实验三实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质分离血清蛋白质n掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理n学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术n了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用实验目的实验目的 聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、冲液成分、pHpH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效浓缩效应、分子筛效应、电荷效应应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。多少不同而进行高效分离。 实验原理实验原理 由由单体聚丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺(Acr)(Acr)和和甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。交联而成的三维网状结构凝胶。 BisBis：交联剂交联剂 过硫酸铵过硫酸铵(AP) (AP) ：引发剂，提供自由基，引发剂，提供自由基， 引发聚合反应引发聚合反应 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)：催化剂催化剂, , 加快引发加快引发 释放自由基的速度释放自由基的速度n 聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGPAG）的聚合反应：的聚合反应： 1. 1. 浓缩效应浓缩效应 n 分离机制：分离机制：凝胶层孔径不连续：凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径浓缩胶大孔径，分离胶小孔径pH值不连续：值不连续：电泳缓冲液电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶；浓缩胶pH=6.7； 分离胶分离胶pH=8.9缓冲液离子不连续：缓冲液离子不连续：电泳液中电泳液中Gly-(慢离子慢离子)；凝胶中；凝胶中 Cl-(快离子快离子)；Pr-介于二者之间介于二者之间电位梯度不连续电位梯度不连续成分成分pH值值孔径孔径电泳缓冲液电泳缓冲液甘氨酸甘氨酸(慢离子慢离子)8.3样品样品蛋白质蛋白质6.7浓缩胶浓缩胶Cl-(快离子快离子)6.7大大分离胶分离胶Cl-(快离子快离子)8.9小小有效迁移率有效迁移率 = 迁移率迁移率 解离度解离度 电泳时，氯离子跑得电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩质夹在中间而被压缩2. 2.分子筛效应分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率的迁移率3. 3.电荷效应电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。电荷量不同，迁移率不同。实验仪器及试剂实验仪器及试剂n 电泳装置电泳装置稳压电源稳压电源盘状电泳槽盘状电泳槽 毛细滴管毛细滴管 刻度吸量管刻度吸量管 灯泡瓶灯泡瓶 玻璃管和橡胶帽玻璃管和橡胶帽 微量移液器微量移液器 注射器和长针头注射器和长针头 脱色摇床脱色摇床 TEMED- TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。四甲基乙二胺，避光保存。 过硫酸铵过硫酸铵( (新鲜配制新鲜配制) ) 染色液：染色液：0.10.1溴酚兰液溴酚兰液 洗脱液：洗脱液：7 7醋酸醋酸 其他试剂：见下表贮存液的配制。其他试剂：见下表贮存液的配制。AcrAcr和和BisBis：棕色瓶保存：棕色瓶保存贮贮存液存液100ml溶液中的含量溶液中的含量pH工作溶液配制的体工作溶液配制的体积积比比11N HCl 48.Oml；Tris 36.6克克TEMED 0.23ml8.9分离胶制分离胶制备备： 1份份1号，号，2份份2号，号，1份份水；抽气后加入水；抽气后加入4份份3号号；凝胶凝胶浓浓度度 7；pH= 8.92Acr 28.0克克；Bis 0.725克克3过过硫酸硫酸铵铵 0.14克克41N HCl 48.Oml；Tris 5.98克克TEMED 0.46ml6.7浓缩浓缩胶制胶制备备： 1份份4号，号，2份份5号号；抽气抽气后加入后加入4份份6号号；凝胶凝胶浓浓度度 2.5；pH = 6.75Acr 10.0克克；Bis 2.5克克6蔗糖蔗糖 40.0克克7电电泳槽泳槽缓缓冲液：冲液：Tris 0.60克克甘氨酸甘氨酸 2.88克克8.3用用时时可稀可稀释释10倍倍500ml可供可供12根根电电泳管泳管实验步骤实验步骤1. 1. 每人取电泳管每人取电泳管1 1支，加支，加1 1滴滴4040蔗糖于橡胶帽内，蔗糖于橡胶帽内，堵住电泳管底部，塞紧。堵住电泳管底部，塞紧。2. 2. 制备分离胶：制备分离胶： （可灌胶（可灌胶1212支）支） 1 1号号2ml2ml2 2号号4ml4ml水水2ml2ml在灯泡瓶中混匀，在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至用真空泵抽气至无气泡；无气泡；加加3 3号号8ml8ml，混匀备用混匀备用最后加最后加 用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口2cm2cm处，然处，然后在距胶面约后在距胶面约1cm1cm处，沿玻管壁缓缓加入处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm3-5mm高的水层，高的水层，垂直静置垂直静置至再次出现界面时表明凝胶至再次出现界面时表明凝胶已经聚合。已经聚合。3. 3. 分离胶的灌制分离胶的灌制4. 4. 制备浓缩胶：（可灌胶制备浓缩胶：（可灌胶1212支）支） 4 4号号 1ml1ml5 5号号 2ml2ml6 6号号 4ml4ml在灯泡瓶中混匀，在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至用真空泵抽气至无气泡；无气泡；加加3 3号号1ml1ml，混匀备用混匀备用最后加最后加5. 5. 吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约1.5cm1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm0.5cm。垂直垂直放置放置至成胶。至成胶。6. 6. 成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。 7. 7. 样品样品制备制备血清：血清：1-21-2滴滴40%40%蔗糖：蔗糖：1 1滴滴0.05%0.05%溴酚兰：溴酚兰：1 1滴滴于于EP管中混匀备用管中混匀备用 倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul30ul，加在浓缩胶上。，加在浓缩胶上。8. 8. 上样上样9. 9. 电泳电泳上槽上槽负极；下槽负极；下槽正极正极稳流：稳流：1.5mA/1.5mA/管，管，3min3min 2.5mA/ 2.5mA/管，约管，约1h1h，至玻管，至玻管3/43/4处处10. 10. 剥胶剥胶 电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。就可将凝胶柱压出玻管。11. 11. 固定和染色固定和染色 用用7%7%醋酸固定醋酸固定3min3min； 用用0.1%0.1%溴酚蓝碱性液染色溴酚蓝碱性液染色5min5min（染色液回收）；（染色液回收）； 用洗脱液用洗脱液(7%(7%醋酸醋酸) )漂洗脱色漂洗脱色12. 12. 观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常实验结果实验结果+ 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂， 对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 制胶时，要充分摇匀，加速剂制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMEDTEMED最后加。最后加。 注意观察实验现象：分界面，浓缩效应注意观察实验现象：分界面，浓缩效应. . 溴酚蓝染色溴酚蓝染色脱色脱色染液回收。染液回收。 固体胶切忌倒入水池。固体胶切忌倒入水池。注意事项注意事项思考题思考题1. 圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？2. 圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什么？么？