心饲养动物 housing细心观察反应细心观察反应 observation认真测定指标认真测定指标 examination实事求是总结实事求是总结 conclusionSummaryImportance 5 objectives (DOSTR)9 problemsStandard & innovative