第二章第二章蛋白质化学蛋白质化学ChapterTwoProteinChemistry第一节第一节通论通论一一蛋白质概念及生物学意义蛋白质概念及生物学意义19世纪中期，荷兰化学家世纪中期，荷兰化学家Mulder提出，提出，Protein来自希腊文来自希腊文Protos，翻译成中文：，翻译成中文：首要的，第一位的，重要的。首要的，第一位的，重要的。In=物质，东西，物质，东西，剂。剂。1结构物质结构物质2功能物质功能物质恩格斯：蛋白质是生命的体现者，没有蛋白就恩格斯：蛋白质是生命的体现者，没有蛋白就没有生命。没有生命。蛋白质主要功能：蛋白质主要功能：催化功能催化功能(酶酶)调节功能调节功能运动功运动功能能运输和跨膜转运功能运输和跨膜转运功能保护和防御保护和防御功能功能信息传递与识别功能信息传递与识别功能贮存功能贮存功能结构功能结构功能二二蛋白质分类蛋白质分类1根据分子形态根据分子形态 （1）球状蛋白）球状蛋白（2）纤维状蛋白）纤维状蛋白 2 2 根据功能分类根据功能分类 六大类：六大类： 催化蛋白类（酶）催化蛋白类（酶） 结构蛋白类结构蛋白类 转运蛋白类转运蛋白类 调节蛋白类调节蛋白类 信号传递蛋白类信号传递蛋白类 动力蛋白类动力蛋白类3 3 根据组成分类根据组成分类 简单蛋白质简单蛋白质 分子中只有氨基酸分子中只有氨基酸结合蛋白质结合蛋白质 简单蛋白简单蛋白+ +非蛋白成分，非蛋白成分， 也称复合蛋白质（也称复合蛋白质（conjugated proteinconjugated protein）或全蛋白质）或全蛋白质（holoproteinholoprotein） 结合蛋白根据结合的非蛋白成分进一步分为：结合蛋白根据结合的非蛋白成分进一步分为： 色蛋白（色蛋白（chromoproteinchromoprotein）色素）色素+Pr+Pr 血红素蛋白；细胞色素类（蛋白）；叶绿素蛋白；血蓝蛋白；黄血红素蛋白；细胞色素类（蛋白）；叶绿素蛋白；血蓝蛋白；黄素蛋白素蛋白金属蛋白（金属蛋白（metalloprotein）金属离子）金属离子+Pr磷蛋白（磷蛋白（phosphoprotein）含磷酸基含磷酸基+Pr核蛋白（核蛋白（nucleoprotein）核酸核酸+Pr脂蛋白脂蛋白（lipoprotein）脂类脂类+Pr细胞脂蛋白和血浆脂蛋白细胞脂蛋白和血浆脂蛋白糖蛋白（糖蛋白（glycoprotein）糖类）糖类+Pr4根据溶解度分类根据溶解度分类有些书上认定为简单蛋白。有些书上认定为简单蛋白。清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白醇溶蛋白和硬蛋白5根据营养价值分类根据营养价值分类完全蛋白；不完全蛋白完全蛋白；不完全蛋白蛋白质互补作用蛋白质互补作用三三蛋白质元素组成蛋白质元素组成C(52%);O(23%);N(16%);H(7%)蛋白质系数蛋白质系数=6.25（凯氏定氮法）（凯氏定氮法）三聚氰胺（三聚氰胺（Melamine）分子式为分子式为C3H6N6 ，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。环有机化工原料。涂料：用丁醇、甲醇醚化后，作为高级热固性涂料、固体粉末涂料的涂料：用丁醇、甲醇醚化后，作为高级热固性涂料、固体粉末涂料的胶联剂、可制作金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆。胶联剂、可制作金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆。 第二节第二节蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位-氨基酸氨基酸发现：发现：法国化学家法国化学家HBraconnot纤维素酸热解纤维素酸热解-葡萄糖（单体）葡萄糖（单体）明胶酸热解明胶酸热解-含氮化合物（甘氨酸）含氮化合物（甘氨酸）肌肉酸水解肌肉酸水解-含氮化合物（含氨基和羧基）含氮化合物（含氨基和羧基）-氨基酸氨基酸蛋白质的基本组成单位是（蛋白质的基本组成单位是（*）氨基酸（）氨基酸（aminoacid，AA）一一氨基酸的一般结构特征氨基酸的一般结构特征氨基酸的基本结构特征：氨基酸的基本结构特征：酸性：酸性：碱性：碱性：手性（旋光性）：手性（旋光性）：特异性特异性蛋白质是由蛋白质是由20种种L-型型的的-氨基酸构成。氨基酸构成。非极性氨基酸（非极性氨基酸（6个）个）极性不带电荷（极性不带电荷（6个）个）芳香族（芳香族（3个）个）带电荷（带电荷（5个）个）二二氨基酸的分类和结构氨基酸的分类和结构1按照氨基酸侧链的极性分类按照氨基酸侧链的极性分类非极性氨基酸：非极性氨基酸：Ala,Val,Leu,Ile,Met,Phe,Trp,Pro共八种共八种极性不带电荷：极性不带电荷：Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr共七种共七种带正电荷：带正电荷：Arg,Lys,His（碱性氨基酸）（碱性氨基酸）带负电荷：带负电荷：Asp,Glu（酸性氨基酸）（酸性氨基酸）2按照氨基酸侧链的化学结构按照氨基酸侧链的化学结构l脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸共共15种。种。侧链只是烃链（侧链只是烃链（Gly,Ala,Val,Leu,Ile）侧链含有羟基（侧链含有羟基（Ser,Thr）侧链含硫原子（侧链含硫原子（Cys,Met）侧链含有羧基侧链含有羧基Asp（D）,Glu（E）侧链含酰胺基侧链含酰胺基Asn（N）,Gln（Q）侧链显碱性：侧链显碱性：Arg（R）,Lys（K）l芳香族氨基酸芳香族氨基酸3种种苯丙氨酸（苯丙氨酸（Phe,F）色氨酸）色氨酸(Trp,W)酪氨酸酪氨酸(Tyr,Y)l杂环氨基酸杂环氨基酸2种种组氨酸组氨酸(His)脯氨酸脯氨酸(Pro)。（B是指是指Asx，即，即Asp或或Asn；Z是指是指Glx，即，即Glu或或Gln。）3按照酸碱性分类：按照酸碱性分类：酸性氨基酸：酸性氨基酸：Asp,Glu碱性氨基酸：碱性氨基酸：Arg,Lys,His中性氨基酸：中性氨基酸：15种种4按照氨基羧基分类按照氨基羧基分类一氨基一羧基；二氨基一羧基；一氨基二羧基一氨基一羧基；二氨基一羧基；一氨基二羧基小结结构特点小结结构特点2酸酸3碱碱3芳香芳香2S3OH2酰胺酰胺总结：二十种氨基酸的结构特点总结：二十种氨基酸的结构特点支链氨基酸：支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、半胱氨酸（含巯基）、 甲硫氨酸（含硫甲基）甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：含胍基的氨基酸：精氨酸精氨酸含咪唑基的氨基酸：含咪唑基的氨基酸：组氨酸组氨酸亚氨基酸：亚氨基酸：脯氨酸脯氨酸含酰胺的氨基酸：含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：含吲哚基的氨基酸：色氨酸色氨酸含含-氨基的氨基酸：氨基的氨基酸：赖氨酸赖氨酸三三其他氨基酸其他氨基酸1两种新发现的氨基酸两种新发现的氨基酸:硒代半胱氨酸（硒代半胱氨酸（Sci2002.5.24）吡咯赖氨酸吡咯赖氨酸2修饰性氨基酸修饰性氨基酸3非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸中文名称中文名称英文名称英文名称三字符号三字符号单字符号单字符号甘氨酸甘氨酸GlycineGlyG丙氨酸丙氨酸AlanineAlaA缬氨酸缬氨酸ValineValV亮氨酸亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸异亮氨酸IsoleucineIleI丝氨酸丝氨酸SerineSerS苏氨酸苏氨酸ThreonieThrT半胱氨酸半胱氨酸CysteineCysC甲硫氨酸甲硫氨酸MethionieMetM脯氨酸脯氨酸ProlineProP天冬氨酸天冬氨酸AsparticacidAspD天冬酰胺天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酸谷氨酸GlutamicacidGluE谷氨酰胺谷氨酰胺GlutamineGlnQ赖氨酸赖氨酸LysineLysK精氨酸精氨酸ArginineArgR组氨酸组氨酸HistidineHisH苯丙氨酸苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸色氨酸TryptophaneTrpW五五氨基酸一般性质氨基酸一般性质l两性离子两性离子l光吸收：光吸收：最大吸收波长最大吸收波长=280nm苯丙氨酸苯丙氨酸257-259nm/257nm酪氨酸酪氨酸275-278nm/275nm色氨酸色氨酸279-280/280nm苯环氨基酸含大键吸收紫外光l溶解性溶解性（乙醇）（乙醇）l旋光性和独自旋光度旋光性和独自旋光度六六氨基酸化学性质氨基酸化学性质1两性解离和等电点两性解离和等电点氨基酸的氨基酸的等电点（等电点（isoelectricpointpI）氨基酸所带正负电荷相等，即静电荷为零时的溶液氨基酸所带正负电荷相等，即静电荷为零时的溶液pH。等电点计算及意义等电点计算及意义公公式式推推导导中性氨基酸中性氨基酸（一氨基一羧基）（一氨基一羧基）pI=(pK1 + pK2)/2酸性氨基酸酸性氨基酸（一氨基二羧基）（一氨基二羧基）pI=(pKpK1 1 + pKpK2 2)/2碱性氨基酸碱性氨基酸（二氨基一羧基）（二氨基一羧基）pI=(pKpK2 2 + pKpK3 3)/2电荷电荷+0-pHpHpIpHH+H+阳离子阳离子兼性离子兼性离子阴离子阴离子电荷电荷0pHpI2氨基酸化学反应氨基酸化学反应（1）茚三酮反应茚三酮反应lpH5-7；80-100；茚三酮乙醇；蓝紫色化合茚三酮乙醇；蓝紫色化合物；物；570nm定量测定。定量测定。l脯氨酸；黄色化合物；脯氨酸；黄色化合物；440nm定量测定。定量测定。l（谷氨酰胺、天冬酰胺；棕色化合物）（谷氨酰胺、天冬酰胺；棕色化合物）OH2O（2）-氨基参与的反氨基参与的反应应成成盐反反应酸水解液中以酸水解液中以盐酸酸盐形式存在（碱中金属形式存在（碱中金属盐）与与亚硝酸反硝酸反应Vanslyke氏氨基氮氏氨基氮测定原理。定原理。N2一半来自氨基酸，另一一半来自氨基酸，另一半半HNO2。 该反反应也用来判断蛋白也用来判断蛋白质的水解程度。的水解程度。RCHCOOH+HClNH2RCHCOOHNH2HCl甲醛滴定甲醛滴定由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。主要是因为没有合适的指示剂。封闭氨基后，使定测定含量。主要是因为没有合适的指示剂。封闭氨基后，使氨基酸的滴定范围变小，易于判断滴定终点。氨基酸的滴定范围变小，易于判断滴定终点。意义：定量测定；判断反应进程。意义：定量测定；判断反应进程。与与2，4二硝基氟苯的反应（二硝基氟苯的反应（Sanger反应）反应）弱碱；干燥；暗处；室温；形成黄色弱碱；干燥；暗处；室温；形成黄色DNP-氨基酸，用乙酸氨基酸，用乙酸乙酯抽提，并与标准的乙酯抽提，并与标准的DNP-氨基酸作比较。氨基酸作比较。与苯异硫氰酸（与苯异硫氰酸（PITC)（Edman反应）反应） 弱碱条件反应；衍生物是弱碱条件反应；衍生物是无色无色的，酸性条件下极稳定，可的，酸性条件下极稳定，可溶于乙酸乙酯，经高压液相即可分析出其溶于乙酸乙酯，经高压液相即可分析出其N端的氨基酸组端的氨基酸组成。成。生成的肽链比原来少一个氨基酸，可以进行下一轮生成的肽链比原来少一个氨基酸，可以进行下一轮反应，而不需要彻底水解掉反应，而不需要彻底水解掉，此法是自动氨基酸分析仪的，此法是自动氨基酸分析仪的基本原理。基本原理。与丹磺酰氯（与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应）的反应5-二甲氨基萘二甲氨基萘-1-磺酰氯磺酰氯酸水解生成的酸水解生成的DNS氨基酸（具有荧光），用乙酸乙酯氨基酸（具有荧光），用乙酸乙酯抽提抽提DNS氨基酸，用色谱法分析或直接用纸电泳或薄层氨基酸，用色谱法分析或直接用纸电泳或薄层层析法鉴定。层析法鉴定。形成形成Schiff碱碱（3）-羧羧基参与的反基参与的反应应与醇成与醇成酯酯；与碱成；与碱成盐盐（保（保护羧护羧基）。基）。（4）侧链侧链参与的反参与的反应应（氨基酸（氨基酸颜颜色反色反应应）米米伦伦反反应应；福林反；福林反应应；坂口反；坂口反应应；Pauly反反应应；乙；乙醛醛酸反酸反应应；半胱氨酸反；半胱氨酸反应应试试剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的氨基酸的氨基酸米伦反应HgNO3Hg(NO3)2及HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色紫色Trp坂口反应(Sakaguchi反 应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基TyrEllman反应二硫硝基苯甲酸DTNB紫色巯基Cys侧链的反应侧链的反应OHN反应名称反应名称3氨基酸色谱分离法氨基酸色谱分离法l离子交换色谱法离子交换色谱法原理：不同原理：不同pH下，氨基酸电荷不同。下，氨基酸电荷不同。方法：阳离子交换树脂方法：阳离子交换树脂/阴离子交换树脂阴离子交换树脂l薄层层析薄层层析滤纸；羟基磷灰石；二氧化硅等。滤纸；羟基磷灰石；二氧化硅等。蛋白质水解蛋白质水解酸水解酸水解方法：方法：6MHCl或或4MH2SO4，105回流回流20小时即可完全水解。小时即可完全水解。优点：优点：酸水解不引起氨基酸的消旋，完全彻底。酸水解不引起氨基酸的消旋，完全彻底。缺点：缺点：但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，Asn和和Gln的酰胺基被水解。的酰胺基被水解。（3）如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使）如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。水解液变黑。碱水解碱水解用用5MNaOH，水解，水解1020小时可水解完全。小时可水解完全。特点：特点：碱水解使氨基酸消旋（碱水解的主要机理是在碱性条件碱水解使氨基酸消旋（碱水解的主要机理是在碱性条件下，氨基酸的键更易断裂。形成外消旋体即下，氨基酸的键更易断裂。形成外消旋体即DL两种构型两种构型的氨基酸等摩尔数存在。氨基酸的消旋作用被中和掉。），的氨基酸等摩尔数存在。氨基酸的消旋作用被中和掉。），许多氨基酸被破坏，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。但色氨酸不被破坏。ARG可脱氨生可脱氨生成鸟氨酸及尿素。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以成鸟氨酸及尿素。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。防止氧化。酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。酶协同作用。第三节第三节蛋白质的结构蛋白质的结构构象（构象（conformation）：）：是指分子内各原子和基团间的相互立体关系，它可以通过是指分子内各原子和基团间的相互立体关系，它可以通过单键的相互旋转实现变化，不需要共价键的断裂。单键的相互旋转实现变化，不需要共价键的断裂。构型（构型（comfiguration）是指在立体异构体中，由于某种因素的限制取代基或原子是指在立体异构体中，由于某种因素的限制取代基或原子在空间上形成的不同取向。需要通过共价键的断裂才能实在空间上形成的不同取向。需要通过共价键的断裂才能实现不同构型分子间的转变。现不同构型分子间的转变。蛋白质多种多样，分为初级结构和高级结构蛋白质多种多样，分为初级结构和高级结构一一蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构描述的是多肽连中氨基酸的组成和排列顺序及连接方式。描述的是多肽连中氨基酸的组成和排列顺序及连接方式。1肽键和肽链肽键和肽链肽键肽键(peptidebond) ：肽链肽链(peptidechain) ：相关概念：肽、多肽、二肽等相关概念：肽、多肽、二肽等肽键肽键一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基羧基与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的-氨基氨基缩水形缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。成的酰胺键（共价）键，称为肽键。特点：特点：具有部分双键的性质具有部分双键的性质,不可以旋转不可以旋转肽键比一般的碳肽键比一般的碳-氮键短；氮键短；与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式；与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式；一级结构中的相关术语：一级结构中的相关术语：N-端（氨基端、端（氨基端、NH2-端）端）C-端（羧基端、端（羧基端、COOH-端）端）氨基酸残基氨基酸残基（110或或108）2肽的结构和命名肽的结构和命名习惯：按数量的多少、按来源、按功能习惯：按数量的多少、按来源、按功能二肽、三肽、四肽等、多肽二肽、三肽、四肽等、多肽系统：某氨基酰某氨基酰系统：某氨基酰某氨基酰某氨基酸某氨基酸重要的肽（生物活性肽）介绍重要的肽（生物活性肽）介绍保健品行业的热点。保健品行业的热点。3肽链表达式肽链表达式从从N(OH)到到C(H)，具方向性，具方向性三字母符号或单字母符号表示，中间用三字母符号或单字母符号表示，中间用“”或或“-”表示。表示。-2H+2H2GSHGSSG-2H+2H参与氧化还原反应传递氢参与氧化还原反应传递氢GSH的作用的作用解毒作用：与毒物或解毒作用：与毒物或解毒作用：与毒物或解毒作用：与毒物或药药物物物物结结合，消除其毒性作用；合，消除其毒性作用；合，消除其毒性作用；合，消除其毒性作用；参与氧化参与氧化参与氧化参与氧化还还原反原反原反原反应应：作：作：作：作为为重要的重要的重要的重要的还还原原原原剂剂，参与体内多种氧化，参与体内多种氧化，参与体内多种氧化，参与体内多种氧化还还原反原反原反原反应应；保保保保护巯护巯基基基基酶酶的活性：使的活性：使的活性：使的活性：使巯巯基基基基酶酶的活性基的活性基的活性基的活性基团团-SH-SH-SH-SH维维持持持持还还原状原状原状原状态态； 维维持持持持红细红细胞膜胞膜胞膜胞膜结结构的构的构的构的稳稳定：消除氧化定：消除氧化定：消除氧化定：消除氧化剂对红细剂对红细胞膜胞膜胞膜胞膜结结构的破坏构的破坏构的破坏构的破坏作用。作用。作用。作用。4 4 一级结构研究一级结构研究测序前提：测序前提：l样品必须是均一的样品必须是均一的(纯度大于纯度大于97%)l必须知道它的相对分子量，其误差允许在必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内以内过程过程1. .测定定蛋白质分子中多肽链的数目蛋白质分子中多肽链的数目 2.2.拆分蛋白质分子的多肽链拆分蛋白质分子的多肽链 3.3.断开链内二硫键断开链内二硫键 4.4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目 5.5.鉴定多肽链的鉴定多肽链的N N、C C瑞残基瑞残基 6.6.裂解多肽成小的肽段裂解多肽成小的肽段 7.7.测各肽段的氨基酸序列测各肽段的氨基酸序列 8.8.重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构 9.9.确定二硫键的位置确定二硫键的位置N末端末端测定测定二二硝基氟苯（硝基氟苯（DNFB）法法：（Sanger法）肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽黄色DNP-氨基酸丹磺酰丹磺酰氯（氯（DNS）法：法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯异硫苯异硫氰酸（氰酸（PITC）法法：（：（Edman法）法）生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来氨肽酶氨肽酶法：法：外切酶，但效果不好氨肽酶法氨肽酶法 氨肽酶是一类外切酶，它从肽链的N末端逐个向里切。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶 也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。 C-端端测定测定肼肼解法解法：最重要的化学方法，肽与肼反应，除最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物物还原法还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨氨基醇基醇羧肽酶羧肽酶法法：最有效、最常用最有效、最常用羧肽酶羧肽酶A羧肽酶羧肽酶B羧肽酶羧肽酶Y羧肽酶羧肽酶C 氨基酸酰肼可以与苯甲醛苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀GlnAsnCys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸羧肽酶法本方法目前最有效。本方法目前最有效。从羧基端开始向里逐一水解蛋白质从羧基端开始向里逐一水解蛋白质羧肽酶羧肽酶A：释放除：释放除Pro，Arg和和Lys以外的所有以外的所有C-末端残基末端残基羧肽酶羧肽酶B：只水解以碱性：只水解以碱性Arg和和Lys为为C-末端的肽键末端的肽键羧肽酶羧肽酶A可以切割可以切割C端除了端除了Lys、Arg、Pro的氨基酸的氨基酸羧肽酶羧肽酶B可以切割可以切割C端的端的Lys或或Arg但如果倒数第二个氨基酸为但如果倒数第二个氨基酸为Pro两种羧肽酶均不能作用两种羧肽酶均不能作用二硫二硫键的键的拆分拆分氧化法：氧化法：过甲酸过甲酸还原法：还原法：巯基化合物还原巯基化合物还原此外，还需要加此外，还需要加8mol/L尿素或尿素或6mol/L的盐酸胍，使蛋白质变性；的盐酸胍，使蛋白质变性；生成的巯基要生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。用碘乙酸等烷化剂保护。氨基酸氨基酸组成的组成的测定测定酸酸水解水解：是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但基酸不消旋，但Trp全部被破坏，全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，部分破坏，Asn和和Gln的酰的酰氨基氨基被水解，生成被水解，生成Asp和和Glu；碱水解碱水解：多数氨基酸都被破坏，但多数氨基酸都被破坏，但Trp可可定量回收定量回收多肽连排列顺序的确定多肽连排列顺序的确定片段重叠法片段重叠法随即切断成小的片段，确定序列，进行重叠组合随即切断成小的片段，确定序列，进行重叠组合常用断裂多肽的方法：常用断裂多肽的方法：多多肽肽链链的的部分部分裂解裂解酶裂解胰蛋白酶胰蛋白酶：专一性强，断裂：专一性强，断裂Lys或或Arg的羧的羧基参与形成的肽键基参与形成的肽键( 羧基不能是羧基不能是Pro）糜糜蛋白酶蛋白酶：断裂：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等等疏水疏水氨基酸氨基酸的羧基端肽键的羧基端肽键金黄色葡萄球菌蛋白酶金黄色葡萄球菌蛋白酶：专一性断裂：专一性断裂Asp、羧基参与形成的肽键（谷氨酸蛋白酶）羧基参与形成的肽键（谷氨酸蛋白酶）胃蛋白酶胃蛋白酶：酸性条件稳定酸性条件稳定，肽键两侧均为疏水氨，肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用，专一性与糜蛋基酸。在确定二硫键位置时常用，专一性与糜蛋白质酶类似白质酶类似化学裂解溴化氰（CNBr）：只断裂Met的羧基形成的肽键羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一性断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一肽肽段段的的氨氨基基酸酸测测序序Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；现改用蛋白质测序仪。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难质谱法：质谱仪由核苷酸序列推定法：mRNAcDNA，推出cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列二硫键位置的确定：二硫键位置的确定：对角线电流法：一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。对角线电泳过程对角线电泳过程：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在PH6.5条件条件下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，然后然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使S-S氧化成一对氧化成一对含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转90度，在与第一向完度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率未变，交于滤纸的一条对角线上，而含磺基的迁移率未变，交于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。增加，结果它们都偏离了对角线。肽段在肽段在多肽链中多肽链中次序的决次序的决定定二二蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构secondarystructure1二级结构的概念二级结构的概念多肽链在一级结构基础上，主链骨架进一步盘曲折叠，依多肽链在一级结构基础上，主链骨架进一步盘曲折叠，依靠氢键维系形成的有特定规律的蛋白质结构称为靠氢键维系形成的有特定规律的蛋白质结构称为。二级结构稳定的化学键为氢键，与侧链二级结构稳定的化学键为氢键，与侧链R构象无关。构象无关。肽单位构象特点：肽单位构象特点：刚性平面结构；反式排列；平面借助于刚性平面结构；反式排列；平面借助于-碳原子旋碳原子旋转转。肽肽平面的存在限制了平面的存在限制了主链能够形成的构象数。主链能够形成的构象数。蛋白质多样性形成机制？蛋白质多样性形成机制？2二级结构的主要类型二级结构的主要类型 绕CN旋转的角称，而绕CC旋转的角称。这两个角称为C原子的二二面角面角（1）-螺旋（螺旋（-helix）H2N-端端COOH-端端侧链基团碳原子氮原子氧原子氢原子-螺旋结构示意图-螺旋结构是以肽平面为单位形成的右手螺旋结构，=-47，=-57。每3.6个氨基酸螺旋上升一周，螺距=0.54nm。每个肽平面的N-H与第4个肽平面的C-O形成氢键。氢键与螺旋长轴相平行。-螺旋的所有肽键均参与氢键的形成。R基团伸向螺旋的外侧。RRRRRRRRROOOOOOONNNNNNNCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCNNNNNNNNNNN1）-螺旋-螺旋（螺旋（-Helix-Helix）结构要点：）结构要点：u多个肽键平面通过多个肽键平面通过-碳原子碳原子旋转，绕一条固定轴形成旋转，绕一条固定轴形成右手右手螺旋螺旋（N-N-端至端至C-C-端方向）端方向）u每每3.63.6个氨基酸残基上升一圈，相当于个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm0.54nm, ,每个残基绕轴每个残基绕轴旋转旋转100100，沿轴上升，沿轴上升0.15nm0.15nmu相邻两圈螺旋之间借肽键中相邻两圈螺旋之间借肽键中C CO O和和N-HN-H形成许多形成许多链内链内氢健氢健，即每一个氨基酸残基中的即每一个氨基酸残基中的NHNH和前面和前面相隔三个残基相隔三个残基的的C CO O之间形之间形成氢键（成氢键（1-51-5），这是），这是稳定稳定-螺旋的主要键螺旋的主要键, , 平行平行。u肽链中肽链中氨基酸氨基酸R R侧链侧链，分布在螺旋外侧，分布在螺旋外侧1-（aa）3-5* * 影响影响-螺旋稳定的因素：螺旋稳定的因素： R R基大小：基大小：较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮 氨酸)、Gly空间占位很小，电荷：电荷：带同种电荷的R基无法形成ProPro存在存在 出现出现“拐角拐角”。（2）-折叠折叠结结构（构（-pleatedsheet）又称）又称-片片层层顺向平行反向平行N末端N末端N末端C末端0.7nm-折叠结构（A：顺向平行，B：反向平行)结构要点如下：结构要点如下：多肽链呈多肽链呈锯齿状锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构；（或扇面状）排列成比较伸展的结构；有有平行式平行式和和反平行式反平行式两种，两种，相邻两个氨基酸残基的相邻两个氨基酸残基的轴心距离轴心距离反平行为反平行为0.35nm0.35nm，平行，平行为为0.325nm0.325nm，侧链侧链R R基团交替地分布在片层平面的上下方基团交替地分布在片层平面的上下方所有肽键的所有肽键的C=OC=O和和N NH H形成形成链间链间氢键，方向：与轴垂直；氢键，方向：与轴垂直；（3）-转转角（角（-turn）又称又称-弯曲（弯曲（-bend）或）或发夹结发夹结构构(hairpinstructure) 指蛋白质的多肽链在形成空间构象时经常会出现指蛋白质的多肽链在形成空间构象时经常会出现180180的的回折，回折处的结构就称为回折，回折处的结构就称为-转角。一般由转角。一般由四四个连续的个连续的氨基酸组成，第氨基酸组成，第一一个残基的个残基的C CO O与第与第四四个残基的个残基的N NH H形成形成氢键。氢键。1-（aa）2-4RROOCCCCCHHNNOCCHN-转角示意图-转角常出现在肽链呈180回折处，多由4个氨基酸残基组成，第1个氨基酸的羰基氧与第4个氨基酸残基的氨基氢形成氢键。-转角的第2个氨基酸多为脯氨酸。三三纤维状蛋白结构纤维状蛋白结构（fibrousprotein）基本支架和保护成分基本支架和保护成分1-角蛋白角蛋白-螺旋螺旋卷曲螺旋卷曲螺旋原纤维原纤维初原纤维初原纤维中间纤维中间纤维毛发毛发2X2X2X4X3X-螺旋螺旋-原胶原纤维原胶原纤维-聚合成胶原蛋白聚合成胶原蛋白Gly-X-Y；羟脯氨酸；羟脯氨酸/羟赖氨酸；羟化酶（羟赖氨酸；羟化酶（Fe2+、Vc保护作用）保护作用）