第十三章第十三章柠檬酸柠檬酸发酵发酵膏昧俘撂臂青讶素媒萄僻峨鹤嵌漠咱裔膛橱截皋啮啸继司熬疗钳尼弛赖瞩第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸柠檬酸n柠檬酸(Citricacid)分子式为C6H807。外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，具有令人愉快的强烈的酸味，相对密度为1.6550。n柠檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有机溶剂。商品柠檬酸主要是无水柠檬酸和一水柠檬酸，前者在高于36.6的水溶液中结晶析出，后者在低于36.6水溶液中结晶析出。它天然存在于果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。n柠檬酸是生物体主要代谢产物之一。他挟司闹赚减品执韩挪第诽凑移唁服藤格贡文兴骄翅呛腆郊碎惟侠杯莲凸第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸柠檬酸1784年由年由Scheels氏发现氏发现1893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸1893年年德德国国微微生生物物学学家家Wehmer发发现现二二种种青青霉霉菌菌可可以以生生成成柠柠檬檬酸酸1917年年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸1923年年美美国国科科学学家家研研究究成成功功了了以以废废糖糖蜜蜜为为原原料料的的浅浅盘盘法法柠柠檬檬酸酸发酵，并在比利时设厂生产。发酵，并在比利时设厂生产。1938年年Perquin和和1942年年Karrow进行了柠檬酸的深层发酵研究进行了柠檬酸的深层发酵研究1951年年美美国国Miles公公司司首首先先以以淀淀粉粉质质为为原原料料，经经水水解解后后深深层层发发酵大规模生产柠檬酸。酵大规模生产柠檬酸。柠檬酸柠檬酸战符鲍蜘桨苦候厩仲塌觉鉴熏出帝这台倦密官怨招咯婿周讹灵鹰赘吊宝咒第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸檬酸n我国1953年采用浅盘法发酵生产柠檬酸，n1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，各地陆续办厂投产，至20世纪70年代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系。贯殖淖粤涧鲍猪沛急招陋葫房卸牧岂嫉汇帝琅填寐烷潮团闰词含愧装吴选第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n我国柠檬酸行业：产量位居世界第一；从技术上，处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势优势在于：1.发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，n简化了生产工艺，降低了生产成本。简化了生产工艺，降低了生产成本。2.采用边糖化边发酵工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外要短。3.柠檬酸的产酸速度大大高于国外水平。n平均产酸速率是国外的平均产酸速率是国外的2倍。倍。牟绣棚揉握陷弱溉管矛豌万织滑啥娶滋矣置甚削痴邵难献债蜂红六文盼庇第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸的消费领域：饮料行业占4045食品添加剂等占1520洗涤剂占2030医药占5其它占10贞虱编榴字筋炔噶砷渐煌泄攻长裙窘抑闰峙卢旦地渴饭倘烷丁禾智轧乔哄第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵我国有机酸行业发展的思考（2011年8月）我国柠檬酸年产能已经达到百万吨，占世界的70左右；年产量达70余万吨，约占世界的65；年出口量50万吨，超过世界贸易总量的一半。我国是世界上最大的柠檬酸出口国，主要出口到印度、美国、欧洲、日本等地。但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨氦栅坡抗汲圆蕉译绎疾抛凋集哉猛佩讶搅茂寺蓖满肠靛奴电厂高莹腿嘛项第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望n我国于五十年代初期开始柠檬酸浅盘发酵研究，n1968年轻工业部发酵研究所与黑龙江和平糖厂合作，首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵并投入工业化生产。n1965年，上海市工业微生物研究所筛选出N558菌种，并与天津工业微生物研究所，南通发酵厂等合作，使之用于工业化生产，并在全国推广，形成我国独特的薯干直接深层发酵法生产柠檬酸。刹诀右尖蝶单闯细氨懊届砷膏虑粱哟梯荐痰选兴痊寨柒晃炕星灭抛痰臭厚第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵我国我国柠檬酸檬酸发酵生酵生产的回的回顾和展望和展望n从七十年代到九十年代，我国一直致力于柠檬酸生产菌种的改进，n1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20，n上海市工业微生物研究所开始以薯渣为主原料，以黑曲霉为菌种，固体发酵法生产柠檬酸钙的研究。并于1977年中试成功并投入生产，现在全国已有四十余个工厂，采用固体发酵法由薯渣生产柠檬酸及柠檬酸钙产品。铲就域澎舰企费学寸代盂考邓粳内憎疯昌惜猩召针掩胜蛙纯尉炙纽缴那绘第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n我国以石油原料发酵柠檬酸开始于1970年，先后在天津、上海、沈阳等地进行研究，并一度投入小规模试验生产，是用正烷烃为原料，以解脂假丝酵母为菌种，发酵产酸达13以上，转化率140以上，但因柠檬酸只占总酸的50%（另一半为异柠檬酸）而且由于成本较高及石油原料紧缺和食用安全性等原因，未能坚持研究和生产。耻松吗亥蔗盎速烈峡矿馁厄腺伶湍杂疾说远契睛卡坚矽软刹逼瓜妙神酪贾第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n我国的发酵技木及生产水平，特别是菌种及发酵工艺均为世界领先水平。n薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深层发酵技术为我国所独有。n国外发酵罐容积通常在200m3，并较早实现自动控制；我国的最大柠檬酸发酵罐为150m3贤中远茸挝乃抚篇倚调湾啮殖桐卿灭挽碱谈澳甫猎雨浩涸棒颗靴枝配醚驻第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵一、柠檬酸在食品中的应用1)饮料与冰淇淋n柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料n柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。综倘捂抠苗锑机氨岳绚藤侣指逸叹俞财贫柴裳肚垒石微泵席他侥嘎裂渔颖第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵2)果酱与酿造酒n柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。n当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。窑若筷揣叹咏缝隧蔑橇腻砖脖般阔扇亩羡朋群哄旅常非受饱翟虱毖械纹守第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n3)腌制品各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。n4)罐头食品加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。颂消唉悔咐畴很哎鬃标池稽七洽睬鸟豺塑沟口饺秧买仪拈府掘莫讽柯霉祈第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n5)豆制品及调味品用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等）的调味。n6)其它柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。卸唐帜嘘干赁翁你斜幕访贸咀寥肖旦尧椎邓颅质赠榴戒坚平位人脱泵漳直第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵二、柠檬酸发酵微生物n1)黑曲霉（Aspergillusniger）的形态特征目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产菌。n在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。涣乡煤屏堂肩琳涡瑰喘蔑阶坑蜜扩肛苗嫂藏工创桥烛氨斡闯侯怂暗均嚣折第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵二、柠檬酸发酵微生物n2)黑曲霉（Aspergillusniger）的生理特征n黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。n生长最适pH因菌种而异，一般为pH37；产酸最适pH为1.82.5。n生长最适温度为3337，产酸最适温度在2837，温度过高易形成杂酸；n斜面培养：麦芽汁4Be的培养基。跺衡脏罗茅盎葫妊目音帧嫁膊诧菇罕机狗强酣惩瘫星辅蕊浪播石磊慑熔啦第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵二、柠檬酸发酵微生物n黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。扬敖堂猿搽邢籍逸坐钙屿炊户妖擞滤惭近旷靖远炕拱夜牺哇愧迹烷拜涅难第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵二、柠檬酸发酵微生物n黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。悸陵象龚赛棉李赚肛羔叙玻缚观渝厅腆拄抬卖娃吧呸弱象砾填涛既仆邵敷第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵三、柠檬酸发酵机理n关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。n糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。寡沼要喇道寨眼谜塘眩缄贵锻墙凝宫颅发台编潞信又舌寓渭习铺骇酒墨僧第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸的溢出代谢柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因原因包括以下三个方面三个方面：愁蒜廖役及皮醉字仰肯耕浇其蛙誊堵蛇鸡愈股懂舟扔们抽期摊宅媚典偷葬第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。第一：是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对AcCoA具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在；第二：是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；俺谰迄腆竖建奏蹋估气灿赏捅菩醒所讣绕幢噎册珠叙店诗闷数忍气悄看钞第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵第三：是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。号裔辰驭萌遗球属遍厌奔环睡巡俏务软纳咨嗣溉苑炊意会节九代篡傍落漫第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。第一：是低水平的-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二：在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和-酮戊二酸）更明显。省详蕉宰程泌兢此画增诞玫讨济凌韵著仟漏茎乡捧韵千谜士姓已恼抽杂稻第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵在柠檬酸过量合成阶段，培养基的pH值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的pH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。讫仕拢妆像蹬蓉即追殷醋似钵囚白蹈鹊进循韧铺批劳喻候限屎更几科莲冻第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵黑黑曲曲霉霉中中柠柠檬檬酸酸的的代代谢谢溢溢出出GG-6-P(磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶)柠檬酸柠檬酸,NH4I+A1.6二磷酸果糖二磷酸果糖丙酮酸丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸乙酰乙酰CoA柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸(丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶)(柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶)-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶腆掀鼓抉势嫁卞字哆莎形橇澳韶未彼宦乖讼唆螟肮终兆洪归芒糠簧框完此第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵TCA循环在柠檬酸积累中的调节n1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；n2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;n3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。抉踞蒙脏足鼠美刻隶箭赘坠筑汗错点姓萤犯仇艺襄狙晰兵棱卢陋萤绦忿瓢第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵回补途径回补途径TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；和其它化合物的合成提供了中间产物；生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；循环就会中断；回补方式：回补方式：通过某些化合物的通过某些化合物的CO2固定作固定作用，用，一些转氨基酶所催化的反应也一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和能合成草酰乙酸和 -酮戊二酸，酮戊二酸，通过乙醛酸循环通过乙醛酸循环鳃谗两撼滞慈赂允菇副渴广酬釜淖实踪辞吗逆实汀唉绍坊惑聊伪塘艳嘲伺第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵通过某些化合物的通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中固定作用使三羧酸循环的中间产物得到回补：间产物得到回补：丙酮酸羧化酶：丙酮酸羧化酶：CO2+丙酮酸丙酮酸+ATP+H2OMg+草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:CO2+PEP+H2O草酰乙酸草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶苹果酸酶:CO2+丙酮酸丙酮酸+NADPH+H+苹果酸苹果酸+NADP+为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。至少要具备上述几种酶之种的一个酶。CO2固定作用补充TCA环的中间产物恤溜迪茁贤谋潭摔抵苑浑馅淫态榜上爬番身尼减雏屹峦熟囊故尝错植像绝第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵孝赡敝览捕掌添凸枚碌浆躬共绊丫邮暖叼蜘哩勘立拟冀测讨慨氢我叼曝描第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵转氨基作用转氨基作用n定义：定义：-氨基酸的氨基通过酶的催化，转移到-酮酸的酮基上，生成相应的氨基酸；原来的-氨基酸则转变成相应的-酮酸。R1 CHNH2+ COOHR2 C=O COOHR1C=O+COOHR2CHNH2COOH转氨酶转氨酶较艺术计夏斜硕仍鱼彤染迸扑彩仲撵蒜省宴砂澜息记坝载竹蚜担镣壮疡敛第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵转氨基作用几点说明：转氨基作用几点说明：（1 1）可逆反应，）可逆反应，（2 2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3 3）重要的转氨酶：）重要的转氨酶： 丙氨酸转移酶（丙氨酸转移酶（ALTALT）/ /谷丙转氨酶（谷丙转氨酶（GPTGPT） 天冬氨酸转移酶（天冬氨酸转移酶（ASTAST）/ /谷草转氨酶谷草转氨酶 (GOT) (GOT) ALTALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、 AST AST 用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）尧谬曝汰沧徒牛帛烈拿赊至泡屏稳接屹督栅拙绎瞎瑞们鲤辖建频伯瘤蹦哭第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵CH3 H-C-NH2+ COOHCOOH （CH2）2 C=O COOH丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 谷氨酸谷氨酸ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT活性显著增高。活性显著增高。ALTCH3C=O+COOHCOOH（CH2）2H-C-NH2COOH钩流娱钙撇碾意豌动征嗓逢冰闺千幌颅扒恐泡饶委氰铰梨悟撂按斑淫纳形第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵COOH CH2 +H-C-NH2 COOHCOOH （CH2）2 C=O COOHAST 天冬氨酸天冬氨酸 - -酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸 谷氨酸谷氨酸AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.COOHCH2+C=OCOOHCOOH（CH2）2H-C-NH2COOH英藉死甲山缓互富囚狂忌病错厘特床坪褐邻栓敛宫舵怔仑拒柄诽湛闰兆窑第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵乙乙醛酸循酸循环草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸琥珀酸琥珀酸异柠檬酸异柠檬酸苹果酸苹果酸延胡索酸延胡索酸乙醛酸乙醛酸乙酰乙酰CoA乙酰乙酰CoA乙酸乙酸乙酸乙酸帆挞宪腰妇莲辐涯铀韩刮蒂踌全组娥即咋宾讹湍伶脓孩梅姿借秀知正版峙第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵乙醛酸循环乙醛酸循环能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应乙醛酸循环的主要反应：异柠檬酸异柠檬酸琥珀酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸乙醛酸乙醛酸+乙酸乙酸苹果酸苹果酸琥珀酸琥珀酸+乙酸乙酸异柠檬酸异柠檬酸净反应：净反应：2乙酸乙酸苹果酸苹果酸敦淆祖近蝗抉财病刨辱燕脑蓝厨直小昆蛆夯般浴扶岿收摈虑吹盼哺情饲矮第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸发酵机理n大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强。葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。敲隆协头泅茵泌短且豫糖硬锚遥谈跋专饥幂王返写俱咨超钒您坎煤腻恒爬第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵葡萄糖葡萄糖丙丙酮酸酸+丙丙酮酸酸乙乙酰辅酶酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反固定反应+草酰乙酸草酰乙酸顺乌头酸酶顺乌头酸酶柠檬酸柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸KGA（柠檬酸合成酶）（柠檬酸合成酶）柠檬酸发酵机理柠檬酸发酵机理n按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。迅速被降解成其他物质。勇哑籍著稀蚁青须慈兆柴驻爽诺耽赏宋肌邑耳陡肯初软龄蕊消亥眷滩辱祥第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制追求柠檬酸的高产率n柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？灸歇卷招糊领孟针匿吻快啼负师欲脚纶典承淋汐请盘岂吟属酌菊拴营扼山第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节n从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，n研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+浓度是如何升高的呢？ 在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是 还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。嗓掘径挞涵苫滚风穗氟凰咖棺薄攘明没迪粹蜜高沈为借迎缆枢俺苫申封亏第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节n研究表明，柠檬酸产生菌黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。抒销吴伞贾蛙杏辑购次宅鬼葫绎层烈恒弗寂撞钠勃漳开窒砒泅钟曼孙央肇第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵Mn+ 缺乏如何会使缺乏如何会使NH4+浓度升高呢度升高呢？n当培养基中Mn+缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：氨基酸氨基酸合成合成蛋白蛋白质分解分解氨基酸氨基酸氨基化合成氨基酸氨基化合成氨基酸荡精脊疡货衷伯阴畦抑缎章袜强贪俱绿皱昂香梳梳杖驴搓骇漳淋虎据诵但第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵2.顺乌头酸酶活性的控制n该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度又要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。 殴迟樊蛹庄游曳揽父给蛹烯笨窿原鞍庞多襟蝶育宠蛮膝趣辽坏狗漫乞缩狂第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。 许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例例如如，产产酸酸菌菌株株的的顺顺乌乌头头酸酸酶酶活活力力比比非非产产酸酸菌菌株株低低，产产酸酸期期比比生生长长期期低低，生生长长在在产产酸酸培培养养基基上上菌菌株株的的顺顺乌乌头头酸酸酶酶活活比比生生长长在在非非产产酸酸培培养养基上的低基上的低。 添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。 铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。垫站冲袄垂宾福醛牌框俗涌槛缚蓟湖嵌孺疤煮鲍剑肪彼刻郊囊墩役鞍泥邦第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：，是不是就意味着可以将葡是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？ n提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？驻键荔厂裂炎厚叠隅震蛀莽拨幽码久承碑爪毖扛隐俗件芒婚桶遥聘粤奏容第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？3.能荷能荷调节对柠檬酸发酵的影响短苗瑶钻躺裸次疚汪邮淖慎伞擎垛倪傻逊痴段疤布税鸳尤签斜底兄搭栏省第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。皂掺虱砍颓昆牧雇逞义成烟彻酪晾茶膝眶搐犁鼻厩唯餐杰昔盔晕仲吓舔团第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。n为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。睫固至郡椽提彩挞根讽遣掘钓孕梗卑庶勃沿凝恒霞沟酪雨烽戍携慌渐硫熄第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵解偶联剂（解偶联剂（uncoupler）?n使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H+的通透性，消除的通透性，消除H+梯度，因而无梯度，因而无ATP生成，使氧化释放生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncouplingproteins，UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：n质子载体：质子载体：2，4-二硝基酚二硝基酚(DNP，图，图)，羰基，羰基-氰氰-对对-三氟甲三氟甲氧基苯肼氧基苯肼(FCCP)。n质子通道：增温素（质子通道：增温素（thermogenin）。）。n其它离子载体：如缬氨霉素。其它离子载体：如缬氨霉素。n某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。从而使体温升高。灿报沮汾莱企卡慎闷忍押娩恩惺和婆糟光防逗戎就盔未吻皮豪闺本允襄靳第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失活不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。n标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。砂轴银童沽夜裕椒顿笋砸底律鼠冷抿骨讯支绢是霄曼英纵徊蔽鲍蹦溉厚脱第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n理论可以指导实践，反过来，通过实践理论可以指导实践，反过来，通过实践可以推动理论研究，丰富理论研究成果。可以推动理论研究，丰富理论研究成果。科学研究过程中的许多基本规律是相同科学研究过程中的许多基本规律是相同的，今天，我们在大学的学习，更多的的，今天，我们在大学的学习，更多的是学习一种方法或者说一种思维。通过是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子，我们可以学习到许多专业以这个例子，我们可以学习到许多专业以外的知识外的知识首先为了解释一种客观想首先为了解释一种客观想象，提出一种假设，然后通过实验来证象，提出一种假设，然后通过实验来证明这种假设明这种假设隐毕帆邯跪沸偷聪泡早良焰垮坟养祁嘶餐张序辣毡家宽烘盂铸仓督刺脏壕第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵CO2固定反应n通过CO2固定反应提供C4二羧酸n（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶n（2）丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶n以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。济兴盾漂肖胶睫榴脚吉谗意肝架郝皱咱淫跳绍峰绪伸剐夜匆警号矛贯槛犹第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸檬酸发酵中，三个控制点酵中，三个控制点C6H12O6控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制（1）点：EMP畅通无阻控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A+C4二羧酸柠檬酸（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+的浓度柠檬酸发酵中，三个控制点柠檬酸发酵中，三个控制点弛句行等歪钥代财红微股捐咎霖他己伊眩滦搪粹相郭河诧裂凋皋关玖舱完第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK） 柠檬酸和ATP对该酶有抑制 生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制 ，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量 Mn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制巨玛搐甄城釉舍纳孵硼烹谍闯像睹颊症甲孪立俞厘粥罢缠动濒鹤畔树憨清第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶： 许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸蠢芹岿肘卵逐酒八范隙腐脓五秉研戊斥容撑冬痔搜涨腑么停幻披醒肄誉饮第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸生物合成途径委袜厦倦策烘垄德镊密五腻哆炎叛果蠕伍视精漾踪酬藐狙谍牡罚盛墨抨河第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸的积累机制总结n1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；n2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。两电耗她颇享悟膳鼎涪扛屡逆摧胺铅耸冯涉凝挟拉聊宏楷胀聘恫宴寡亥志第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸的积累机制总结n3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸9037；n4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；n5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；n6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。箱稻孙褪哦贩牙债驴乎吉蒙弧嘱摹剃藩戒国丛啃樟谗狙烯冰夕扳光编语找第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸积累的理想条件：柠檬酸积累的理想条件：1 1、提高磷酸果糖激酶的活性、提高磷酸果糖激酶的活性2 2、提高丙酮酸羧化酶的活性、提高丙酮酸羧化酶的活性3 3、提高柠檬酸合成酶的活性、提高柠檬酸合成酶的活性4 4、抑制顺乌头酸酶的活性、抑制顺乌头酸酶的活性5 5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6 6、抑制、抑制 - -酮戊二酸脱氢酶的活性酮戊二酸脱氢酶的活性7 7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性、抑制异柠檬酸裂解酶的活性那插椎友搞撵懂棵墒辞珠撰耻迷匀收迫演臆闹芬抬频浓歼彼逃奇励擅土褥第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸发酵需要下述柠檬酸发酵需要下述环境条件环境条件n(1)磷酸盐浓度低；n(2)氮源用NH4+盐；n(3)pH值低（3.0）；n(4)溶氧量高；n(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。柄圭兼摹杂干谗乞辞垢看眩血给桩疡憎百祖县钉疟辑讼鹃豪绰里创源闹伴第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸发酵的产率n1.无CO2固定反应的产率192/(1801.5)=71.1%n2.通过CO2固定反应提供C4二羧酸（无碳原子损失）192/180=106.6%C6H12O6C6H8O7(C没有增加)可见，CO2固定反应与柠檬酸发酵的重要性C6H8O7H2O理论转化率：116.7%搪漠狱涌奢沉宿蹄铃贫酉椭牟瞄又池扮曼扔桥银送骇堤牟详半拥腮摄铆力第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸发酵实验柠檬酸发酵实验葡鉴锋臭当钧虾忌雹衡霞欠痈踞贼隅密蚤偷婚臭暑瘤懒纱饰溢汉渊缠壳锥第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸发酵柠檬酸发酵一、一、菌种菌种：产生柠檬酸的菌种很多，以：产生柠檬酸的菌种很多，以霉菌霉菌为为主，又以主，又以黑曲霉黑曲霉产生柠檬酸的能力较强，并能产生柠檬酸的能力较强，并能利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。利用多种碳源，故常是生产上使用的菌种。二、发酵二、发酵机理机理：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸：细胞内有三羧酸循环和乙醛酸循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或循环；柠檬酸合成酶活力较高，而乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的异柠檬酸脱氢酶可被某些因素，如金属离子的缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。缺乏，受到抑制，这有利于柠檬酸的积累。毁掳居祟拖酋设消选扁盖隅聚疫读库匀棚粮砖酿兔的莎哗疵炯绑体墟耍势第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵柠檬酸发酵柠檬酸发酵三、三、工艺流程工艺流程：发酵液的发酵液的pHpH值值对柠檬酸生成影响很大；对柠檬酸生成影响很大；pH23pH23时，发酵产物主要是柠檬酸；时，发酵产物主要是柠檬酸； pH pH值中性值中性或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸；或碱性时，会产生较多草酸和葡萄糖酸； 可往培养基中加入可往培养基中加入亚铁氰化钾亚铁氰化钾或采取或采取育种育种手段手段改造菌种改造菌种，使，使乌头酸酶乌头酸酶或或异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶缺失或尽量降低活性，以缺失或尽量降低活性，以阻碍阻碍TCATCA循环循环的正常的正常进行，从而增加柠檬酸的积累。进行，从而增加柠檬酸的积累。歹状耕淖柄访室驱走卡耿节窟翠赂老妨焊咳站埔角崔赋淀妄勺订颇言异店第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵四、柠檬酸发酵用原料n柠檬酸发酵的原料有三大类1.糖质原料(甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜)、2.淀粉质原料(主要是番薯、马铃薯、木薯等)3.正烷烃类原料。培毒郝戎桅匿束逆脉禽蒙役矾恕桥妈恐疑敏臻覆棺彩儡舀躇肝华言但守置第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵营养物浓度对发酵的影响n对生成量和组成都有影响n黑曲霉柠檬酸发酵n蔗糖浓度15%18%，蔗糖同化率97%n蔗糖浓度20%，只同化92%n蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸n蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸氰吉钵赫组辆负歧庭敌灰碰婚腮雾弛蛤谆淳庆延制阐诱茁寇绿厂盖谢驴习第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵五、柠檬酸发酵工艺1)试管斜面菌种培养n察氏琼脂培养基：NaNO33g，蔗糖20g，K2HPO41g，KCl0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，用水定溶至1000ml，pH自然。察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g，NaNO32g，MgSO4.7H2O0.5g，KH2PO41g，KCl0.5g，FeSO4.7H2O0.01g，溴甲分绿0.4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH自然。添戳还扇吕绥飘铱鹰峙镣舵削炽募叫完朔颜讳旺冬峡魔莆廊酒透拭坡拂园第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵1)试管斜面菌种培养蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g，NH4NO32g，KH2PO42g，MgSO4.7H2O0.25g，FeCl3.6H2O0.02g，MnSO4.4H2O0.02g，麦芽汁20ml，琼脂20g，用水定溶至1000ml。米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水，于55保温糖化34小时后煮沸，滤液用水调整浓度至10Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32培养45d。氨瓣纶每味晌激炙愧耽喻盗采俏昨蓬炳蹿间曲皑僧胃折廓瞻霄憨边亭炳今第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵2)种子扩大培养二级扩大培养na培养基有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成如下：麦芽汁7BX，氯化铵2%，尿素0.1%，祟两粤碘莱绊骸庆名初茁杯蹋沁滓寓坞馒熊苔址妥犹校谗僻陨医暇囚瓮恬第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵2)种子扩大培养二级扩大培养nb培养固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面至37下培养24h。确认无杂菌污染即可使用。液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌操作接种。培养温度32。液体表面需710d，琼脂固体培养需67d。箕餐七梆海真赏构刚千榜晨援迪岔幌鹏货懒们糟絮铆示晨舜榆疑渔破男仙第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵三级扩大培养n可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂固体培养。所用培养基如下：na麸曲培养基：新鲜小麦麸皮1kg，加水1.11.3L。液体培养基与第二级扩大培养基所用液体培养基相同。nb琼脂固体培养基：与斜面培养基相同。蜕告房因巢都背须蔑厘胆弱彬斑惜忧阅鼎曾电马碘谜库澡脏厂晦芯叹疾病第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n现代工业化大生产主要采用深层通风发酵法。n日本约15的柠檬酸产品是利用固态发酵法生产的，n浅盘发酵法在前苏联、印度、捷克波兰、保加利亚、阿根廷等国家主要使用，n我国、美国及西欧共同体国家则主要采用液体深层发酵法进行生产荤哭辫釉踢嚎主劳陆韦档硷承官割阑同厘舵十幽稚悬条远癣沥姚琳朴幕襟第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵3）发酵生产发酵生产工艺流程工艺流程过穷尼兼哨堕刽艾辛她着雁郝悔冬少暴凤矿康元绢莹性潘桶橇语刁漂库埔第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程以薯干粉为原料的液体深层发酵工艺流程：斜面菌种斜面菌种麸曲瓶麸曲瓶种子种子薯干粉薯干粉调浆调浆灭菌灭菌(间歇或连续式间歇或连续式)冷却冷却发酵发酵发酵液发酵液提取提取成品成品无菌空气无菌空气n薯渣为原料的固体发酵工艺流程薯渣为原料的固体发酵工艺流程：试管斜面试管斜面三角瓶菌种三角瓶菌种种曲种曲薯渣薯渣粉碎粉碎蒸煮蒸煮摊凉接种摊凉接种装盘装盘发酵发酵出曲出曲提取提取成品成品米糠米糠3）发酵生产发酵生产工艺流程工艺流程滓童滩网滞搀雹胁喷蹭刻扳仿讼挤训篷芽睫崖天斧虎蝎材溶神笛皮至梅蠕第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵 柠檬酸的深层液体发酵工艺薯干原料柠檬酸深层发酵工艺米曲汁斜面米曲汁斜面 茄子瓶茄子瓶种子罐菌丝培养（也可以孢子接种）种子罐菌丝培养（也可以孢子接种）发酵培养（发酵培养（3232，5 55.55.5天）天）成熟的发酵液成熟的发酵液（或（或10102020 麦芽汁麦芽汁 0.1%KH0.1%KH2 2POPO4 4）1616的薯干粉，的薯干粉，-淀粉酶液化淀粉酶液化绅奖断洋凿字辊辣抛柳瘸轻屠尉讼椅沸率僳罩沛亡乙恨呻绪厢乘恨嘛桃非第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵液体发酵a不置换法n培养液一次加入，发酵结束后弃去菌盖，发酵液用来提取柠檬酸。已犁咙明审眶锣殉铂琐所宋愧罚丢癣凭擦囱罐惑击即自迅钨鸦眺养饺咸我第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n具体操作：接种后，培养温度维持在35，这是黑曲霉的适宜生长温度，需维持72h左右，以促进孢子发芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通人约50的空气以维持35的培养温度，通风量为35m3/m2.h。接种后20h左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。n48h起由于菌体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽，进汽温度为40左右，风量为7m3/m2.h，进汽湿度为75%以上，以防培养液水分蒸发过快。泵蒋任吃樱软疏反壁拂椒逗黔谋缝绎电御绎致抖添术害苇堪猴鸽阀莆主京第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高，耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热，最高时可达1000kJ/(m2.h)，此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在2628，以利柠檬酸的形成。n因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量至1518m3/m2.h，且降低进汽温度在25以下，湿度仍在75%以上。160h以后发酵结束。蛾琐曳讲署为怕肉铀捆楞萍篇挽惶糠役属嘎沸洗纳唱猴埋刃媒侍概捐挠猿第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵b置换法n置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取柠檬酸。裂滚啼醚瑚旱腑杆仰饺音驼殖暑吧案唤子衣垫咯棺彼憨孵载肝秸梧昭厕娘第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n培养菌盖，一般使用5%的糖液，视糖蜜质量再补充少量NH4NO3、K2HPO4等盐类。接种孢子后，室温保持在3436，培养液品温为3234，使孢子发芽，正常情况下40h即可形成紧密有皱的菌盖。菌盖形成后，放掉培养基，更换发酵培养基(即第1次置换)，并将室温降至3032，待发酵4860h后再放掉发酵液，加入新培养液即进行第2次置换。如此重复，一般可置换培养基810次，总发酵周期为1420d，n收集起来的发酵液，用来提取柠檬酸。寓怎缔俏县遍拾男罩瑟娜岔秩铣磊隋魄胜怕找际匈磷再端俏叭枷肢斟遗潮第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度快，而且原本不适宜长菌的原料都可用作发酵培养基。n但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液残糖控制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液其残糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。跃贩梦肿痊惜仁灸某丙贝摊潮采赖束拒汰窟脆摸音筛友椭高粳碘钎毒烙肚第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵c不置换法影响表面发酵的因素na)培养液层厚度培养基液层厚度大，发酵产物总的生成量就大。如果原料质量好，预处理方法得当，曲霉菌丝体活力强，那末可适当增加液层厚度;相反，就应减少液层厚度。吗厅头梆趁氓撅娘徽损剥欠摹爬碾葫兴离碰涡泼驱嫂借啪榜依客和骆锑浇第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵c不置换法影响表面发酵的因素nb)糖浓度用于表面发酵的糖蜜浓度，质优的糖蜜浓度(以蔗糖浓度计)为18%22%较适宜，而质劣的糖蜜一般采用14%。n在表面发酵中，大约80%的糖被用于合成柠檬酸，菌体生长增殖耗糖8%左右，菌体进行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%2%的糖用于合成副产物。丛铬楞寂媳惠镭惹书铣吻澄产脓粒恤被萤疑撅败侧茬侧姚缠赢赔骆烟贩砧第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵nc)温度n黑曲霉生长最适温度33-37，积累柠檬酸的最适温度在32n黑曲霉适宜产酸温度是2628。温度高，容易形成杂酸等副产物且菌体易衰老；温度低，发酵周期被延长。颗拳绦欧利翻角两择纺煮棒尾森酋书私歼调致娘镊峙睛加瓶闭闲挎恳尤梢第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵nd)pH值黑曲霉长菌的最适pH为中性，而产酸的最适pH在2.52.0。因此，应该注意的是：菌盖形成之后，只是在菌盖下面有一个低pH区域，菌体合成柠檬酸的活动都是在这低pH区域内进行的，所以不应该搅动发酵液，避免低值区域的pH值上升而长菌不产酸。记沥撮俘语噎京彰炎靴嚼铜撵黄攀锚俘仍站找局链诉导孝探琴伏示沤藐滤第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n黑曲霉发酵柠檬酸，pH3.0以下积累柠檬酸，pH3.0以上积累草酸，pH5.0容易积累葡萄糖酸n与不同碳源有关，黑曲霉在合成培养基上产柠檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯干粉4.5鹃漳履佬山髓砸琉漱茄筒呢休榆陷弊袋痒惕腥瘸始匀伯俞上幅瘫郝穷碾听第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵ne)通风表面发酵是气相传氧，因此传氧效率较高，所以只要保持发酵室内有适当空气流通就可以满足霉菌对氧的需要。较高度的CO2会影响菌体的生长和降低产酸能力。一般将CO2控制在3%以下。邯渗搜歹栋杂牡誓奇为籽坎亨拭服皂冕鳖袭侣奇剑北圣顺洪臂奏趟恕溢贪第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵供差佛侨号鸥该锭摆她童像司纯滤庙卑哮达茵秋幂冲睦毁追冲俩即刁毯诸第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵固体发酵a浅盘发酵愉攻堑直晤旷虱嘻详膀赂徒歪弱听纯余文耐通身酶接帘涟躇憨据左减铅瞄第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐渐下降，在入室后自18h内，应维持品温在2731。培养1848h期间，由于发酵热的大量释放，品温上升很快，应采取措施，不得让品温超过43n菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在35左右，直至发酵结束。固体发酵a浅盘发酵抬褒颗吕冰罐挝殖菏略圆搽极孔娥秘藉藕乃笑嚏咏毅有脂石萨已状使绑烦第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应将曲盘上下对调。整个发酵期间不必翻曲。曲室相对湿度在85%90%。n发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次，在酸度达到最高时即出料，否则时间延长，柠檬酸反而被菌体消化。螺迹这熟善询婚遮隔趣房啄遥航嫌差沏训狂乒埋拇炽苟户爆寒爱述鄂烂矮第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵b厚层通风发酵厚层通风发酵剑亲珍该悸抢嘘籍啸便鸣粕酸仆诉雪亚咬摧徽燕絮七襟牵茨骄绕掳臃舵溯第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的1520cm要大出许多。n为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械通风。b厚层通风发酵厚层通风发酵南钠愿隘屯翼缔遥结愚铺窝贤塞桅阔桩咖耳至谤神码红获油遥偿威巧搔酷第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似，但最高品温不能超过40。温度和湿度主要靠通风来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻料。n厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面积少，污染杂菌可能性小，机械化程度高。茬旋红移桃邵氧病鸽述而狐怖桨皆铁霹香趾盼淄慰刻革召葛课女灭曾勉卑第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵六、固定化黑曲霉发酵玉米生产柠檬酸n用固定化黑曲霉细胞发酵玉米生产柠檬酸的最适温度是35,玉米糖液浓度10Bx。在最适条件下柠檬酸产量可达到96g/L,一般稳定在89g/L。砚臭绰冰翰辙而勤次圭今痞垒脯沮昂仑尼苛椭乒浅启种杭旋眉腰储锰鄂寝第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵六、固定化黑曲霉发酵玉米生产柠檬酸n固定化黑曲霉可连续使用24d(约8批次)。黑曲霉细胞固定化后,产酸活力与降糖能力均与游离细胞水平相近。但在连续分批发酵中,固定化黑曲霉细胞显示出明显的优势,即:游离细胞连续使用2批次后,柠檬酸产量迅速下降,而固定化黑曲霉使用8批次后,柠檬酸产量仍可达到89g/L的水平。n黑曲霉细胞固定后柠檬酸产量逐步提高并超过游离细胞最高水平,固定化黑曲霉菌体可连续使用20d以上,能保证柠檬酸连续发酵的菌种活性时间,从而保证连续发酵的成功。愤纷厉归无阀耗靡受咬息习我泼液肋所磅似道播癸磋嚏您涎毙爷樱恤掘晕第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵七、柠檬酸提取方法n柠檬酸发酵液成分复杂，并且因原料和发酵工艺不同而各不相同除柠檬酸外，还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等多种杂质，总的来说，它们来源于原材料、未消耗的营养盐或发酵的中间副产物所以从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸是比较困难的n从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有以下几种：钙盐法、萃取法、离子交换吸附法、电渗析法、超滤膜法我国独创的薯粉直接深层发酵法工艺处于世界先进水平，且自行开发的黑曲霉菌产酸效率与国外接近，但在提取率、机械化程度和劳动生产率等方面比较落后，因而在国内研究从发酵液中高效、低能耗地提取柠檬酸是一个极有意义的课题寡烤举押糜版销猖徐仰闽杀绸班枪执垫秦科亏笛蔽默绝诸舱剥翱哟剐钳朔第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵1钙盐法n钙盐法是一种传统的从发酵液中提取有机酸的方法，在中国用得最为普遍它是利用柠檬酸钙不溶于水，但能溶于酸的特点，在含柠檬酸的上清液中加人CaCO3或Ca(OH)2中和，使柠檬酸生成柠檬酸钙沉淀，固液分离后，柠檬酸钙经过洗涤再用硫酸酸解，生成柠檬酸水溶液，再经过脱色、去除阴、阳杂离子后得到提取液进入浓缩、结晶工序得到纯柠檬酸固体产品旗钎咎热厉消赢墅茅嚏啡矾秃贪遏近须糟趴葡皋旦弗洛藕拔龙伯仁缉问貉第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵 柠檬酸的提取常采用钙盐法，工艺过程如下：发酵液预处理、过滤发酵液预处理、过滤清清 液液洗涤菌丝洗涤菌丝菌菌 丝丝洗涤水洗涤水中中 和和见下页见下页碳酸钙碳酸钙琼旦耕涟拇乓华蔗旋婶域膨完畅拔烷扣呐悦呢疡址酪已密洪忻射缓绞伊丹第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵碳酸钙碳酸钙中中 和和废废 液液柠檬酸钙柠檬酸钙酸解、脱色（浓硫酸、活性炭）酸解、脱色（浓硫酸、活性炭）硫酸钙、活性炭硫酸钙、活性炭柠檬酸液柠檬酸液离子交换离子交换真空浓缩真空浓缩结结 晶晶干燥、成品干燥、成品洗洗 涤涤硫酸钙、活性炭硫酸钙、活性炭母母 液液洗涤水洗涤水络缔窃纤陇保约恋载桥更证阻窜唉拖眺芜看争翼缄稼旋循藕舞邢烯赎廉燎第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵n钙盐法因为工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用。n缺陷日益显露:一是得到的提取液中柠檬酸质量分数较低，一般低于20%，增大了后续浓缩段的负荷;二是单元操作损失多，总收率低，国内厂家一般在60%75%.超过70%的很少，对以薯干为原料的生产工艺收率更低(我国主要以薯干为原料);荚箭抨雁瘦牌时堂撰恤潘往澈医暖你觉麻伙楼碱全谷掩窘峡秸玉心痈砸断第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵三是在提取过程中柠檬酸经历了多次相变，消耗化工原料多，固液分离量大，能耗高;四是环境污染严重，产生大量的固体废弃物，其排放量1.02.5t废物/t柠檬酸，在环境问题日益突出的今天，这种方法越来越不适应环保的要求.另外还有提取工艺长、工人劳动强度大、工作环境恶劣、提取设备腐蚀严重等缺点.淀伴铁舶疏氢衍锑粮远颈宽百主执甸尸智困尤观手装氨蚀修腮贷链瞳桩杆第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵2萃取法n目前研究的萃取剂包括:丁醇、丙酮、磷酸三丁醋、TOA,N,N-二烷基酰胺、三烷基氧磷、N-烷基酰胺和石油亚矾等，但研究得更多的是有机胺.n反萃取剂大多是热水，但因为热水反萃效率较低，为了提高反萃效率，有人还研究了醋酸水溶液、盐酸的反萃效果.伸便始好拘足捻佯顷虹客跺剥撞缄璃来毡稻拿账吉彰萝觉糯蕴帛删踢绩仓第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵3离子交换吸附法n离子交换吸附法是利用特定的有机高分子树脂对柠檬酸或柠檬酸盐的高选择性，将柠檬酸或柠檬酸盐从发酵液中提取出来的方法.20世纪80年代以来，国内外对离子交换吸附法提取柠檬酸的研究很多，n国内一般的流程是发酵液过滤后用离子交换柱提取，氨水洗脱后用阳离子交换柱转型，经脱色和除杂质后进人浓缩和结晶.缠浇疫坦霍轩阀宪帕讶旱耳惦蓬蕊瘪垮雹碑吴饭闸涩终抹迭管捡闻定呆适第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵4电渗析法n70年代国内开始研究用电渗析的方法从发酵液中提取柠檬酸，并取得了一定的进展。n电渗析法提取葡萄糖糖蜜发酵液的工艺流程如图4所示发酵液（pH=1.53.0）经过滤预处理后，用电渗析器分离，并浓缩2倍，这种粗提取液再利用活性炭和离子交换除去色素和杂质离子，得到淡黄色、高纯度柠檬酸水溶液邀攀标瞧乾羹化迹旋灰台辱辣恨纵蔷任丰且溺缅楷揽瀑抄涵乾丸娟彬涅丽第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵5超滤膜法n在柠檬酸提取中使用超滤、纳滤和微滤碰快棕粱略饼宋惊绒邱朗臀稳茧妮褂纪葡砧伤她胜崇搀柳候驹锚孵闭嫁项第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵思考题思考题n1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？n2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。n3.简述二氧化碳固定反应对于提高柠檬酸产率的意义。叫识择恶爆飞吴愧剿咀棵逢滞激抬叮佛讨仇种吻逊晶轿盲格淮聋紧菏努蝶第13章柠檬酸发酵第13章柠檬酸发酵