第五章第五章 低压液相层低压液相层析（色谱）技术析（色谱）技术慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液液相色谱法液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。：以液体为流动相的色谱法称。 经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相常压下输送流动相常压下输送流动相常压下输送流动相 柱效较低柱效较低柱效较低柱效较低 分析周期长分析周期长分析周期长分析周期长 现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相高压下输送流动相高压下输送流动相高压下输送流动相 柱效较高柱效较高柱效较高柱效较高 分析周期短分析周期短分析周期短分析周期短特性特性特性特性经典经典经典经典LCLCLCLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC优势优势优势优势进样进样进样进样人工加样人工加样人工加样人工加样进样器进样器进样器进样器准确准确准确准确溶液流动溶液流动溶液流动溶液流动重力重力重力重力高压泵高压泵高压泵高压泵快速分离快速分离快速分离快速分离, , , ,重现性好重现性好重现性好重现性好检测和定量检测和定量检测和定量检测和定量 收集馏分检收集馏分检收集馏分检收集馏分检测测测测连续检测连续检测连续检测连续检测高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度, , , ,自动化自动化自动化自动化实验结果实验结果实验结果实验结果棒式图棒式图棒式图棒式图色谱图色谱图色谱图色谱图五高一广五高一广五高一广五高一广表表11.1 11.1 两种不同形式液相色谱的这样特征两种不同形式液相色谱的这样特征 1 1、国产低压液相色谱系统、国产低压液相色谱系统国产常压液相色谱系统的组成国产常压液相色谱系统的组成层析柱层析柱恒流泵恒流泵核酸蛋白检测仪核酸蛋白检测仪自动分部收集器自动分部收集器记录仪记录仪一、一、低压低压液相色谱系统液相色谱系统 层析柱层析柱（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子） 层析柱：填料的充填恒流泵：提供稳定的液流紫外检测仪：信号检测部分收集器：样品的分部收集部分收集器：样品的分部收集记录仪：记录信号 BSBS100100自动部分收集器安装圈自动部分收集器安装圈1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、顺）；17手动开关 层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪2、GE AKTA systemsAKTA primeAKTA explorerAKTA FPLC3、Bio rad systems二、柱层析法的一般技术二、柱层析法的一般技术层析柱层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。比较适宜。一、层析材料的准备一、层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如例如: : 凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化活化活化活化 离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。 凝胶的前处理的方法凝胶的前处理的方法a.a.溶胀：溶胀：称取适量凝胶干粉，用约称取适量凝胶干粉，用约1010倍蒸馏水浸泡倍蒸馏水浸泡2424小小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。b.b.碱洗：碱洗：用用0.5 M NaOH 0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。水洗至中性。c.c.酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。水洗至中性。d.d.平衡：平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pHpH与起始与起始缓冲液相同。缓冲液相同。 在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。流速将显著降低。 二、装柱二、装柱 装柱是装柱是最关键最关键的一步。的一步。重力沉降法装柱重力沉降法装柱陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。床体积为止。 柱的表面始终要保持着一层溶剂柱的表面始终要保持着一层溶剂( (一般一般l l3cm3cm柱高柱高) )柱的柱的任何一部分绝对任何一部分绝对不能不能“流干流干”。 层析柱的形状，一般直径层析柱的形状，一般直径层析柱的形状，一般直径层析柱的形状，一般直径与高度的比为与高度的比为与高度的比为与高度的比为l l l l：15151515为宜。为宜。为宜。为宜。 柱形必须根据层析介质和柱形必须根据层析介质和柱形必须根据层析介质和柱形必须根据层析介质和分离目的而定。分离目的而定。分离目的而定。分离目的而定。 待分离物质的性质相近，待分离物质的性质相近，待分离物质的性质相近，待分离物质的性质相近，柱越细长，柱越细长，柱越细长，柱越细长， 则分离效果越则分离效果越则分离效果越则分离效果越好，但流速较慢。好，但流速较慢。好，但流速较慢。好，但流速较慢。 在样品组分并不复杂的情在样品组分并不复杂的情在样品组分并不复杂的情在样品组分并不复杂的情况下，采用况下，采用况下，采用况下，采用“矮胖柱矮胖柱矮胖柱矮胖柱”。 三、平衡三、平衡 层析柱正式使用前，必须平衡至所需的层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pHpH和离子强度，一和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于3 3-5 -5-5 -5倍床体积，倍床体积，倍床体积，倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须均匀，均匀，无纹路，不含气泡，无纹路，不含气泡，无纹路，不含气泡，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。柱顶交换剂沉积表面十分平坦。 检查柱是否均匀，可用检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖20002000，在恒压下走柱，在恒压下走柱，如如色带均匀下降色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重新装柱新装柱 四、加样量和加样体积四、加样量和加样体积 加样量的多少和加样体积大小是影响分离效果的关键因加样量的多少和加样体积大小是影响分离效果的关键因素，加样量越少和加样体积越小，则分离效果越好。素，加样量越少和加样体积越小，则分离效果越好。它主要取决于层析目的它主要取决于层析目的( (分析性柱层析或制备性柱层析分析性柱层析或制备性柱层析) )，也与样品中种类多少，相对浓度及亲和力有关。，也与样品中种类多少，相对浓度及亲和力有关。对于分析性柱层析，加样量一般不超过床体积对于分析性柱层析，加样量一般不超过床体积0.5-10.5-1，制备性柱，制备性柱层析加样量层析加样量不超过不超过不超过不超过1-31-31-31-3。 离子交换剂的加样量远远大于分子筛。离子交换剂的加样量远远大于分子筛。如果要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时，如果要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时，则样品的体积尽可能小。则样品的体积尽可能小。 1 1样品的准备样品的准备 样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不同，预处理的方法也往往不同。同，预处理的方法也往往不同。同，预处理的方法也往往不同。同，预处理的方法也往往不同。 一般使其与起始缓冲液有相同一般使其与起始缓冲液有相同一般使其与起始缓冲液有相同一般使其与起始缓冲液有相同pHpHpHpH，低的离子强度和尽可低的离子强度和尽可低的离子强度和尽可低的离子强度和尽可能小的体积。能小的体积。能小的体积。能小的体积。 预处理可酌情用预处理可酌情用预处理可酌情用预处理可酌情用超滤法、透析法和凝胶过滤法超滤法、透析法和凝胶过滤法超滤法、透析法和凝胶过滤法超滤法、透析法和凝胶过滤法等进行浓等进行浓等进行浓等进行浓缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法除去。除去。除去。除去。 2 2加样方法加样方法 有有3 3种方法可将样品加到已制备好的柱顶：种方法可将样品加到已制备好的柱顶：1. 1.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加样；地用移液管加样；保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分重要。重要。为此，除加样时注意为此，除加样时注意不破坏胶面平整外不破坏胶面平整外不破坏胶面平整外不破坏胶面平整外，在整个层析，在整个层析过程中，应在胶面上端过程中，应在胶面上端保留合适体积的洗脱液保留合适体积的洗脱液保留合适体积的洗脱液保留合适体积的洗脱液( (约约1-2 1-2 cmcm柱高柱高) )，避免洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或，避免洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或可能造成胶床干裂。可能造成胶床干裂。2. 2.不需要让柱流干至床表面，不需要让柱流干至床表面，而是加入而是加入1 1浓度的蔗糖来增浓度的蔗糖来增加样品的密度；加样品的密度；3. 3. 用一个毛细管和一个注射用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面到柱表面( (如一些商品柱附有如一些商品柱附有专门加样装置专门加样装置) )。 洗脱洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。使用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作使用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。五、洗脱五、洗脱 六、流速及控制六、流速及控制 洗脱液流速也往往影响层析的分辨率洗脱液流速也往往影响层析的分辨率在整个分离过程中，洗脱液通过柱时保持稳定的在整个分离过程中，洗脱液通过柱时保持稳定的流速是十分重要的。流速是十分重要的。与流速有关的因素与流速有关的因素 所用介质的结构、粗细及数量；所用介质的结构、粗细及数量；层析柱大小，介质填装的松紧层析柱大小，介质填装的松紧; ;洗脱液的粘度、操作压等洗脱液的粘度、操作压等. . 必须根据具体条件反复试验以确必须根据具体条件反复试验以确定一个合适的流速。定一个合适的流速。太高的流速使洗脱峰加宽，继而降太高的流速使洗脱峰加宽，继而降低了分辨率；低了分辨率；过高时，有时会使流速先快后慢甚过高时，有时会使流速先快后慢甚至发生阻塞。至发生阻塞。流速可以通过调节流速可以通过调节“操作压操作压”来来控制，控制，“操作压操作压”相当于在柱相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的水平和上部的贮液瓶中溶剂的水平和柱出水口位置的水平之差。柱出水口位置的水平之差。获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。液泵入或泵出柱，并保持稳定流速。 七、分部收集七、分部收集 洗脱液必须分成小部分收集，每一部分相当于洗脱液必须分成小部分收集，每一部分相当于2 25 5的床体积。的床体积。这些部分一般被收集在试管中，使得在柱上已经分这些部分一般被收集在试管中，使得在柱上已经分离的化合物仍然处于分离的状态。离的化合物仍然处于分离的状态。每管收集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。每管收集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。已有各种商品的已有各种商品的自动部分收集器自动部分收集器( (fraction collector) fraction collector) 。它们设计成当一个。它们设计成当一个管中收集了一定量的洗脱液后一个新的管中收集了一定量的洗脱液后一个新的收集管自动地接替了它的位置。收集管自动地接替了它的位置。预先确定的预先确定的体积体积转移到每一个管中，或转移到每一个管中，或用电子控制的方法使预定的用电子控制的方法使预定的滴数滴数滴入每滴入每一管。在一个固定的时间内，让洗脱液一管。在一个固定的时间内，让洗脱液进入每个管。进入每个管。八、检测和合并收集八、检测和合并收集 洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，为了测定收集的洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，为了测定收集的各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分离化各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分离化合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法，合物的方法来进行分析，一般可用直接或间接方法， 直接法直接法: : 分光光度法、光折射法、荧光法和放免法分光光度法、光折射法、荧光法和放免法分光光度法、光折射法、荧光法和放免法分光光度法、光折射法、荧光法和放免法等。等。 间接法间接法: : 化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法和生物活性测定法和生物活性测定法和生物活性测定法和生物活性测定法等。等。如果某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫如果某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫外光有吸收，如蛋白质在外光有吸收，如蛋白质在280280nmnm，核酸在核酸在260260nmnm处有最处有最大的吸收。可用核酸白质检测仪。大的吸收。可用核酸白质检测仪。洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的欲得高纯度的化合物，一般根据洗脱峰位置收集合并较窄的部分；部分；欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。欲得产量较多目的物，则合并较宽部分。九、洗脱峰的纯度鉴定九、洗脱峰的纯度鉴定 由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不一定代表一个纯净的组分。一定代表一个纯净的组分。如果洗脱峰峰形不对称，或出现如果洗脱峰峰形不对称，或出现“肩肩”( (shoulder)shoulder)，则表则表示混有杂质。示混有杂质。对在一个特定的柱层析分对在一个特定的柱层析分离条件下显示出的每个峰离条件下显示出的每个峰要用几个纯度标准要用几个纯度标准( (一般一般2- 2-3 3个高分辨率方法个高分辨率方法) )来检验，来检验，才能确定它的均一性。才能确定它的均一性。例如，可采用例如，可采用SDSSDS电泳法、电泳法、等电聚焦法、高效液相层析等电聚焦法、高效液相层析法和测定法和测定N N末端氨基酸残基末端氨基酸残基方法等。方法等。十、脱盐和浓缩十、脱盐和浓缩 洗脱峰在纯度鉴定的基础上，将同一组分合并。洗脱峰在纯度鉴定的基础上，将同一组分合并。若欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超若欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超滤滤( (去盐、去水去盐、去水) )，透析去盐，透析去盐再用冰冻干燥或有机溶剂沉淀等方法处理，得到干粉或沉再用冰冻干燥或有机溶剂沉淀等方法处理，得到干粉或沉淀。淀。科研、生产中要得到高纯度组分，往往要经过几次柱科研、生产中要得到高纯度组分，往往要经过几次柱层析层析每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再上第二次柱。上第二次柱。 十一、凝胶的再生及保存十一、凝胶的再生及保存1 1、再生、再生( (一般无需做再生处理一般无需做再生处理) )用过的凝胶经用过的凝胶经0.5M0.5M的的NaOH(NaOH(含含0.5M0.5M的的NaCI)NaCI)混合液混合液浸泡浸泡当污染严重时用当污染严重时用0.5MHCl0.5MHCl做短暂处理做短暂处理2 2、防霉、防霉 0.02%0.02%叠氮钠或叠氮钠或0.002%0.002%双氯苯双胍己烷双氯苯双胍己烷3 3、凝胶的保存方法：、凝胶的保存方法：湿态湿态加入防腐剂后低温保存（加入防腐剂后低温保存（-4 -4 ）半收缩态半收缩态水洗净后滤干，用水洗净后滤干，用60%-70%60%-70%的乙醇洗涤，使凝胶体积的乙醇洗涤，使凝胶体积缩小，低温保存。缩小，低温保存。干态干态水洗净后滤干，用水洗净后滤干，用60%,70%,90%, 95%,60%,70%,90%, 95%,的乙醇逐步脱的乙醇逐步脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥水，再用乙醚洗去乙醇，干燥 保存。切忌开始就用保存。切忌开始就用浓乙醇浓乙醇, ,防止结块。防止结块。