第十四章第十四章维生素类药物的分析维生素类药物的分析AnalysisofVitamines 维生素维生素A 维生素维生素B1 维生素维生素C 维生素维生素E一、结构与性质一、结构与性质 1.1.结构结构 环己烯环己烯 多烯醇（共轭双键系统）多烯醇（共轭双键系统） R=H VR=H VA A醇醇( (维生素维生素A A1 1) )：性质活泼：性质活泼 R=CHR=CH3 3CO- CO- V VA A醋酸酯：性质稳定醋酸酯：性质稳定第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析2.2.物理性质物理性质 淡黄色或红色油状或固定物，几乎无气味，淡黄色或红色油状或固定物，几乎无气味，不溶于水，易溶于氯仿，乙醚，环己烷和油中不溶于水，易溶于氯仿，乙醚，环己烷和油中 V VA A醇：醇：maxmax( (异丙醇异丙醇)325nm)325nm V VA A酯：酯：maxmax( (环己烷环己烷)328nm)328nm第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析3.3.化学性质化学性质 日光照射裂解日光照射裂解 空气、氧化剂、加热或金属离子等空气、氧化剂、加热或金属离子等 产生环氧化物、醛、酸产生环氧化物、醛、酸 三氯化锑反应三氯化锑反应 蓝色产物（不稳定）、渐变成紫红色蓝色产物（不稳定）、渐变成紫红色第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析（二）（二） 鉴别鉴别 1. Carr-price1. Carr-price反应（三氯化锑）反应（三氯化锑） 三氯化锑的氯仿液与三氯化锑的氯仿液与V VA A作用产生蓝色作用产生蓝色 渐变成紫红色渐变成紫红色 无水：三氯化锑水解、无水：三氯化锑水解、V VA A不溶不溶 无醇：乙醇能和反应中正碳离子作用无醇：乙醇能和反应中正碳离子作用第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析 2.2.紫外法紫外法 本品加无水乙醇盐酸溶解，立即紫外扫描本品加无水乙醇盐酸溶解，立即紫外扫描 326nm326nm单一吸收峰单一吸收峰(V(VA A) ) 水浴加热水浴加热30s30s，迅速冷却，再扫描，迅速冷却，再扫描 348348、367367和和389nm389nm三个尖锐吸收峰三个尖锐吸收峰( (去水去水V VA A) )第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析三、含量测定三、含量测定紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）HPLCHPLC第一节第一节 维生素维生素A A的分析的分析1.1.维生素维生素A A中存在的相关物质和不相关物质中存在的相关物质和不相关物质1 1）衍生物）衍生物维生素维生素A A2 2（去氢维生素（去氢维生素A A） 维生素维生素A A3 3（去水维生素（去水维生素A A） ( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）2 2）异构体）异构体 目前分离得到目前分离得到5 5个异构体个异构体 新维生素新维生素Aa(2-Aa(2-顺型顺型) ) 新维生素新维生素Ab(4-Ab(4-顺型顺型) )( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）新维生素新维生素Ac(2.4-Ac(2.4-顺型顺型) )异维生素异维生素Aa(6-Aa(6-顺型顺型) ) 异维生素异维生素Ab(2.6-Ab(2.6-二顺型二顺型) )( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法） 3 3）氧化产物：环氧化物，醛，酸）氧化产物：环氧化物，醛，酸 4 4）中间体、副产品：）中间体、副产品： 5 5）裂解产物：）裂解产物： 6 6）鲸醇（）鲸醇（KitolKitol）: :二聚体，非生物活性二聚体，非生物活性 7 7）不相关物质：抗氧剂，稀释用油）不相关物质：抗氧剂，稀释用油 在在325325328nm328nm处均有吸收处均有吸收 不相关吸收或背景吸收不相关吸收或背景吸收( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）2 .2 .原理原理1 1）维生素）维生素A A最大吸收波长附近（最大吸收波长附近（310310340nm340nm） 杂质吸收近似一条直线杂质吸收近似一条直线2 2）物质吸收光谱的加和性）物质吸收光谱的加和性 A A总总=A=AVAVA+A+A杂质杂质( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）3.3.三点选择三点选择( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）维生素维生素A A醇醇 1) 1) 三点：三点：325325、310310、334nm334nm 2) 2) 等吸收点：等吸收点：A A310310=A=A334334= = 3 3）校子公式：）校子公式： A A325325（校正）（校正）=6.815A=6.815A325325-2.555A-2.555A310310-4.260A-4.260A334334( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）维生素维生素A A酯酯 1 1）三点：）三点：328328、316316、340nm340nm 2 2）波长等距：）波长等距：12nm12nm 3 3）校正公式：）校正公式： A A328328（校正）（校正）=3.52(2A=3.52(2A328328-A-A316316-A-A340340) )( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）4. 4. 校正公式的应用及含量计算校正公式的应用及含量计算 第一法第一法: :样品样品9 91 15IU/ml5IU/ml环己烷溶液环己烷溶液 max326max326329nm329nm 300 300、316316、328328、340340、360nm360nm （A A1 1、A A2 2、A A3 3、A A4 4、A A5 5) ) 计算吸收度比值计算吸收度比值 (A(A1 1/A/A3 3、A A2 2/A/A3 3、A A3 3/A/A3 3、A A4 4/A/A3 3、A A5 5/A/A3 3) ) 计算比值差计算比值差( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）吸收度比值规定值吸收度比值规定值波长（波长（nm）300316328340360吸收度比值吸收度比值（规定）（规定）0.5550.9071.0000.8110.299max吸收度比吸收度比值范围值范围Amax含量（效价）含量（效价）3263290.02Amax(不须校正不须校正)3263290.023%-3%-15%+3%第二法第二法不在不在326329第二法第二法( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法） 第二法：第二法： a a、maxmax不在不在326326329nm329nm b b、校正与未校正吸收度比较、校正与未校正吸收度比较-15%+3%+3% 样品：样品： 9 915IU/ml15IU/ml( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）max323327nm之间之间300、310、325及及334nmA300/A3250.73，计算，计算A325（校正）（校正）a、校正在未校正吸收度、校正在未校正吸收度土土3%以未校正吸收度计算以未校正吸收度计算b、土土3%，以校正吸收度计算，以校正吸收度计算( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法） maxmax不在不在323323327nm327nm 或或A A300300/A/A3253250.730.73 需进一步纯化需进一步纯化( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）5. 5. 生物效价和换算因子生物效价和换算因子（Biological potency and conversion Biological potency and conversion factor,CFfactor,CF） 1IU=0.344g V1IU=0.344g VA A醋酸酯醋酸酯 1IU=0.300g V1IU=0.300g VA A醇醇 1g V1g VA A醋酸酯醋酸酯:2.907:2.90710106 6IU/gIU/g 1g V 1g VA A醇醇:3.33:3.3310106 6IU/gIU/g( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法） 换算因子：换算因子： 单位百分吸收系数所相当于的效价单位百分吸收系数所相当于的效价 V VA A酯百分吸收系数酯百分吸收系数=1530=1530 V VA A醇百分吸收系数醇百分吸收系数18201820 CF( CF(酯酯)=2.907)=2.90710106 6/1530=1900/1530=1900 CF( CF(醇醇)=3.33)=3.3310106 6/1820=1830/1820=1830( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法） 6.6.注意问题注意问题 仪器波长校准仪器波长校准 半暗室快速进行半暗室快速进行( (一一) )紫外法（三点校正法）紫外法（三点校正法）色谱柱：硅胶为填充剂色谱柱：硅胶为填充剂流动相流动相： 正己烷正己烷- -异丙醇（异丙醇（997997：3 3）检测波长：检测波长：325nm325nm系统适应性试验：维生素系统适应性试验：维生素A A醋酸酯主峰与醋酸酯主峰与 其顺式异构体峰的其顺式异构体峰的R R应大于应大于3.03.0。 进样进样5 5次次RSD3.0%RSD3.0%。( (二二) ) HPLCHPLC第二节第二节维生素维生素B1( Vit B1)Vit B1Thiamine HydrochlorideNaOHH2O环合O2H硫色素Thiochtome结构特点与鉴别结构特点与鉴别噻唑环在碱性介质中可被高铁氰化噻唑环在碱性介质中可被高铁氰化钾等氧化剂氧化，然后与嘧啶环上的钾等氧化剂氧化，然后与嘧啶环上的-NH2缩合生成缩合生成具有荧光的硫色素具有荧光的硫色素，后，后者者易溶于异丁醇中显强烈的蓝色荧光易溶于异丁醇中显强烈的蓝色荧光，该反应又该反应又称为硫色素荧光反应。为维称为硫色素荧光反应。为维生素生素B1所特有。所特有。生成沉淀反应生成沉淀反应分子结构中含有杂环，易与生物碱沉淀剂分子结构中含有杂环，易与生物碱沉淀剂(碘化铋钾、碘化汞钾、苦味酸等碘化铋钾、碘化汞钾、苦味酸等)，硅钨酸，硅钨酸，雷氏盐等作用形成组成恒定的沉淀雷氏盐等作用形成组成恒定的沉淀维生素维生素B1在碱性加热条件下反应放出在碱性加热条件下反应放出H2S,与与Pb(Ac)2试液形成黑色试液形成黑色PbS。含量测定含量测定Assay硅钨酸重量法硅钨酸重量法SilicotungsticAcidGravimetry非水溶液滴定法非水溶液滴定法Non-aqueousTitrimetry硫色素荧光法硫色素荧光法ThiochroneFluoremetry第三节第三节维生素维生素C( Vit C)612345L-抗坏血酸 L-去氢抗坏血酸 L-二酮古罗糖酸有生物活性 有生物活性 无生物活性-2H+2HH2OOH-(H+)50蓝色H2O-3H2O糠醛-CO2戊糖鉴别鉴别利用其还原性利用其还原性 硝酸银（银镜）硝酸银（银镜） 2.6-2.6-二氯靛酚二氯靛酚( (褪色）褪色） 高锰酸钾（褪色）高锰酸钾（褪色） 亚甲蓝（蓝色褪去）亚甲蓝（蓝色褪去） 磷钼酸（钼蓝）磷钼酸（钼蓝） 斐林氏溶液（红色氧化亚铜）斐林氏溶液（红色氧化亚铜） （1 1）与硝酸银反应）与硝酸银反应 本品本品加水溶解加水溶解加硝酸银试液加硝酸银试液 银黑色沉淀（银黑色沉淀（ChPChP、BPBP采用）采用）（2 2）2 2，6 6二氯靛酚反应二氯靛酚反应 本品本品加水溶解加水溶解2,62,6二氯靛酚试液二氯靛酚试液 颜色消失（颜色消失（ChPChP采用）采用）含量测定含量测定碘量法碘量法2,6-二氯靛酚法二氯靛酚法第五节第五节维生素维生素E( Vit E)R1R2Vit E (dl-Tocopheryl Acetate) 鉴别鉴别 1.1.本品本品无水乙醇溶解无水乙醇溶解硝酸，硝酸，7575加热加热 鲜红色，逐渐转为橙红色。鲜红色，逐渐转为橙红色。 2. 2. 本品本品醇制醇制KOHKOH，煮沸，煮沸 游离生育酚游离生育酚 乙醚提取乙醚提取 联吡啶、三氯化铁乙醇液联吡啶、三氯化铁乙醇液 深红色深红色 ChPVE中检查中检查生育酚生育酚 取Vit E 0.1g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺二苯胺T.S.1滴，用硫酸鈰硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸鈰滴定液(0.01mol/L)不得过1.0ml固定液：5% SE30柱 温：25510检测器：FID内 标：十六酸十六醇酯14.54VE24.40内标