常用蛋白质相互作用常用蛋白质相互作用技术介绍技术介绍SPR技术分析蛋白质相互作用技术分析蛋白质相互作用体外转录和翻译体外转录和翻译鉴定蛋白质相互作用鉴定蛋白质相互作用coupledtranscription/translationreaction偶联的转录和翻译过程continuousexchangecell-free(CECF)principle持续交换和非细胞体系的原理偶联的转录和翻译过程偶联的转录和翻译过程T7-RNA polymeraseE.coli lysategeneDNAcoupled transcription / translationproteingene持续交换和非细胞体系的原理T7RNApolymeraseTranslationmachineryE. coliEnergyregeneratingsystemProteinDNAtemplateAminoacidsEnergysubstratesBuffercomponentsNTPsSupplyAminoacidsEnergysubstratesBuffercomponentsNTPsSupplyInhibitory by-productsInhibitory by-productsmembranemembrane供给腔供给腔 反应腔反应腔 供给腔供给腔microtiter-platePCRtubesRTS500devicesmicrocentrifugetubes4x12 RTS 1008x 96x RTS 100RTS500 反应装置反应装置reactionchamberfeedingchamberwithsemipermeablemembranesRTS500ProteoMasterE. coliHYKit 质谱质谱 X射线结晶学射线结晶学核磁共振核磁共振 结构生物学的蛋白标记结构生物学的蛋白标记theaminoacidsandmethioninearebothprovidedseparatelyfromallotherkitreagentsother desired amino acidscanbeexchangedbyusingtheRTS Amino Acid SamplerincombinationwiththeRTS500HYRTS 500 HYMethioninespecificlabelingofproteinsispossiblebysubstituting the methionineor结构分析结构分析GST融合蛋白鉴定蛋白质相互作用融合蛋白鉴定蛋白质相互作用GST PULL-DOWN：通过与：通过与GST融合蛋白质融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未知蛋白质，再通过纯化一个未知蛋白质，再通过GST与谷光苷肽与谷光苷肽偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质，从而分偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质，从而分离出蛋白质复合物。离出蛋白质复合物。 1 含有表达质粒的细菌培养；含有表达质粒的细菌培养；2 诱导表达；诱导表达；3 收集菌体；收集菌体；4 加蛋白酶抑制剂，冰上破碎细胞；加蛋白酶抑制剂，冰上破碎细胞；5 离心取上清，按离心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠，在的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠，在4C，温和混匀，温和混匀30分钟；分钟；6 离心收集琼脂糖球珠，用离心收集琼脂糖球珠，用PBS轻轻混匀悬浮，反复三次；轻轻混匀悬浮，反复三次；7 将混合物装柱，让将混合物装柱，让PBS流出；流出；8 加还原性的加还原性的GSH将融合蛋白洗脱；将融合蛋白洗脱；9 SDS-PAGE检测蛋白质纯化情况。检测蛋白质纯化情况。注意：绝大部分工作应在注意：绝大部分工作应在4C4C进行；对照？进行；对照？GST融合蛋白纯化基本程序融合蛋白纯化基本程序免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用当细胞在非变性条件下当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保多蛋白质之间的结合保持下来，因而可以据此持下来，因而可以据此检测生理条件下相关蛋检测生理条件下相关蛋白质间的相互作用。如白质间的相互作用。如果蛋白质果蛋白质X用其抗体免用其抗体免疫沉淀，在细胞内与疫沉淀，在细胞内与X稳定结合的蛋白质稳定结合的蛋白质Y也也可能沉淀下来。蛋白质可能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与的沉淀是基于与X的物的物理相互作用，被称为免理相互作用，被称为免疫共沉淀。疫共沉淀。注意：绝大部分工作应在注意：绝大部分工作应在4C4C进行；对照？进行；对照？串联亲和纯化鉴定蛋白质相互串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用和蛋白质复合体作用和蛋白质复合体Tandem affinity purification-TAP将靶蛋白与蛋白质标签融合并在天然宿主细胞中表达，将靶蛋白与蛋白质标签融合并在天然宿主细胞中表达，制备提取物，然后采用标准的两步法重获靶蛋白及与其制备提取物，然后采用标准的两步法重获靶蛋白及与其相互作用的蛋白质组份。相互作用的蛋白质组份。成像的方法鉴定蛋白质相互作用；成像的方法鉴定蛋白质相互作用；噬菌体表面展示鉴定蛋白质相互作用；噬菌体表面展示鉴定蛋白质相互作用；原子力显微镜检测蛋白质相互作用；原子力显微镜检测蛋白质相互作用；计算机方法；计算机方法；化学交联技术鉴定蛋白质相互作用等等。化学交联技术鉴定蛋白质相互作用等等。其它方法其它方法