结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（TB）分子生物学检测）分子生物学检测结核分枝杆菌结核分枝杆菌 结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)， 俗称结核杆菌，是引起结核病俗称结核杆菌，是引起结核病的的病原菌病原菌。可侵犯全身各器官，但。可侵犯全身各器官，但以以肺结核肺结核为最多见。为最多见。 结核病至今仍为重要的传染病。结核病至今仍为重要的传染病。估计估计世界人口世界人口中中1/3感染结核分枝杆感染结核分枝杆菌。据菌。据WHO报道，每年约有报道，每年约有800万万新病例发生，至少有新病例发生，至少有300万人死于万人死于该病。该病。 我国建国前死亡率达我国建国前死亡率达200-300人人/10万，居各种疾病死亡原因之首，万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因世界上有些地区因艾滋病艾滋病、吸毒、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。原因，发病率又有上升趋势。TB形态形态全球感染情况全球感染情况实验诊断检测方法实验诊断检测方法l常规检测方法l分子生物学检测方法常规检测方法常规检测方法一个月二个月三个月分子生物学检测（分子生物学检测（PCR）方法）方法 回顾回顾RNA与与DNARNA Vs DNAlRNA-核糖核酸只存在於活细胞非常脆弱，环境中存在水解酶（RNase）单链结构lDNA-脱氧核糖核酸非常稳定，在死亡生物内也可存在双链结构结核菌快速测定结核菌快速测定Genprob Leader-50i方法方法l方法名称：方法名称： HPV（Hybridization Protection Assay）-杂交保护分 析法为Gen-probe公司专利l检测设备：检测设备： LEADER 50i 不同方法结核菌检测报告时间l罗氏（罗氏（LJ）培养）培养: 2-8 周周lHPA-MTD: 2.5h 报告报告 直接从标本中检测结核菌lHPA-Accuprobe: 1h 报告报告 用菌落或自动培养系统的菌液HPA-MTD方法检测方法检测TB优势（一）靶分子选取优势（一）靶分子选取核糖体RNA- RIBOSOMAL RNA rRNA作为靶分子好处： 生物扩增提高灵敏度 靶位独特的核酸次序保证检测特异性靶分子靶分子 : : rRNArRNA优势（二）敏优势（二）敏 感感 度度 10 000 套套r-RNACA TA TA TG CG CATTAA TC GTAG CG CG CA TA TG CTAC GTADNARNA RNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶(eg : E.coli)(eg : E.coli)样样 本本 前前 处处 理理样本样本细胞溶解细胞溶解目标目标 r-RNA释放释放杂杂 交交AE60C60C杂交体杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAE探针探针1515分钟分钟分钟分钟选选 择择60C60C选择性试剂选择性试剂选择性试剂选择性试剂AEAEAEAEAEAEAEAEATA TRAINING / TP / Nov 9719PMTPhoto multiplicator注射 1注射 2CPU微机处理器显示打印机键盘化学发光读数仪化学发光读数仪化学发光读数仪化学发光读数仪 / / 原理原理原理原理结果测定结果测定MTD结核分枝杆菌的直接检测意义结核分枝杆菌的直接检测意义lTB与其他分枝杆菌区分 AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染 龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）lTB耐药基因 发现并监测耐药菌株，为医生提供有效治疗TB复燃方案l提高TB检出率 CSF、胸腹水等l疑似患者 长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、 痰TB菌PCR Gen-Probe结核分枝杆菌检测分析仪特点结核分枝杆菌检测分析仪特点l采用分子技术快速鉴定（2.5小时小时）结核分枝杆菌复合群；l标本可以是涂片阴性或者阳性涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物。l唯一获得FDA推荐推荐的凃阴样本快速检测技术l检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）l采用TMA恒温扩增恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证lHPA杂交保护分析技术：灵敏、特异l严格的实验室防污染技术实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染。 GenoType MTBDRplus 结核菌药敏试验结核菌药敏试验采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟肼(katG和inhA)等结核治疗药物的耐药基因来判断TB体内耐药性基本原理基本原理 异烟肼：katG和inhA基因lkatG基因：编码触酶-过氧化物酶 40-100%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药linhA基因：编码NADH烯酰基ACP还原酶 25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药GenoType MTBDRplus检测举例检测举例分枝杆菌复合群中的耐药基因分枝杆菌复合群中的耐药基因lDNA提取lPCR扩增l探针杂交l结果判断检测过程检测过程DNA提取l标本1.固体或液体培养基培养的菌种2.抗酸染色涂片阳性标本l方法1.超声波裂解：2.GenoLyse试剂盒：PCR扩增 不同标本,扩增参数不同l培养菌种：扩增20个循环l涂阳标本：扩增30个循环扩增产物：扩增过程标记生物素(Bio-11-dUTP、Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP ?)采用反向杂交方法PCR扩增产物变性（DNA成单链）与探针杂交洗涤显色判断结果杂 交 杂交试剂TwinCubatorTwinCubator （可做（可做1212个条）个条）杂交仪（手工,12条）GT-Blot 20 杂交仪（自动,20条）GT-Blot 48杂交仪（自动杂交仪（自动,48条）条） l野生型：有杂交带显色为“+”，表示未发生突变l耐药突变位点：有杂交带显色为“+”，表示发生突变结果判断l敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“”l耐药：对应药物有1条野生型探针“”或有1条耐药位点“+”结果解释结果解释MTD试验与其它试验方法性能比较试验与其它试验方法性能比较涂涂阳（阳（+）患者的结果比较患者的结果比较检 测 敏感性 特异性 阳性预测值（PPV） 阴性预测值（NPV） 患者数MTD 96.9% (31/32) 100% (7/7) 100% (31/31) 87.5% (7/8) 39 83.8%-99.9% 59.0%-100% 88.8%-100% 47.3%-99.7%BACTEC 96.9% (31/32 ) 100% (7/7) 100% (31/31) 87.5% (7/8) 39 83.8%-99.9% 59.0%-100% 88.8%-100% 47.3%-99.7%L J 87.5% (28/32) 100% (7/7) 100% (28/28) 63.6% (7/11) 39 71.0%-96.5% 59.0%-100% 87.7%-100% 30.8%-89.1%7H10/ 96.7% (29/30) 100% (7/7) 100% (29/29) 87.5% (7/8) 377H11 82.8%-99.9% 59.0%-100% 88.1%-100% 47.3%-99.7%MTD试验与其它试验方法性能比较试验与其它试验方法性能比较涂涂阴（阴（）患者的结果比较患者的结果比较检 测 敏感性 特异性 阳性预测值（PPV） 阴性预测值（NPV） 患者数MTD 72% (18/25) 99.3%(141/142) 94.7% (18/19) 95.3%(141/148) 167 50.6%-87.9% 96.1%-100% 74.0%-99.9% 90.5%-98.1%BACTEC 68.0% (17/25) 100% (142/142) 100% (17/17) 94.7%(142/150) 167 46.5%-85.1% 97.4%-100% 80.5%-100% 89.8%-97.7%L J 72.0% (18/25) 100% (135/135) 100% (18/18) 95.1%(135/142) 160 50.6%-87.9% 97.3%-100% 81.5%-100% 90.1%-98.0%7H10/ 60.0% (15/25) 100%(142/142 ) 100% (15/15) 93.4% (142/152) 167 7H11 38.7%-78.9% 97.4%-100% 78.2%-100% 88.2%-96.8%lWHO、盖茨基金会、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在推荐使用的快速线性探针技术，可以在6小时内给出药敏鉴定结果；小时内给出药敏鉴定结果；l可以做一线一线结核药物（异烟肼 利福平）、二线二线结核药物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）；l标本是涂片阳性的痰标本痰标本，或者是培养物培养物；l技术步骤简单步骤简单：核酸提取、PCR扩增、核酸杂交仪检测；l核酸杂交仪有三款三款可选择：手工型（12个样本）、GTBlot 20（20个样本）和GTBlot 48 （48个样本）；l每个试剂条上自带质控自带质控：CC杂交质控、AC扩增质控、TUB结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度； HAIN-结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点Genprobe&Hain产品市场段产品市场段l结核病专科医院(胸科、结核病医院、结核病防治中心)l三级及以上综合性医院l监狱管理局医院l肿瘤专科医院l精神病医院l戒毒所lCDC、CIQ、畜牧业 结核分子诊断技术VIP 用户l北京医院l北京朝阳医院l西安西京医院l香港玛丽医院l四川华西医院l内蒙古自治区第四医院l新疆自治区传染病医院l国家 CDC 结核病预防控制中心l黑龙江省疾病预防控制中心l北京市结核病控制研究所l天津市疾病预防控制中心l上海市疾病预防控制中心l浙江省疾病预防控制中心l香港公共卫生检测中心l台湾卫生署疾病管制局引进理由引进理由l临床需求: 灵敏+准确+快速l政府决心: 财力、物力、人力等方面的大力支持政府的管理决心一、卫生部办公厅卫生部办公厅组织开展组织开展2011年世界防治结核病日系列宣传活动的通年世界防治结核病日系列宣传活动的通知知（卫办疾控函（卫办疾控函201173号）号）2011年3月24日是第16个”世界防治结核病日”,我国的宣传主题是”遏制结核,共享健康”二、中国疾病预防控制中心印发中国疾病预防控制中心印发2011年全国结核病防治工作要点通知年全国结核病防治工作要点通知（中疾控结发（中疾控结发2011 105号）号）通知要求各防治单位认真落实“十二五”规划，规范结核病防治工作。通知要求各防治单位按照全球基金结核病项目，把耐多药结核病防治工作扩展于26个诊点，在公立医院改革试点地区，将耐多药肺结核作为门诊大病纳入新农和医保范畴