变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳PCRDGGEnewPCRDGGEnew 变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。DGGE制胶主体部件：上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。上样时上样器要深入胶孔底部。尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有marker lane。将胶放入电泳槽中时注意正负极。建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。染色前做好胶样品顺序的标记。银染、EB染色和SYBRGreen染色。 垂直电泳获得高质量的获得高质量的DGGEDGGE图谱。图谱。DGGEDGGE条带的回收条带的回收注意紫外条件下操作的安全。尽量减少DNA在紫外下的照射时间。不同长度目标片段从切胶条带中的回收。测序注意要点测序注意要点回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序每个条带至少测3个克隆DGGEDGGE图谱的聚类分析、相似性分析图谱的聚类分析、相似性分析用Quantity One（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（Shannon-Wiener index） 其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度（height of the peak）占该泳道总灰度的比例。菌群均匀度（evenness，E）：E=H/Hmax，Hmax=ln S Quantity one的应用的应用问题和讨论问题和讨论结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！23