RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体活化酶抗体的制备及其在作物中的应用的制备及其在作物中的应用研研 究究 生生: 陈陈 相相 辉辉导导 师师: 王忠教授王忠教授专专 业业: 植植 物物 学学一、研究目的和意义一、研究目的和意义 R R u ub bi is sc co o（1 1 , ,5 5 - -二二磷磷酸酸核核酮酮糖糖羧羧化化酶酶加加氧氧酶酶，r ri ib bu ul lo os se e- -1 1, ,5 5- -b bi is sp ph ho os sp ph ha at te e c ca ar rb bo ox xy yl la as se e/ /o ox xy yg ge en na as se e）是是光光合合碳碳代代谢谢中中的的关关键键酶酶，处处于于光光合合碳碳还还原原和和光光合合碳碳氧氧化化这这两两个个方方向向相相反反但但又又相相互互连连锁锁的的循循环环的的交交叉叉点点上上，调调节节着着光光合合作作用用和和光光呼呼吸吸的的代代谢谢比比例例，其其活活性性大大小小对对光光合合速速率率起起着着决决定定性性作作用用。本本课课题题拟拟以以小小麦麦为为实实验验材材料料，采采用用 E EL LI I S SA A测测试试技技术术，研研究究 R R u ub bi i s sc co o和和R R u ub bi i s sc co o活活化化酶酶的的特特性性，这这些些结结果果将将有有助助于于进进一一步步阐阐明明 R R u ub bi is sc co o 及及R R u ub bi is sc co o活活化化酶酶的的作作用用机机制制，为为最最终终提提高高作作物物的的光光合合产产量量提提供供理理论论依依据据。 二、选题依据二、选题依据 Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的热点问题，如何提高作物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研究仍然是国内外研究中的空白。创新之处创新之处 本实验利用免疫化学技术提供一个快速、本实验利用免疫化学技术提供一个快速、准确而简易的定量测定准确而简易的定量测定RubiscoRubisco和和 RubiscoRubisco活活化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由化酶的方法，从而可以预测光合潜力和估计由于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节于矿质营养、水分供给、光照、植物生长调节素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量素和基因调控发生变化而引起光合作用和产量的变化。进一步对的变化。进一步对RubiscoRubisco和和 RubiscoRubisco活化酶活化酶做深入的研究。做深入的研究。三、研究内容三、研究内容vRubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶的提取和纯化活化酶的提取和纯化vRubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备vRubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶活化酶ELISAELISA标准曲线的制定标准曲线的制定vC3C3、C4C4植物中植物中RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶含量比较及其与活化酶含量比较及其与光合作用的关系光合作用的关系v光暗处理对小麦光合作用及光暗处理对小麦光合作用及RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活化酶的活化酶的影响影响 v施氮处理对小麦光合速率和施氮处理对小麦光合速率和RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活化酶的活化酶的影响影响 vRubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶单克隆抗体制备初探活化酶单克隆抗体制备初探试验设计流程试验设计流程RubiscoRubisco和和 RubiscoRubisco活化酶活化酶的分离提纯的分离提纯RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备抗体的分离与纯化抗体的分离与纯化利用抗体定量测定不同处理下利用抗体定量测定不同处理下Rubisco Rubisco 及及RubiscoRubisco活化酶的含量活化酶的含量 四、四、 材料、仪器和方法材料、仪器和方法1、材料与仪器、材料与仪器 1.1 1.1 材料材料 植物材料植物材料 扬麦扬麦5 5号号 动物材料动物材料 新西兰大白兔新西兰大白兔 1.2 1.2 试剂与仪器试剂与仪器 高速冷冻离心机高速冷冻离心机 液相层析收集系统液相层析收集系统 垂直板电泳系统垂直板电泳系统 Beckman LS-9800Beckman LS-9800液体闪烁仪液体闪烁仪 酶联免疫测定仪酶联免疫测定仪2、酶、酶的的提取和纯化提取和纯化3.1 免疫过程免疫过程:以皮内多位点分数次注射法进行免疫以皮内多位点分数次注射法进行免疫首次免疫首次免疫加强免疫加强免疫二次免疫二次免疫0.5ml抗原抗原+0.5ml佐剂佐剂,皮内注射于皮内注射于兔子背部多个部兔子背部多个部位位三周后，三周后，0.5ml抗抗原原+0.5ml佐剂佐剂,皮皮下注射于兔子背下注射于兔子背部多个部位部多个部位三周后，静脉注三周后，静脉注射射0.5ml抗原抗原检测效价检测效价一周后，耳缘静一周后，耳缘静脉采血，检测抗脉采血，检测抗体效价体效价3、 Rubisco及及Rubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备3.2 采血采血 用心脏取血的方法采血用心脏取血的方法采血 3.3 分离血清分离血清 44下离心下离心30min30min，除去红细胞，获得血清；或者除去红细胞，获得血清；或者将血液收聚在培养皿中，将血液收聚在培养皿中，3737放置放置6h6h，用吸管吸取析用吸管吸取析出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下出的血清。将血清分装于灭菌瓶，储存于零下2020，或加或加0.1%NaN30.1%NaN3或或0.01%0.01%硫柳汞后，储存于硫柳汞后，储存于44冰箱中。冰箱中。4、 ELISA法测定酶含量法测定酶含量vRubisco和和Rubisco活化酶的定量测定活化酶的定量测定 用一系列已知浓度的标准抗原用一系列已知浓度的标准抗原（ RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶）与活化酶）与制备的制备的RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶的活化酶的抗体反应，制成一条标准曲线，再抗体反应，制成一条标准曲线，再将待测样品与之相比较，求得样品将待测样品与之相比较，求得样品中抗原的含量中抗原的含量RubiscoRubisco含含量量（mggmgg-1-1FWFW）=提提取取液液（mLmL）+ +鲜鲜叶叶重重（g g）稀稀释释倍倍数数 由标准曲线计算的由标准曲线计算的RubiscoRubisco浓度浓度/ /叶片鲜重叶片鲜重5 5、 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定依依FolinFolin- -酚试剂法（薛应龙，酚试剂法（薛应龙，19851985）测定，以）测定，以BSABSA作标准曲线作标准曲线6 6、光合速率和叶绿素含量的测定、光合速率和叶绿素含量的测定光合速率用便携式光合速率测定仪测定光合速率用便携式光合速率测定仪测定叶绿素含量用分光光度计测定叶绿素含量用分光光度计测定五、实验进展五、实验进展1 1 、 RubiscoRubisco的提纯和纯度鉴定的提纯和纯度鉴定 Rubisco的电泳图谱A为Rubisco的ND-PAGE图谱 B为Rubisco的SDS-PAGE图谱55 00014 8002 2、 小麦小麦RubiscoRubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定活化酶的的提纯和纯度鉴定Rubisco活化酶的SDS-PAGE图谱A为Rubisco活化酶;B为标准蛋白45 00041 000六、研究计划六、研究计划1 1、RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶抗体的制备活化酶抗体的制备2 2、RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶活化酶ELISAELISA标准曲线的制定标准曲线的制定3 3、C3C3、C4C4植物中植物中RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶含量比较及其活化酶含量比较及其与光合作用的关系与光合作用的关系4 4、光暗处理对小麦光合作用及、光暗处理对小麦光合作用及RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活化酶活化酶的影响的影响 5 5、不同施氮水平对小麦光合速率和、不同施氮水平对小麦光合速率和RubiscoRubisco、RubiscoRubisco活活化酶的影响化酶的影响 6 6、 RubiscoRubisco和和RubiscoRubisco活化酶单克隆抗体制备初探活化酶单克隆抗体制备初探谢谢！谢谢！