基因的克隆与表达基因的克隆与表达山东大学医学院免疫学研究所马春红基因工程（基因工程（Genetic engineering,Ge):通通过过体外重体外重组组技技术术, 人人为为操作基因、改造基操作基因、改造基因，改因，改变变生物生物遗传遗传性状的性状的过过程。程。? 基本手段基本手段：分子生物学技：分子生物学技术术（体外重（体外重组组、杂杂交、交、电电泳等）泳等）? 目的目的：基因克隆：基因克隆基因表达基因表达主要内容?基因工程的克隆基因工程的克隆载载体体(genetic cloning vector)?基因克隆基因克隆(gene clonging)?基因表达基因表达(gene expression)-原核基因表达原核基因表达-真核基因表达真核基因表达第五章第五章 基因工程的克隆基因工程的克隆载载体体Genetic Cloning Vector基因工程的目的基因克隆基因克隆-获得目的基因基因表达基因表达-使受体的新性状表现，获得大量目的蛋白In vivo expressionIn vitro expression。载载体体- 基因工程中的重要工具基因工程中的重要工具载载体体(vector) ：携带外源DNA 进入宿主细胞的工具载载体的功能体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件载载体的两种体的两种扩扩增方式增方式- 自主复制型自主复制型载载体和附加体和附加载载体体克隆克隆载载体（体（cloning vector)? 定定义义? 特点特点? 常用常用载载体介体介绍绍第一第一节节 概述概述一、概念一、概念克隆克隆载载体（体（cloning vector) ：用于携：用于携带带目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）进进入受体入受体细细胞胞进进行复制、行复制、扩扩增的工具。增的工具。二、特点二、特点1、能独立复制，具有复制子（、能独立复制，具有复制子（replican)replican ：基因：基因组组中能独立复制的最小中能独立复制的最小单单位，含复制起始点（位，含复制起始点（ ori)和复制和复制终终点。点。 DNA的复制由的复制由ori控制控制原核原核细细胞的染色体和胞的染色体和质质粒有固定的粒有固定的ori真核真核细细胞的染色体有多个胞的染色体有多个ori2、属于松弛型复制子、属于松弛型复制子3、具有、具有复制非必需区复制非必需区4、有一个或多个、有一个或多个单单一一酶酶切位点，即多克隆位点切位点，即多克隆位点多克隆位点（多克隆位点（Multiple cloning site,MCS ）：一段人工合成的一段人工合成的DNA 序列，其上含有密集排列序列，其上含有密集排列的多种的多种单单一限制性内切一限制性内切酶酶位点，以利于不同来位点，以利于不同来源的外源源的外源DNA 插入插入载载体。体。5、具有、具有筛选标记筛选标记6、分子量合适（、分子量合适（3-10kb)7、高拷、高拷贝贝数数拷拷贝贝数（数（copy): 一个一个细细胞内存在的胞内存在的分子数分子数8、生物安全性好、生物安全性好三、常用克隆三、常用克隆载载体种体种类类质质粒（粒（plasmid)? ?噬菌体（噬菌体（bacteriophage ? ?)粘粒（粘粒（cosmid ）M13 噬菌体（噬菌体（bateriophage M13 ）人工染色体人工染色体第二第二节节 常用克隆常用克隆载载体介体介绍绍一、一、质质粒（粒（plasmid)（一）（一） 一般特性一般特性Plasmid ：染色体外能：染色体外能够进够进行自主复制的行自主复制的遗传单遗传单位。位。包括真核生物的包括真核生物的细细胞器和胞器和细细菌菌细细胞中染色体以外的胞中染色体以外的脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA) 分子。分子。现现在在习惯习惯上用来上用来专专指指细细菌、酵母菌和放菌、酵母菌和放线线菌等生物中染色体以外的菌等生物中染色体以外的 DNA 分分子。在基因工程中子。在基因工程中质质粒常被用做基因的粒常被用做基因的载载体体多多为环为环状双状双链链DNA可自我独立复制可自我独立复制天然存在：天然存在：F质质粒、粒、R质质粒等粒等（二）分（二）分类类? ?大小：小型大小：小型质质粒粒(? ?15kb )大型大型质质粒粒(? ?60kb)? ?功能：功能：F质质粒、粒、R质质粒粒? ?宿主：窄宿主范宿主：窄宿主范围质围质粒：粒：ori特异，特异，仅仅能能在一种宿主中复制在一种宿主中复制宽宽宿主范宿主范围质围质粒：粒：ori不特异，可不特异，可在多种宿主中复制在多种宿主中复制? ?复制复制类类型型：严紧严紧型型质质粒：复制受宿主粒：复制受宿主细细胞的胞的严严格控制格控制低拷低拷贝贝数（数（1-2copies/cell)松弛型松弛型质质粒：拷粒：拷贝贝数高数高(10-200 copies/cell)复制复制仅仅需需DNA聚合聚合酶酶I，不，不需蛋白需蛋白质质合成合成宿主宿主细细胞蛋白胞蛋白质质合成及染色合成及染色体复制停止体复制停止时时，可大量，可大量扩扩增至上千份增至上千份（氯氯霉素霉素）? ?构型构型：超螺旋型（超螺旋型（supercoiled circle,SC)or 共价共价闭环闭环双股双股DNA( covalently closed circle,CCC)开开环环型（型（opened circle,OC）线线形（形（linear circle,LC)（三）克隆（三）克隆质质粒的构建粒的构建1、构建、构建质质粒的目的粒的目的调调整整质质粒粒结结构、提高构、提高转转化率化率2、常用手段、常用手段：减小分子量减小分子量引入引入MCS引入具有多种用途的引入具有多种用途的辅辅助序列助序列3、克隆、克隆质质粒的粒的发发展展趋势趋势向天然向天然质质粒中引入粒中引入选择标记选择标记, pSC101多个多个质质粒重粒重组组，增，增强强选择标记选择标记，过过大，大，pBR31减小复制非必需区，减小复制非必需区，缩缩小分子量小分子量，pBR322调调整整质质粒粒结结构，提高构，提高载载体序列体序列（减小分子量、引入（减小分子量、引入MCS及及辅辅助序列）助序列）单标记单标记、复制效、复制效率低率低双双标记标记，50%以上以上的复制非必需区的复制非必需区物理物理图谱图谱（physical map): 在在DNA 分子上分子上标标明限制性内切明限制性内切酶酶位点、位点、数目、排列数目、排列顺顺序及特序及特征性功能征性功能标记标记的的图图形。形。又称又称为为限制限制图谱图谱（restriction map)载载体物理体物理图谱识图图谱识图要求要求1、载载体大小体大小2、载载体体类类型型3、载载体体组组成成物理物理图谱图谱（phisical map)4、载载体主要元件（特点）体主要元件（特点）及其及其应应用用（四）常（四）常见见人工构建人工构建质质粒的分粒的分类类:人工构建的人工构建的质质粒根据其功能及用途分粒根据其功能及用途分为为 :1. 多拷多拷贝质贝质粒粒 复制子复制子经过经过人工突人工突变变，除去控制拷，除去控制拷贝贝数数负调节负调节基因，使基因，使质质粒拷粒拷贝贝数达到每个数达到每个细细胞数千，用于胞数千，用于扩扩增外源基因。增外源基因。2. 测测序序质质粒粒3. 整合整合质质粒粒 装有整合促装有整合促进进基因及整合特异序列，便于基因及整合特异序列，便于外源基因准确重外源基因准确重组组整合入受体整合入受体细细胞的染色体上胞的染色体上4. 穿梭穿梭质质粒粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体受体细细胞中复制胞中复制5. 表达表达质质粒粒 装有装有强强的启的启动动基因，合适的基因，合适的顺顺序以及有效序以及有效的的终终止子，以便任何外源基因在受体止子，以便任何外源基因在受体细细胞内的高效表胞内的高效表达达（五）常用五）常用质质粒介粒介绍绍1、 pBR322 77年年Boliver构建构建? 质质粒命名原粒命名原则则? 4.36kb?双双标记标记? 分散的多个分散的多个单单一一酶酶切位点切位点? 插入插入灭灭活活? 双抗菌素双抗菌素对对照照实验实验插入失活、双抗菌素插入失活、双抗菌素对对照照实验实验pBR322衍生衍生质质粒粒2、 pUC18/19 pBR322 的重要衍生的重要衍生质质粒粒1983 年构建：年构建：pBR322+M13基本元件：基本元件：orirAmpMCS辅辅助序列：助序列：lacZ基因基因lacI基因基因乳糖操乳糖操纵纵子子? lacZ基因基因编码编码? ?-半乳糖苷半乳糖苷酶酶?lacI基因基因编码编码阻遏蛋白阻遏蛋白,使使lacZ不能表达不能表达?诱导诱导物与阻遏蛋白物与阻遏蛋白结结合合,lacZ表达表达乳糖操乳糖操纵纵子的表达子的表达调调控控pUC 载载体体蓝蓝白斑白斑筛选筛选的原理的原理- 插入失活插入失活1pUC载载体体(含含lacZ、lacI基因）基因）诱导诱导物物(IPTG)lacZ表达表达? ?-半乳糖苷半乳糖苷酶酶N端片段（端片段（? ?-肽肽）宿主宿主细细胞胞lacZ? ?M15缺陷型缺陷型? ?-半乳糖苷半乳糖苷酶酶? ?-半乳糖苷半乳糖苷酶酶X-gal变兰变兰色色pUC 载载体体蓝蓝白斑白斑筛选筛选的原理的原理- 插入失活插入失活2pUC载载体体(含含lacZ、lacI基因）基因）外源基因插入外源基因插入lacZ失活失活不不产产生生? ?-半乳糖苷半乳糖苷酶酶N端端片段（片段（? ? -肽肽）X-gal不不变变色，呈白色色，呈白色3、 pGEM系列系列pGEM-1 MCS 两两侧侧有有SP6 、T7RNA聚合聚合酶酶启启动动子子pGEM-1 MCS 两两侧侧有有SP6 、T7RNA聚合聚合酶酶启启动动子子1、可、可进进行体外行体外转录转录转录转录具有特异性具有特异性可分可分别转录别转录插入片段的两条插入片段的两条链链转录产转录产物可制物可制备备体外翻体外翻译译的模板、的模板、探探针针及反及反义义RNA2、为为插入片段的插入片段的测测序提供特异引物位序提供特异引物位点点pGEM-3/4Z-MCS位于位于lacZ基因内部基因内部? 插入失活插入失活蓝蓝白斑白斑筛选筛选? 具有具有SP6 、T7启启动动子子pGEM-3Zf(+)/(-)-引入引入丝丝状噬菌体状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点复制起始点?可以可以产产生生单链单链DNA，并，并分泌至上清中，便于分泌至上清中，便于对对插入片段插入片段进进行行测测序序?F1的方向的方向(+/-)决定复制决定复制哪一条哪一条链链4、 T-vector用于用于PCR 产产物的直接克隆物的直接克隆载体DNA 两条链的5端有一个游离的T：PCR 产物的直接克隆SP6 、T7启动子：体外转录、为克隆产物的测序提供特异性引物插入位点两侧的酶切位点：为回收克隆片段进行亚克隆提供便利的酶切位点5、pCDNA3- 穿梭穿梭载载体体穿梭穿梭载载体（体（shuttle vector)即可以携即可以携带带外源基因在原核外源基因在原核细细胞中复制，又可以使其在真核胞中复制，又可以使其在真核细细胞胞中表达的中表达的载载体体。小小结结质质粒的粒的发发展展趋势趋势：调调整整质质粒粒结结构、提高构、提高载载体效率：减小分子体效率：减小分子量、引入量、引入MCS引入多种用途的引入多种用途的辅辅助序列助序列:lacZ、lacI 基因：基因：蓝蓝白斑白斑筛选筛选SP6 、T7RNA聚合聚合酶酶启启动动子：子：体外体外转录转录F1复制起始点：复制起始点：产产生生单链单链DNA真核启真核启动动子：子：穿梭穿梭载载体体二、二、? ?噬菌体噬菌体载载体体（一）（一）噬菌体的分子生物学噬菌体的分子生物学1、噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和白和 -DNA 组组成成2、 -DNA ：线线状双状双链链DNA 分子，全分子，全长长48.5kb两端各有一个两端各有一个12核苷酸的互核苷酸的互补单链补单链（粘性末（粘性末端，端，GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，称，称为为Cos 位点（位点（cohesive end ）或或cos 区。区。功能相近的基因在基因功能相近的基因在基因组组中聚集在一起。中聚集在一起。? 噬菌体生物学性状介噬菌体生物学性状介绍绍3、基因、基因组组成：成：?Cos 位点（位点（cohesive end)：DNA 分子两端各有一个分子两端各有一个12碱基碱基长长的互的互补单链顺补单链顺序，是天然的粘性末端，称序，是天然的粘性末端，称cos位点位点?左臂（左臂（编码编码外壳蛋白外壳蛋白）：）：头头部基因（部基因（7个）、尾部基因个）、尾部基因（11个）个）?右臂（右臂（负责负责裂解宿主裂解宿主细细胞、胞、 DNA 自主复制以及自主复制以及调调控控 ) ：裂：裂解基因（解基因（2个）个）?中中间间段段( 控制基因控制基因组组整合到寄主基因的基因整合到寄主基因的基因 )：DNA 复制复制及溶菌生及溶菌生长长非必需区非必需区 （重（重组组基因、正基因、正调调控基因、控基因、负调负调控控基因）、基因）、DNA 合成基因合成基因cos 位点的作用位点的作用4、生活周期、生活周期温和性噬菌体温和性噬菌体（二）（二） DNA 载载体的构建体的构建建立建立克隆载体前需要解决克隆载体前需要解决 2个个问题问题：1）包装容量有限）包装容量有限：DNA分子只能增加分子只能增加5% 的大小，意味着只能插入的大小，意味着只能插入3kb 的的DNA 分子。分子。2）酶酶切位点复切位点复杂杂： 基因组非常大，基因组非常大，对对于每一种于每一种酶酶来来讲讲都含有超都含有超过过1个的个的识别识别序序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因基因组组。两种解决方案：两种解决方案：1）缩缩短短长长度度： DNA 上上约约有有40-50% 的的DNA 片段是片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载载量。量。2）修）修饰饰酶酶切切识别识别位点：位点： 利用自然利用自然选择选择法法获获得限制得限制性位点缺失的性位点缺失的品系。品系。天然的天然的 -DNA 上有多个上有多个酶酶切位点，如：切位点，如： EcoRI 5个，个，HindIII 7 个，个，这这些多余的些多余的酶酶切位点必切位点必须须被修被修饰饰。自然选择法：利用一个产生EcoRI 的大肠杆菌，大部分侵入细胞的 DNA 分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI 位点缺失了。（三）（三） 噬菌体噬菌体载载体体1、基本、基本组组成元件成元件? Cos 位点位点? 左臂（左臂（头头尾基因）尾基因）? 右臂（裂解基因）右臂（裂解基因）? 酶酶切位点切位点? 噬菌体噬菌体载载体体2、类类型：型：?插入型插入型载载体：体：含有含有单单个或多个个或多个单单一一酶酶切切位点供外源基因插位点供外源基因插?替替换换型型载载体：体：含有一含有一对对或多或多对对酶酶切位点切位点便于外源基因替便于外源基因替换换插入型插入型载载体体(insertion vector)该类载该类载体体经经改造后的改造后的长长度度为为 37kb ，为为包装包装的下限，它本身也能被包装，其允的下限，它本身也能被包装，其允许许的插入片段的插入片段最大最大为为13.9kb（54.9-37kb）。）。由于由于该类载该类载体重体重组组与否均可包装，因而与否均可包装，因而为为区分重区分重组组子与非重子与非重组组子必子必须须携携带标记带标记基因。（基因。（ 0-13.9kb）gt10： 可以携可以携带带8kb的的DNA 分子，插入位于分子，插入位于cI 基基因内的因内的单单一的一的酶酶切位点切位点 EcoRI 。插入失活。插入失活导导致致裂解循裂解循环环，从而很容易，从而很容易识别识别重重组组子。子。ZAPII： 含有多聚接含有多聚接头头，可以使用六种不同的，可以使用六种不同的限制性内切限制性内切酶酶插入插入约约 10kb 的新的的新的DNA 分子，通分子，通过过lacZ基因的插入失活基因的插入失活鉴鉴定重定重组组子，不能形子，不能形成成蓝蓝色的噬菌斑。色的噬菌斑。替替换换型型载载体体(replacement vector)该类载该类载体体经经改造后的改造后的长长度度约为约为 40kb ，在非必需，在非必需区域内含有两个相同的区域内含有两个相同的酶酶切口，两者切口，两者间间的距离的距离为为 14kb长长，使用，使用时时用用酶酶切开，分离去除切开，分离去除这这个个 14kb 长长的的DNA 片片段，然后用外源段，然后用外源 DNA 片段取代之。片段取代之。特点：特点：容量大，且有一个下限容量大，且有一个下限 ：40-14kb=26kb 包装下限包装下限为为36.4kb，因此其，因此其载载装下限装下限为为 10.4而上限而上限为为25.5kb。不再需要不再需要标记标记基因基因 ，因，因为为空空载载的的载载体体 DNA 只有只有26kb ，不可能被包装，因而无法，不可能被包装，因而无法进进入受体入受体细细胞中去。胞中去。WES. B ：两个两个 EcoRI 位点跨越替位点跨越替换换区区域，根据分子大小域，根据分子大小筛选筛选重重组组子。子。EMBL4： 可以插入可以插入20kb 的的DNA 分子，可利用分子，可利用EcoRI 、BamHI 、SalI 替替换换填充片段，因此填充片段，因此可以插入不同粘端的可以插入不同粘端的DNA 片断。片断。? ?EMBL3?噬菌体噬菌体载载体体3、体外包装、体外包装将重将重组组的噬菌体的噬菌体DNA 分子与噬菌体分子与噬菌体头头、尾部蛋白混合，通尾部蛋白混合，通过过自自动动包装，体包装，体外外组组成完整的具有极成完整的具有极强强感染性噬菌感染性噬菌体体颗颗粒的粒的过过程。程。噬菌体噬菌体载载体体外源基因外源基因替替换换/ 插入插入重重组组噬菌体噬菌体DNA噬菌体噬菌体头头、尾蛋白、尾蛋白体外包装体外包装感染力感染力较较低低感染力极感染力极强强子代病毒子代病毒颗颗粒粒转转染染宿主宿主大量大量扩扩增目的增目的DNA ?噬菌体噬菌体载载体体4、用途：、用途：构建文构建文库库，容量大，容量大5. -DNA 作作为载为载体的体的优优点点1) -DNA 可在体外包装成噬菌体可在体外包装成噬菌体颗颗粒，粒，能高效感染大能高效感染大肠肠杆菌杆菌2) -DNA 作作为载为载体，其装体，其装载载外源外源DNA 的的能力能力为为25kb ，远远远远大于大于质质粒的装粒的装载载量量3) 重组重组 -DNA 的的筛选较为筛选较为方便方便4) 重组重组 -DNA 分子的提取比分子的提取比质质粒容易粒容易三、三、 粘粒（粘粒（cosmid) 1978年构建年构建（一）考斯（一）考斯质质粒粒 (粘粒，粘粒，cosmid) ：即含有：即含有 -DNA 两端两端cos区的区的质质粒。粒。 -DNA 包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长将此DNA 片段与质粒连在一起，即 cosmid,就可装载更大的外源DNA 片段，同时它仍可象 -DNA 一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌考斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。由质粒和噬菌体构建而成，同时具备二者的特点：质粒ori- 环状复制单一酶切位点选择标记Cos 位点体外包装构建DNA 文库，容量为2945kb（二）（二） 考斯考斯质质粒的粒的优优越性越性1) 能象能象 -DNA 一一样样体外包装，并高效体外包装，并高效导导入受体入受体细细胞胞2) 容量大，如容量大，如cos 区及附近区及附近顺顺序序长为长为1.7 kb，质质粒粒长为长为3.3kb，则该则该考斯考斯质质粒最大可粒最大可装装载载46.5kb的外源的外源DNA3) 由于携由于携带质带质粒的粒的选择标记选择标记，便于，便于筛选筛选4) 由于由于质质粒上的多种粒上的多种单单一一酶酶切位点，便切位点，便于克隆。于克隆。以以cosmid 为载为载体克隆体克隆DNA 的技的技术术路路线线四、四、M13 噬菌体噬菌体载载体体M13 噬菌体：噬菌体：E.coli 的的丝丝状噬菌体状噬菌体闭环闭环正正链链ssDNA ，6.4kbM13 生殖周期生殖周期向胞外分泌向胞外分泌单链单链DNAM13 噬菌体噬菌体载载体的构建：体的构建：主要是插入主要是插入标记标记基基因如，因如，lacZ 、多克隆位点，消除多余的、多克隆位点，消除多余的酶酶切位点。切位点。M13 噬菌体噬菌体载载体：用于制体：用于制备单链备单链DNA 、测测序序噬菌粒（噬菌粒（Phagemid ）：质质粒与粒与M13-DNA的重的重组组体，既有体，既有质质粒的复制起始点，又有粒的复制起始点，又有M13 的的复制起始点。复制起始点。特点：特点：1、既可在、既可在质质粒粒ori 的控制下的控制下产产生生dsDNA, 也在也在辅辅助噬菌体的帮助下，像助噬菌体的帮助下，像M13 一一样产样产生生ssDNA.2、带带有有质质粒上的粒上的酶酶切位点及切位点及标记标记基因，基因，这样这样更于更于筛选筛选及克隆，及克隆，3、不含包装蛋白基因，、不含包装蛋白基因，载载体本身体本身长长度减少，度减少，装载量增大，比质粒大，但不及装载量增大，比质粒大，但不及 -DNA五、五、人工染色体人工染色体克隆大片段克隆大片段DNA1、真核生物染色体中的关键部位（分裂、复制必需区）着丝粒(centromere,CEN):分裂端粒(telomere,TEL) ：保护染色体、维持染色体复制自主复制序列(autonomously replication sequence，ARS) ：复制起始位点2、人工染色体：、人工染色体：以真核生物的以真核生物的CEN 、TEL 、ARS 为为骨架，可携骨架，可携带带插入的外源基因插入的外源基因进进行行复制，即复制，即为为人工染色体人工染色体3、种、种类类：酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeat artificial chromosome,YAC)细细菌人工染色体菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)YAC: 利用酵母的利用酵母的TEL 、ARS 及及CEN 构建的人构建的人工染色体工染色体结结构构：左臂左臂：TEL 、选择标记选择标记、ARS 、CEN 、右臂右臂：TEL 、选择标记选择标记特点特点：容量大（容量大（50-1000kb ），减少克隆数），减少克隆数稳稳定性差，不易分析定性差，不易分析BAC ：利用利用细细菌复制非必需区菌复制非必需区(TEL, ARS, CEN ）构建的人工染色体）构建的人工染色体载载体容量体容量为为100-300kb