细菌鉴定之生化反应南医大三附院检验科 江培涛1常用试验n碳水化合物的代谢试验n蛋白质和氨基酸的代谢试验n碳源和氮源利用试验n各种酶类试验n抑菌试验2一 碳水化合物的代谢试验n1 糖（醇、苷）类发酵试验原理：细菌含有发酵糖（醇、苷）的酶分解糖类产酸、产气、或仅产酸 培养基：含有0.5%1%的糖（醇、苷）的液体、半固体、固体、或 微量生化管方法： 纯菌种接种培养基，要求的温度，数小时至两周，微量管注意保持湿润，以免干燥结果：能分解糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应 若能产气时，培养基可出现开裂气泡等现象意义：肠杆菌科尤为重要32 氧化-发酵试验（O/F）n原理：细菌分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；可以进行无氧降解的，称为发酵型；不分解葡萄糖的称为产碱型n培养基：HL二氏培养基n方法；待测菌同时接种两只HL培养基，其中一只滴加无菌的液体石蜡，高度不少于1cm，35培养48h或更长n结果：两只均无变化为产碱型；两只均产酸为发酵型；仅不加石蜡的产酸为氧化型n意义：肠杆菌科与非发酵菌的鉴别；葡萄球菌与微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型43 ONPG（半乳糖苷酶试验）n原理：有的细菌可以产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚- 半乳糖苷生成黄色的邻-硝基酚n方法：从KIA上取菌，于0.25ML无菌生理盐水中制菌悬液，加甲苯一滴，使酶释放。37 水浴5min,加0.25mlONPG试剂，水浴20min-3h观察结果n结果：呈现黄色为阳性，一般20-30min内显色n意义：迅速及迟缓发酵乳糖的细菌为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定n注意：该试验不一定与分解乳糖相一致，决定于细菌产生的酶及其活性54七叶苷水解试验n原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物，使培养基呈黑色n方法：将待测菌接种于七叶苷培养基，培养后观察结果n结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性n意义：D群链球菌与其他链球菌的区别，前者为阳性；肺炎克雷伯、阴沟肠杆菌多阳性65V-P试验n原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。奈酚可加速此反应n培养基：葡萄糖蛋白胨水n方法：待测菌接种于培养基，35 48h，加入甲液（6%奈酚酒精溶液）和乙液（40 %KOH溶液）n结果：20min内出现红色为阳性，如无红色，且于35 4h 后仍如故即为阴性n意义：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后者多阴性76甲基红试验n原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的PH降至4.5以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的PH仍在6.2以上，加入甲基红试剂后显黄色，为阴性n培养基：葡萄糖蛋白胨水n方法：待测菌接种于培养基，2-4天后，加入甲基红试剂，观察结果n结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性n意义：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性87 葡萄糖酸盐试验n原理：某些细菌能氧化葡萄糖酸盐作为唯一碳源，生成2-酮基葡萄糖酸盐。加入班氏试剂，于沸水煮沸10分钟，出现砖红色沉淀，表明有葡萄糖酸盐的存在n培养基：2-酮基葡萄糖酸盐肉汤n方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24h，于其中加入0.3ml浓缩班氏试剂，然后沸水中煮沸10分钟，出现砖红色沉淀表明有葡萄糖酸盐的存在n意义：用于肠杆菌科分类9二 蛋白质和氨基酸的代谢试验1 明胶液化试验原理：细菌产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体变为液体方法：待测菌接种于明胶培养基，22 培养7天。若用35 孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察前先置4 冰箱30min再观察结果：培养基呈液化状态为阳性意义：多数假单胞菌能液化明胶，肠杆菌科细菌如：沙雷菌、变形杆菌、 阴沟杆菌等可液化明胶102 吲哚（叮基质）试验 n原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚n培养基：蛋白胨水n方法：待测菌接种于培养基，35 培养24-48小时，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂n结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性n意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性n试剂：柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）与欧氏试剂的区别：前者含戊醇，后者含酒精，都含浓盐酸，前者主要成分为后者10倍，后者灵敏度更高113硫化氢试验n原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。n培养基：醋酸铅培养基n方法：待测菌接种于醋酸铅培养基，35 培养24-48小时观察结果n结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性n意义：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性124 尿素分解试验n原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性n培养基：尿素培养基n方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时观察结果n结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性n意义：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷伯氏为阳性135 苯丙氨酸脱氨酶（TDA）试验n原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应n培养基：苯丙氨酸琼脂培养基n方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时，加10%三氯化铁试剂3-4滴，观察结果n结果：肠杆菌科变形杆菌、普罗维登氏菌、摩根氏菌阳性146 氨基酸脱羧酶试验n原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显色n培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基n方法：待测菌接种于培养基，并加入无菌液体石蜡，35 培养18-24小时观察结果n结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色，（指示剂为溴甲酚紫）测定管呈黄色为阴性；若对照管呈紫色则试验无意义n意义：肠杆菌科细菌的鉴定15三 碳源和氮源利用试验1枸橼酸盐利用试验2原理：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱3培养基：枸橼酸盐培养基4方法：待测菌接种于培养基35 培养18-24小时，观察结果5结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性6意义：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性162丙二酸盐利用试验n原理：有的细菌可利用丙二酸盐为唯一碳源，将其分解生成碳酸钠，使培养基变碱n培养基：丙二酸盐培养基n方法：待测菌接种于培养基35 培养18-24小时，观察结果n结果：培养基由淡绿变为深蓝为阳性，无变化则为阴性n意义：肠杆菌科属间鉴别17四 各种酶类试验n1 氧化酶试验原理：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺方法：菌落法、滤纸法、试剂纸片法。前二者浪费试剂，后者节省结果：10秒内呈深紫红色为阳性应用：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别，前者阴性，后者多阳性奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性182 触酶试验n原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡n试剂：3%过氧化氢溶液n方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3%过氧化氢数滴，观察结果n结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性n意义：用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄球菌和微球菌为阳性，链球菌和肠球菌为阴性，肠球菌多假阳性193硝酸盐还原试验n原理：硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，氨再转化为氨基酸和其他含氮化合物；硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸系统中的终末受氢体。有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐，有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵，有的能使其还原为氮n培养基：硝酸盐培养基n试剂：甲（对氨基苯磺酸），乙（奈胺）n方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时，将甲乙液分别加入培养基，立即观察结果n结果：出现红色为阳性n注意：若加入试剂后无反应，可能是硝酸盐没有被还原，试验阴性硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性n意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气；链球菌肠球菌阴性，葡萄球菌阳性204 DNA酶试验原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解，后者可被酸沉淀，长链DNA水解后形成的寡核苷酸链则溶于酸，所以在平板上加入酸后会在菌落周围形成透明环培养基：0.2%DNA琼脂平板方法：点种被测菌于上述平板， 35 培养18-24小时；用1mol/L盐酸覆盖平板，观察结果结果：菌落周围出现透明环为阳性意义：金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、变形杆菌阳性215凝固酶试验n原理：致病性葡萄球菌；结合凝固酶、游离凝固酶；纤维蛋白原变为纤维蛋白使血浆凝固n方法：1 玻片法检测结合凝固酶 兔血浆 2试管法检测游离凝固酶 0.5ml兔血浆37 水浴3-4结果：玻片法中有明显颗粒样凝集而盐水对照无凝集为阳性 试管法以血浆凝固为阳性意义：致病性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌多阳性226 CAMP试验n原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的溶血毒素的活性，在两菌的交界处溶血力加强，出现矢形溶血区n培养基；BAPn方法：先以产溶血毒素的金葡菌划一横线接种于BAP，再将被测菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，0.5-1cm，37 培养18-24小时观察结果，设阴阳性对照n结果：在两划线交界处出现箭头样溶血区为阳性n意义：B群链球菌阳性，马红球菌出现反CAMP现象237胆汁溶菌酶试验n原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，使细菌发生自溶n试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁n方法： 平板法：滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35 30min观察结果 试管法：0.9ml被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1ml后置35 水浴10-30min观察结果结果：菌落消失，或培养物变透明为阳性意义：肺炎链球菌阳性248 脂酶、卵磷脂酶、硷性磷酸酶n主要用于厌氧菌的鉴定n产气夹膜梭菌卵磷脂酶阳性n中间类杆菌脂酶阳性n致病性葡萄球菌硷性磷酸酶阳性，如金葡等2526五 抑菌试验n1 O/129试验n原理： O/129（二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用n培养基；碱性琼脂培养基n方法：纸片法药敏 40ug/片n结果：有抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药n意义：弧菌、邻单胞菌敏感；气单胞菌属耐药272杆菌肽试验n原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而其他链球菌则耐药n培养基：BAPn方法：同纸片法药敏0.04U/片n结果：10mm敏感；10mm耐药n意义：A群链球菌敏感283 奥普托欣Optochin试验n原理：肺炎链球菌对Optochin敏感，其他链球菌无抑制作用n培养基：BAPn方法：同纸片法药敏 5ug/片n结果：抑菌环直径14mm敏感；14mm耐药此时加做胆汁溶菌试验证实n意义：肺炎链球菌对Optochin敏感294 新生霉素敏感试验n原理：表皮葡萄球菌对新生霉素敏感；腐生葡萄球菌对新生霉素耐药n培养基：MH琼脂n方法：同纸片法药敏 5ug/片n结果：抑菌环直径16mm敏感；16mm耐药n意义：区别表皮葡萄球菌与腐生葡萄球菌30氢氧化钾拉丝试验 n(1)原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。n(2)方法：取1滴40g/L氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与氢氧化钾水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝。n(3)结果：用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴性。n(4)应用：主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于510s内出现阳性反应，有的则需3045s，假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10s内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60s内出现阳性，而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。 31THANK YOU BYE BYE！32