洁净区的环境监控2011年12月29目录总则洁净区级别划分污染来源监控项目悬浮粒子检测沉降菌检测浮游菌检测表面微生物检测总则1. 对洁净区环境进行监控的目的 GMP中规定原料药、制剂以及部分医疗器具必须在特定环境下生产，特别是无菌药品均采用无菌生产工艺，为维护药品生产用洁净区环境的稳定性、确保药品质量安全，对洁净区环境质量采取合理的控制措施和评价非常重要。 环境监测是用来评估生产环境控制是否有效的一个工具。为了使洁净区的环境质量能得到有效控制并被客观评价，应对他进行全面监控。洁净区级别划分无菌药品生产所需的洁净区可分为个级别: l A级：高风险操作区，应当用单向流操作台维持该区的环境状态。并有数据证明单向流的状态并经过验证。l B级：指无菌配置和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。l C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。 污染来源1 空气 药品生产必然接触空气无论是房间空气还是层流空气都是污染的主要来源。 2010版GMP无菌药品附录中规定应对洁净区的悬浮粒子和微生物进行动态监测。2 接触表面 在生产时，设备表面会直接接触产品，同时墙面、底板虽然不直接接触产品表面，也可能通过空气污染产品。因此，应该检测所有的区域，而不只限于设备表面。3 人 人是洁净区环境的最大污染源，人员的数量和活动量直接会影响到整个洁净区的环境质量。人身上有大量的微生物，包括需氧菌和厌氧菌。因此生产人员特别要注意人员卫生。监控项目1 空气悬浮粒子2 空气浮游菌3 空气沉降菌4 表面微生物监控项目洁净区的各项限度具体如下表悬浮离子的检测1空气中的悬浮粒子 微生物不是凭空存在的，99%的微生物都附在颗粒上。控制空气中的微粒数，就是控制了微生物数量。 目前，由于测定空气中的悬浮粒子的仪器是光散射离子计算器和激光粒子计数器。 为了掌握整个生产过程中的空气悬浮粒子状况,通常将检测活动安排在操作开始前、操作进行中及操作结束后三个阶段进行。最好在A级区内采用适当的系统对空气悬浮粒子进行连续性检测。 监测中的注意事项如下： 1严格按照仪器生产商要求操作和使用 2 事先确认洁净区通风系统运行平稳后，方可进行取样。 3 检测单向流时，将计数器取样口正对着气流方向；检测紊乱流时，亦将取样口垂直朝上。 4在单向流系统中，应采用等动力学的取样头。 5再确认级别时，应使用采样管较短（一般在1m以内）的便携式尘的操作埃粒子计数器，以避免在远程采样系统长的采样管中5.0m尘埃的沉降。 6取样时，每次取样量不得少于2.83L（为了确定A级区的级别，每个采样点的采样量不得少于1m）。 7监测系统的选择还应考虑生产操作的物料（例如有活的生物体或放射性药品的操作）带来的风险。测试时的要求测试规则 1洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（温度控制在1826，相对湿度控制在45%65%之间为宜）。 2压差：空气洁净度不同的洁净室（洁净区）之间的压差应5 Pa ，空气洁净度级别要求高的洁净室（洁净区）对相邻的空气洁净度级别低的洁净室（洁净区）一般呈相对正压。测试状态测试状态分为静态测试和动态测试静态测试时，室内测试人员不得多于2人。动态测试指洁净室已处于正常状态下的测试。测试时间测试应在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始。测试时的要求采样点的位置采样点一般在离地面0.8m高度的水平面上均匀布置。 采样点多于5点时，也可以在离地面0.8m1.5m高度的区域内分层布置，但每层不少于5点。采样点的布置还可根据需要在生产及工艺关键操作区增加采样点。采样点数目 对任何小洁净室或局部空气净化区域，采样点的数目不得少于2个，总采样次数不得少于5次。每个采样点的采样次数可以多于1次，且不同采样点的采样次数可以不同。 不同洁净度级别每次最小的采样量见表。 洁净度级别采样量，L/次0.5m5m1005.66-100002.838.51000002.838.53000002.838.5空气微生物的检测沉降菌的检测 在制药生产企业，生物公司或医疗器械企业中，虽然离子取样可以用来陪嫁空气的质量，但是微生物的污染是生产环境最重要的因素，它与最终的产品微生物污染水平控制有关。虽然在所有生产的最终产品都要求控制微生物污染（包括那些最最灭菌的产品），但这对无菌生产过程显得尤为重要。（一）沉降菌的检测 通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判断洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。 1 将培养基加热熔化，冷至45时，自无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15mL。 2 待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于3035恒温培养箱中培养48h，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养基平皿宜在28的环境中存放。 3 将已制备好的培养皿，按洁净室沉降菌采样点布置图的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露30分钟，再将培养皿盖盖上后倒置。 4 作全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在3035培养箱中培养，时间不少于48h。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。 5 菌落计数 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点记，然后用510倍放大镜检查，是否遗漏。 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。 空气微生物的检测沉降菌的检测测试规则 1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速控制在规定值内。 2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。 3 测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。测试人员 1 测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。2 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。测试时间 1 对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统运行不少于10min后开始。 2 对非单向流，如10000级，100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。 为被动取样的沉降跌（平皿径一般为90mm），用于环境中沉降菌的检测。沉降碟以其廉价、轻便、对空气环境破坏较小等优点而被广泛用于洁净区的环境监测。不足之处在于它只能作为定性测试，所获得数据的准确性较差。但在层流区，沉降碟不会干扰气流方向，不视为一种比较好的方法。为了尽可能的获得可靠性数据，沉降碟的放置时间不宜过短，至少半个小时，不大于4小时。因对沉降碟的暴露时间进行确认，以保证暴露的培养及不会因失水而影响微生物生长。空气微生物的检测浮游菌的检测 浮游菌是指通过一定方法收集悬浮在空气中的活微生物离子，通过专门的培养架，在适宜的生长条件下繁殖可见的菌落数。 测试浮游菌的方法为计数浓度法。即通过收集悬浮在空气中的生物性粒子与专门的的培养基（选择能证明其能够支持微生物生长的培养基），经过若干时间和适宜的生长条件让其繁殖到可见的菌落计数，以判定该洁净室的微生物浓度。测试要点1必须按照测试仪器的检定周期，定期对仪器做检定。使用校检合格，且在使用有效期内的仪器。2测试仪器在未进入被测区域时，若必需，则先清洁表面，或在相应的洁净室内准备和存放（用保护罩或其它适当地外罩保护仪器）。3在100级洁净室内用纸时，上面应蒙上一张透明不沾尘的覆盖物，在100级洁净室内不能用铅笔和橡皮。4使用测试仪器时应严格按照仪器说明书操作。空气微生物的检测浮游菌的检测测试步骤1测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂消毒，用于100级洁净室的采样器宜预先放在被测房间内。用消毒机擦净培养皿的外表面。采样口和采样管使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放上或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒或戴无菌手套操作。2采样器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min。关闭采样器，放入培养皿，盖上盖子。置采样口与采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。3全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。每批培养基应有对照试验，校验培养本身是否污染，可每批选定3只培养皿作对照培养。4用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用510倍放大镜检查，有否遗漏。若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。空气微生物的检测浮游菌的检测测试条件 在测试之前，要对洁净区相关参数进行预先测试，这类测试将会提供测试悬浮粒子环境条件，例如：这种预先测试或可包括： 温度和相对湿度的测试。洁净区的温度和辖区能够对湿度与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时温度在1826，相对湿度在45%-65%为宜），同时应满足测试仪器的适用范围； 室内送风量或风速的测试，或压差的测试； 高效过滤器的泄漏测试。测试状态 静态和动态两种状态均可进行测试；静态测试时，室内测试人员不得多于2人；浮游菌测试前，被测洁净室有用户决定是否需要预先消毒；测试报告中应标明测试时所采用的状态和室内测试人员数。测试时间 1静态测试或空态测试时，在单向流洁净区时测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后开始。对于非单向流洁净区宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始。 2在动态测试时，则须记录生产开始时间已测试时间。表面微生物检测除了用空气微生物取样来检测生产环境的微生物污染水平外，表面检测也可以检测到生产区域表面以及设备与产品接触面的微生物量。检测的方法必须考虑取样的准确性和代表性。基本的检测方法包括触碟法、查实法以及表面冲洗法。每种提供的数据都可以用于产品质量的评价。测试方法可以定性和定量。而且取样的准确性受收集和处理样品的过程影响，因此必须对取样进行培训和测试。 （1）接触碟法 接触碟容易操作而却可以定量。因此被广泛使用，使用于对平整的规则型表面进行取样监测，不适用于不规则表面。培养基充满培养皿，取样面积为25cm取样时，确保全部琼脂培养基表面与取样点表面充分接触。取样后，需用蘸有70%乙醇的纱布擦拭取样表面，以除去残留琼脂。将取样后并做好记号的接触碟置于培养箱中培养，读书，记录。 （2）擦拭法 该方法通常用于对不规则表面（设备表面）进行取样。 把无菌棉签在0.9氯化钠或蛋白无菌溶液中浸一下，在无菌条件下用棉签擦拭待验物表面，然后打开培养皿盖用棉签在培养基表面擦拭，取样面积一般约为25cm2。立即盖上培养皿盖进行培养。擦拭检物的棉签放入预先准备好的塑料袋中，统一处理。表面微生物检测位点选择表面微生物检测表面微生物检测位点选择表1 监测位点选择系统位点设施表面地面、门把手、墙面设备表面分装管道、控制面板灌装线操作工手指印培养：3035培养72小时。评价：以计算单位面积的菌落数。警戒指标：洁净级别表面微生物接触（f55mm）cfu/碟5指手套cfu/手套A级11B级（作为A级背景）55 B级（不作为A级背景）25 -C级 25 -4.7 应采取措施的指标：当连续三次以上取样结果超过警戒指标或有一个单独样品菌落数很高或样品中发现典型的或可能是致病菌时，应着手采取措施。